平華，李楊，李冰茹，何昭穎，劉繼培，馬智宏

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基于分散固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法同時測定蔬菜中多種除草劑殘留的方法

平華1,2，李楊1，李冰茹1，何昭穎1，劉繼培3，馬智宏1

（1北京市農林科學院北京農業(yè)質量標準與檢測技術研究中心，北京100097；2沈陽農業(yè)大學信息與電氣工程學院，沈陽110866；3北京市大興區(qū)土肥工作站，北京102600）

研究吸附填料不同添加量對除草劑回收率的影響，以建立蔬菜中24種除草劑殘留的分散固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）檢測方法。蔬菜樣品加入乙腈振蕩提取，將凈化填料N-丙基乙二胺（PSA）（不同添加量0.05 g、0.10 g、0.20 g）加入提取液中凈化。采用UPLC-MS/MS測定，對液相色譜柱、流動相條件和質譜條件（錐孔電壓、碰撞能量）進行優(yōu)化，電噴霧電離，多反應監(jiān)測模式檢測。以0.1%的甲酸水-乙腈為流動相進行梯度洗脫，各化合物峰形尖銳，靈敏度高，UPLC-MS/MS上機10 min內完成了24種除草劑的檢測。添加0.10 g和0.20 g PSA時，三氟羧草醚、2,4-滴、唑嘧磺草胺、噻吩磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆6種除草劑回收率明顯降低；其余除草劑隨著PSA添加量的增加回收率沒有明顯的變化，在75.5%—114.7%之間；吸附填料PSA添加量為0.05 g時，24種除草劑回收率為65.6%—114.7%。24種除草劑在1.0—250 μg·L-1質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.9946—0.9998。蔬菜中24種除草劑的方法檢出限在1.2—160.8 μg·kg-1，定量限在4.0—536.0 μg·kg-1，可以滿足定量分析的要求。在空白蔬菜樣品中添加50、100、200 μg·kg-13個質量分數的24種除草劑的混合標準溶液，24種除草劑的回收率在66.5%—116%，相對標準偏差在2.3%—9.7%。采用建立的測定方法，對38份蔬菜樣本進行檢測發(fā)現，所有蔬菜樣品中僅檢出阿特拉津殘留，檢出率為57.9%，檢出范圍為未檢出—0.84 μg·kg-1，其余23種除草劑均未檢出。該方法簡便、快速、節(jié)省溶劑、靈敏度高，可用于大批量蔬菜中除草劑殘留快速檢測。

