劉美艷+王景景+謝逸萍+張健

摘要：以高抗甘薯黑斑病品種南京-92塊根為材料，從染菌6 d的甘薯塊根中得到粗酶液；經(jīng)熱變性、硫酸銨分級(jí)沉淀后，采用高流速二乙基氨基瓊脂糖交換劑 （DEAE Sepharose Fast Flow）陰離子交換層析，分離出3個(gè)蛋白峰，活性檢測(cè)可知峰2為活性峰；將峰2經(jīng)葡聚糖凝膠G - 75（SephadexG-75）凝膠層析純化后得到4個(gè)蛋白峰；將具有幾丁質(zhì)酶活性的峰2經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），凝膠上顯示2條蛋白條帶，分別割膠純化測(cè)定活性，然后將有活性的條帶進(jìn)行10%、12% PAGE電泳，均顯示為單一條帶；本試驗(yàn)分離純化過(guò)程中得到了電泳純級(jí)的幾丁質(zhì)酶，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘薯；黑斑??；幾丁質(zhì)酶；分離；純化

中圖分類號(hào)： S435.313+.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0186-03

收稿日期：2016-03-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系協(xié)作課題（編號(hào)：CARS-11-B-09-A）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：劉美艷（1969—），女，江蘇徐州人，碩士，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：liumeiyan@jsnu.edu.cn。

通信作者：張 健，碩士，副教授，主要從事植物生理學(xué)方面的教學(xué)與科研工作。E-mail：zhangjian@jsnu.edu.cn。 甘薯（Iomoea batatas Lam）別稱番薯、紅薯、山芋等，屬旋花科甘薯屬。甘薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，我國(guó)的種植面積占世界種植面積的一半以上。甘薯黑斑病是由子囊菌亞門長(zhǎng)喙殼菌屬（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）侵染引起的真菌病害，是嚴(yán)重危害甘薯生產(chǎn)的主要病害，產(chǎn)量損失高達(dá) 20%～50%[1]。黑斑病的侵染能力極強(qiáng)，病菌通過(guò)破壞細(xì)胞壁，侵入甘薯細(xì)胞，在甘薯的幼苗生長(zhǎng)階段和地窖儲(chǔ)藏階段均能使甘薯染病[2]。黑斑病的預(yù)防和控制已成為甘薯種植和儲(chǔ)藏研究中的重要任務(wù)之一。目前對(duì)甘薯抗黑斑病的研究主要集中在篩選抗病品種和雜交育種方面，對(duì)甘薯抗黑斑病機(jī)制方面的研究較少[3-4]。幾丁質(zhì)酶是廣泛存在于微生物和植物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，能水解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，從而抑制真菌的生長(zhǎng)增殖，提高植物的抗真菌能力，是一類重要的病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，簡(jiǎn)稱PP）[5-6]。本試驗(yàn)的前期工作表明，甘薯塊根幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，核黃素、脫乙酰幾丁質(zhì)、黑斑病菌處理均能誘導(dǎo)甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性的提高，甘薯幾丁質(zhì)酶與甘薯抗黑斑病有著密切的關(guān)系[7]。因此，本試驗(yàn)分離純化幾丁質(zhì)酶、探究甘薯幾丁質(zhì)酶的生理特性，以期從病程相關(guān)蛋白角度探究甘薯對(duì)黑斑病的抗性機(jī)制，同時(shí)也能為甘薯幾丁質(zhì)酶進(jìn)行末端測(cè)序、克隆甘薯幾丁質(zhì)酶基因做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 供試材料及薯塊染菌處理

供試甘薯品種南京-92（高抗黑斑病），甘薯黑斑病病原物由江蘇徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國(guó)甘薯研究中心提供。黑斑病菌懸浮液的制備按照王景景等的方法[4]進(jìn)行。選取正常無(wú)病斑薯塊，用自來(lái)水沖洗干凈，晾干。將塊根切成1.5 cm厚度的圓片，將0.1 mL黑斑病菌內(nèi)分生孢子接種于塊根圓片的表面，放置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，以蒸餾水處理的切傷塊根圓片為傷害對(duì)照組。

1.2 幾丁質(zhì)酶的提取和活力測(cè)定

去除甘薯外表層，切成小塊，并迅速將其浸泡于 0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH值5.5）中，甘薯質(zhì)量和緩沖液的比例為1 ∶ 1（質(zhì)量濃度），用組織搗碎機(jī)將甘薯磨碎，4層紗布過(guò)濾，濾液4 ℃、8 000 r/min、離心15 min，上清即為幾丁質(zhì)酶粗酶液。膠體幾丁質(zhì)的制備按照李世貴等的方法[8]進(jìn)行。3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液的配制按照李合生的方法[9]進(jìn)行。幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定參照Boller等的方法[10]進(jìn)行。以1 h分解膠體產(chǎn)生1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活性單位（U/mL）。