超高效液相色譜串聯質譜法；蔬菜；除草劑；分散固相萃取

0 引言

【研究意義】目前世界上除草劑品種超過300個，每年有效成分總產量70×104—80×104t，占化學農藥總產量的40%—50%[1]。隨著中國農業(yè)栽培耕作方式趨向于規(guī)?；图s化發(fā)展，除草劑的使用量日漸增大，其銷售總額已超過殺蟲劑和殺菌劑，成為第一大類農藥[2]。除草劑在使用后，大部分被吸附在土壤中，除了被雜草吸收外，還會被種植的農作物吸收，一旦進入食物鏈，會對人類健康造成危害。許多國家都開始制定除草劑殘留限量，美國環(huán)保署規(guī)定大多數產品中三嗪類除草劑的最大殘留限量為0.25 mg·kg-1，歐盟規(guī)定特丁津在蔬菜中最大殘留限量為0.05 mg·kg-1[3]。中國食品中農藥殘留限量標準GB 2763—2016《食品中農藥最大殘留限量》中有關除草劑在蔬菜中的最低殘留限量為 0.05 mg·kg-1。因此，需要建立蔬菜中除草劑快速提取、分離及測定方法?！厩叭搜芯窟M展】目前蔬菜中除草劑常用的凈化方法有固相萃取、固相微萃取、凝膠滲透色譜和分散固相萃取法[4-8]等，其中分散固相萃取法快速、操作簡便，是目前廣泛使用的前處理方法[9]。常用的檢測方法有氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11-12]、氣相色譜-質譜聯用法[13]和液相色譜-質譜聯用法[14-15]、酶聯免疫法[16]等。近年來發(fā)展起來的超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）具有比傳統(tǒng)方法快5—10倍的優(yōu)勢，可以根據待測物的性質選擇不同的離子化模式，檢測不同化學性質的除草劑，有廣闊的應用前景[17-20]?！颈狙芯壳腥朦c】目前檢測方法多為針對三嗪類、磺酰脲類、苯脲類等某一種類型的除草劑，考慮到不同類型除草劑之間的聯合毒性效應，本研究擬對目前使用量較大的三嗪類、酰胺類、磺酰脲類、二苯醚類等7種不同類型的24種除草劑進行同時測定。【擬解決的關鍵問題】研究不同凈化填料及不同添加量對蔬菜提取液凈化效果，以簡化樣品前處理過程；研究不同類型色譜柱、不同流動相、不同質譜條件對24種除草劑分離效果及靈敏度的影響，以提高定量的準確性。將分散固相萃取法與UPLC-MS/MS技術相結合，以提高檢測效率，實現節(jié)省溶劑，保護檢測人員健康和環(huán)境的目的，為大批量樣品的檢測提供簡便、快速、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Xevo TQ三重四極桿質譜儀，配有ESI電離源（Waters公司）；3K30高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；純水機（美國Pall公司）；R-200旋轉蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）；0.2 μm微孔過濾膜（美國Gelman Laboratory公司）；乙腈（HPLC級，美國Fisher公司）；36%鹽酸（優(yōu)級純，北京化工廠）；無水硫酸鎂（分析純，北京化工廠），使用前馬弗爐500℃加熱5 h，冷卻后放入干燥器備用；鍵合硅固相萃取吸附劑C18填料（日本YMC公司）；N-丙基乙二胺（PSA）吸附劑填料（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

阿特拉津、西瑪津、草凈津、密草通、敵草凈、另丁津、西草凈、撲草凈、撲滅通、撲滅津、莠滅凈、特丁津、特丁凈、異丙甲草胺、乙草胺、噻吩磺隆、三氟羧草醚、烯草酮、苯磺隆、唑嘧磺草胺、異噁草松、氯嘧磺隆、2,4-滴和氟磺胺草醚24種除草劑標準品（純度均大于98%，農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）。將24種除草劑標準品配成混合標準儲備液，實驗時用初始流動相配成不同質量濃度的標準工作液。

1.2 前處理方法

蔬菜樣品勻漿，精確稱取5.0 g樣品，加入乙腈溶液10.0 mL，振蕩30 min，再加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4℃離心3 min（5 000 r/min）。精確吸取1.0 mL上清液至離心管中，加入0.05 g PSA粉末，振蕩1 min，4℃離心3 min（5 000 r/min），取0.5 mL上清液，加入乙腈﹕水（1﹕1）0.5 mL，混勻后過0.2 μm濾膜，UPLC-MS/MS測定。

實驗中對PSA、C18兩種不同的凈化方法分別進行了優(yōu)化，在上清液中分別加入0.05 g PSA和0.05 g C18比較其凈化效果，選出合適的凈化填料；然后分別在上清液中添加0.05 g、0.10 g和0.20 g PSA，比較PSA不同添加量的凈化效果，最終采用上述優(yōu)化后的方法。

1.3 分析條件

1.3.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；色譜柱溫：40℃；樣品室溫度：10℃；進樣體積：5 μL；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸水，流速為0.3 mL·min-1；梯度洗脫條件：0—0.25 min，10%—30% A；0.25—7.0 min，30%—70% A；7.0—8.0 min，70%—95% A；8.0—10.0 min，10% A。

采用HSS T3 C18、BEH C18兩種不同的色譜柱分別進行實驗，比較24種除草劑在色譜柱上的峰形、分離效果及響應值，以選擇一個適宜的色譜柱。對流動相條件進行優(yōu)化，在流動相B（水相）中分別添加0.05%、0.1%、0.2% 3種不同比例甲酸時，對比24種除草劑的峰形、分離度和靈敏度，選擇一個合適的甲酸添加比例，最終采用上述優(yōu)化后的條件。

1.3.2 質譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子和負離子模式；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；毛細管電壓：1.0 kV（正離子模式，ESI+）；1.0 kV（負離子模式，ESI-）；霧化氣溫度：400℃；去溶劑氣流量：800 L·h-1；碰撞氣流量：0.15 mL·min-1；離子源溫度：150℃。

采用24種除草劑的混合標準溶液優(yōu)化質譜條件。根據化合物的性質，采用ESI+或ESI-掃描模式進行一級質譜分析，分別選擇準分子離子[M+H]+或[M-H]-為母離子，優(yōu)化了24種除草劑的錐孔電壓（2—80 V），選擇每個化合物母離子響應值最高時的電壓為最佳錐孔電壓；然后優(yōu)化了24種除草劑二級質譜的碰撞電壓（2—80 eV），選擇每個化合物的兩個碎片離子響應值最高時的電壓為最佳碰撞電壓，兩個碎片離子響應值最大的為定量離子，反之為定性離子。

1.4 實際蔬菜樣品的測定

為了驗證該方法的適用性，在北京昌平區(qū)、順義區(qū)蔬菜大棚分別采集了黃瓜、小白菜、蒿子桿、尖椒、西紅柿、茄子、豆角、韭菜、洋蔥等38份蔬菜樣本，采用上述優(yōu)化好的方法對蔬菜中24種除草劑的殘留情況進行了測定。葉菜類：小白菜、蒿子桿、韭菜、大白菜、芥菜、生菜、油菜、圓白菜；茄果類：茄子、辣椒、西紅柿、圣女果；瓜類：黃瓜、苦瓜；豆類：豆角、豇豆；鱗莖類：蔥頭。計算不同類型蔬菜中除草劑檢出率，分析比較了不同類型蔬菜中除草劑殘留量大小。

2 結果

2.1 凈化方法的選擇

C18、PSA為分散固相萃取中常用的凈化填料，具有簡便、快速、凈化效率高等特點[21]。試驗對比了0.05 gPSA和0.05 g C18凈化效果，發(fā)現提取液用PSA凈化后回收率平均值為94.6%，C18凈化后回收率平均值為76.6%，PSA凈化效果優(yōu)于C18，因此選擇PSA為凈化填料。隨后比較了PSA不同添加量的凈化效果，添加0.05 g、0.10 g和0.20 g PSA時，三氟羧草醚、2,4-滴、唑嘧磺草胺、噻吩磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆6種除草劑的回收率分別在65.6%—100.8%、43.7%—79.7%和24.3%—61.6%；其余18除草劑隨著PSA添加量的增加回收率沒有明顯的變化，均在75.5%—114.7%。PSA添加量為0.05 g時24種除草劑回收率在65.6%—114.7%。因此，最終選擇上清液中加入0.05 g PSA進行凈化，實現去除雜質的同時對目標化合物不造成影響（圖1）。

2.2 色譜條件的選擇

由于24種除草劑性質各不相同，分屬于7種不同類型，為獲得好的峰形和分離效果需要對色譜條件進行優(yōu)化。對比了24種除草劑在HSS T3 C18、BEH C18色譜柱上的峰形和分離效果，發(fā)現莠滅凈、特丁凈、乙草胺在BEH C18色譜柱上峰形較差，拖尾嚴重，而24種除草劑在HSS T3 C18色譜柱上峰形、分離度及響應值均優(yōu)于BEH C18色譜柱，與文獻相符[22]。同時考查了水相中添加不同比例甲酸（0.05%、0.1%、0.2%）對各化合物分離度和靈敏度的影響。結果表明，甲酸的加入有利于目標化合物離子化，提高靈敏度。其中加入0.1%甲酸時，各個化合物峰形好，響應值相對較高。因此最終選擇HSS T3 C18色譜柱、0.1%的甲酸水-乙腈為流動相，進行梯度洗脫，10 min內完成了24種除草劑的檢測，分離度良好，峰形尖銳，靈敏度高。各個化合物總離子流見圖2。