1.3 甘薯幾丁質(zhì)酶的純化過(guò)程

從染菌6 d的1 000 g甘薯塊中得粗酶液800 mL，50 ℃水浴中熱變性30 min，10 000 r/min冷凍離心10 min；于上清液中加入硫酸銨使溶液達(dá)到20%飽和度，4 ℃下放置24 h，10 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清，加入硫酸銨使溶液達(dá)到60 %飽和度，4 ℃下放置24 h，10 000 r/ min 冷凍離心 10 min，保留沉淀，加入少量緩沖液，搖勻；透析脫鹽；將透析脫鹽后的酶液依次經(jīng)高流速二乙基氨基瓊脂糖交換劑 （DEAE Sepharose Fast Flow）陰離子交換層析，葡聚糖凝膠G-75（Sephadex G - 75）凝膠過(guò)濾，分別收集洗脫峰，檢測(cè)其活性，并將具有幾丁質(zhì)酶活性的洗脫峰進(jìn)行超濾濃縮；之后將純化濃縮的樣品經(jīng)不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE，分離膠濃度5%，濃縮膠濃度12%），經(jīng)染色后切取電泳膠上的蛋白條帶，將這些蛋白條帶浸泡在1.0 mL pH值為7.9的 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液中，盡量搗碎，4 ℃浸泡36 h，離心取上清，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性；最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)純度幾丁質(zhì)酶。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化過(guò)程中甘薯幾丁質(zhì)酶活性的變化

對(duì)分離純化過(guò)程每一個(gè)階段的甘薯幾丁質(zhì)酶的活性進(jìn)行比較。可以看出，隨著分離純化過(guò)程的深入，甘薯幾丁質(zhì)酶的活性不斷升高，表明甘薯幾丁質(zhì)酶逐步得到純化（表1）。

2.2 DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)果endprint

DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析洗脫曲線結(jié)果如圖1所示，可以看出共分離出3個(gè)蛋白峰，活性檢測(cè)可知峰2為活性峰，收集該峰，透析、超濾、離心濃縮。

取具有幾丁質(zhì)酶活力的峰2濃縮樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖2，酶液得到初步純化。

2.3 Sephadex G-75凝膠層析結(jié)果

將DEAE Sepharose Fast Flow得到的活性峰2經(jīng) Sephadex G-75凝膠層析純化后得到4個(gè)蛋白峰（圖3），活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)峰2具有幾丁質(zhì)酶活性。

取具有幾丁質(zhì)酶活力的峰2濃縮樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖4，酶液得到進(jìn)一步純化。

2.4 割膠純化PAGE結(jié)果

將經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析純化后的樣品進(jìn)行10%、12% PAGE，由圖5、圖6的泳道1可見(jiàn)，在12%、10%PAGE膠上都呈現(xiàn)2條蛋白條帶。將上下2條蛋白條帶分別割取純化后，測(cè)定活性，結(jié)果顯示下面蛋白條帶有幾丁質(zhì)酶活性。將有活性的條帶進(jìn)行12%、10%PAGE電泳，圖5、圖6的泳道2顯示12%、10% PAGE均為單一條帶。由此可以得出，經(jīng)電泳制備得到了電泳純級(jí)的甘薯幾丁質(zhì)酶單一組分。

3 結(jié)論與討論

目前，生產(chǎn)上控制甘薯黑斑病的主要方法以藥物防治為主，但農(nóng)藥殘留會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染及食品安全問(wèn)題[11-12]。因此培育和栽培抗性品種是最經(jīng)濟(jì)有效的方法。前期利用黑斑病菌對(duì)不同抗性品種甘薯幾丁質(zhì)酶進(jìn)行誘導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果表明，甘薯幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，高抗品種甘薯塊內(nèi)的幾丁質(zhì)酶比高感品種積累的量多，2個(gè)品種幾丁質(zhì)酶活性最大時(shí)達(dá)到極顯著差異，這與前人的研究結(jié)果[7，13]一致。說(shuō)明甘薯幾丁質(zhì)酶與甘薯抗黑斑病有著密切的關(guān)系，幾丁質(zhì)酶對(duì)甘薯抵抗黑斑病的侵染具有重要作用。

植物細(xì)胞壁不含幾丁質(zhì)，植物的幾丁質(zhì)酶通過(guò)水解真菌的菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)以抵御病原菌侵染，因此幾丁質(zhì)酶被普遍認(rèn)為是一種與抗病有關(guān)的酶[14]。作為一種誘導(dǎo)型表達(dá)的病程相關(guān)蛋白，幾丁質(zhì)酶已經(jīng)在一些植物上表現(xiàn)出抗真菌活性[15-16]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，許多植物幾丁質(zhì)酶已被克隆并被成功轉(zhuǎn)化，過(guò)表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因植株擁有更強(qiáng)的抵御病原體入侵的能力，幾丁質(zhì)酶能在抵御病原菌侵染中發(fā)揮重要的作用[17-19]。本試驗(yàn)首次從甘薯塊根內(nèi)純化得到1種幾丁質(zhì)酶，為后續(xù)開展甘薯幾丁質(zhì)酶性質(zhì)、功能鑒定及甘薯抗黑斑病基因工程的研究奠定了基礎(chǔ)。

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