1.西瑪津, 2.西草凈, 3.敵草凈, 4.阿特拉津, 5.密草通, 6.撲滅通, 7.莠滅凈, 8.另丁津, 9.特丁津, 10.撲滅津, 11.異噁草松, 12.草凈津, 13.特丁凈, 14.撲草凈 15.乙草胺,16.異丙甲草胺, 17.烯草酮, 18.氟磺胺草醚, 19.唑嘧磺草胺, 20.噻吩磺隆, 21.苯磺隆, 22.氯嘧磺隆, 23. 2,4-滴, 24.三氟羧草醚

2.3 質譜方法的選擇

由于24種除草劑化學結構不同，電離方式也不同，分別選用正離子和負離子模式掃描。分別優(yōu)化了錐孔電壓和碰撞能量，使每種除草劑的母離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大，將響應值最大的碎片離子設定為定量離子，次級響應離子為定性離子。24種除草劑的質譜參數見表1。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

用初始流動相配制1.0—250 μg·L-1系列質量濃度混合標準溶液，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，24種除草劑在1.0—250 μg·L-1質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數在0.9946—0.9998，可以滿足定量分析的要求。以3倍信噪比計算，蔬菜中24種除草劑的方法檢出限（LOD）在1.2—160.8 μg·kg-1；以10倍信噪比計算，蔬菜中24種除草劑的定量限（LOQ）在4.0—536.0 μg·kg-1（表2）。

2.5 加標回收試驗

在空白蔬菜樣品中添加50、100、200 μg·kg-13個質量分數的24種除草劑的混合標準溶液，按照上述優(yōu)化的實驗方法進行加標回收率實驗，每個添加水平重復測定3次。結果表明，24種除草劑的回收率在66.5%—116%（表3）。

2.6 實際蔬菜樣品的測定

按照優(yōu)化的方法，對采集的38份蔬菜樣本，包括黃瓜、小白菜、蒿子桿、尖椒、西紅柿、茄子、豆角、韭菜、洋蔥等蔬菜中24種除草劑的殘留情況進行了測定。所有蔬菜樣品中僅檢出阿特拉津殘留，檢出22次，檢出率57.9%，檢出范圍為未檢出—0.84 μg·kg-1（表4），其余23種除草劑均未檢出。阿特拉津平均殘留量：葉菜類＞瓜類＞豆類＞茄果類＞鱗莖類。檢出量相對較高的蔬菜品種為蒿子桿、韭菜、小白菜，均為葉菜類蔬菜（圖3）。

圖2 24種除草劑總離子流色譜圖

1.小白菜, 2.蒿子桿, 3.韭菜, 4.韭菜, 5.韭菜, 6.黃瓜, 7.辣椒, 8.黃瓜, 9.水果黃瓜, 10.豇豆, 11.辣椒, 12.辣椒, 13.黃瓜, 14.苦瓜, 15.豆角, 16.大白菜, 17.辣椒, 18.辣椒, 19.茄子, 20.西紅柿, 21.圓白菜, 22.茄子, 23.大白菜, 24.圓白菜, 25.生菜, 26.生菜, 27.芥菜, 28.油菜, 29.茄子, 30.茄子, 31.茄子, 32.圣女果, 33.西紅柿, 34.黃瓜, 35.豇豆, 36.豆角, 37.蔥頭, 38.蔥頭

表1 24種除草劑的質譜分析參數

*代表定量離子* Represents quantitative ions in the table

3 討論

分散固相萃取法是美國農業(yè)部于2003年提出使用的一種樣品前處理技術，該技術的核心在于將固相萃取吸附劑分散到樣品萃取液中吸附干擾物，保留目標化合物，避免了傳統(tǒng)固相萃取法提取液因淋洗、洗脫、濃縮等引起的目標化合物的損失，凈化液可以直接進行色譜分析[23-24]。該方法適用范圍廣，分析物包括高極性、非極性、高酸性和堿性等化合物，還具有溶劑使用量小、污染少、不使用含氯化物溶劑、樣品處理量大的優(yōu)點[25]。常用的吸附填料有PSA、C18、GCB（石墨化炭黑）等，用于除去基質中的色素、脂肪酸、甾醇類、糖類等雜質，吸附劑種類和用量可以根據目標化合物的性質和基質干擾程度進行優(yōu)化。其中，PSA為一種弱陰離子交換劑，同時含有伯胺和仲胺基團，能有效地去除中提取液中的色素、脂肪酸、糖類和其他有機酸等雜質，還可通過氫鍵作用結合一些共提物。周瑤敏等[26]采用PSA作為吸附劑對大米提取液進行凈化，測定了大米中的6種酰胺類除草劑。邱世婷等[27]對比了PSA、C18和GCB對大豆提取液的凈化效果發(fā)現，PSA對雜質的凈化能力遠遠優(yōu)于C18和GCB，基質效應明顯較少。本實驗中對比了PSA、C18的凈化效果，也同樣發(fā)現PSA比C18凈化效果好。

表2 24種除草劑的線性方程、相關系數、方法檢出限與定量限

因此，本實驗選取PSA作為吸附劑。實驗中發(fā)現當PSA添加量增加時，對目標化合物三氟羧草醚、2,4-滴、唑嘧磺草胺、噻吩磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆6種除草劑吸附能力也隨之增加，6種除草劑的回收率隨著PSA添加量的增加而降低。如添加量為0.1 g、0.2 g凈化提取液時，2,4-滴的回收率分別為43.7%、24.3%，隨著PSA添加量的增加回收率明顯降低，與文獻報道的結果相符[22, 28]。Ji等[29]分別對比了PSA不同添加量對三嗪類除草劑回收率的影響，結果發(fā)現PSA加入量為0.05 mg 時，三嗪類除草劑回收率較高，本研究結果與前人研究結果一致。王玉健等[30]采用加入0.05 g PSA凈化提取液，高效液相色譜串聯質譜法測定了果蔬中的阿特拉津、撲草凈、西瑪津、莠滅凈、樸滅津、西草凈6種三嗪類除草劑，檢出限為5.0 μg·kg-1，本試驗中這6種除草劑的檢出限在1.6—3.2 μg·kg-1，低于文獻方法。

表3 加標回收試驗結果

表4 蔬菜樣品中除草劑檢出情況

ND: Not detected

目前除草劑的色譜檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜質譜法、高效液相色譜串聯質譜法等。其中，氣相色譜和液相色譜法僅以保留時間定性，化學性質相近的除草劑無法分開，影響定性定量，且容易出現假陽性結果。氣相色譜質譜和液相色譜串聯質譜法由于檢出限低、靈敏度高、定性定量相對更加準確，在痕量樣品的分析中得到了廣泛應用[31]。近年來隨著超高效液相色譜串聯質譜儀的應用，使得分析速度大大提高，節(jié)省了有機溶劑的使用，與氣相色譜質譜法相比，節(jié)省了4倍以上的分析時間，提高了檢測效率。因此在本實驗中選用了超高效液相色譜串聯質譜法同時測定24種除草劑，10 min即可以完成蔬菜中痕量除草劑的分析，具有快速、靈敏度高、定性定量準確的優(yōu)勢。

4 結論

建立了超高效液相色譜串聯質譜法測定蔬菜中24種除草劑殘留量的方法。采用分散固相萃取法凈化蔬菜提取液，并考察了不同吸附劑的凈化效果，簡化了操作步驟，凈化效果好且回收率符合要求。采用優(yōu)化的超高效液相色譜質譜條件，10 min內即可完成24種除草劑的同時測定。建立的檢測方法具有簡單、快速、節(jié)省溶劑、準確、靈敏度高的特點，適用于大批量蔬菜樣品中除草劑多殘留的檢測，為實際樣品的檢測提供檢測依據。

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（責任編輯 李云霞）

SimultaneousDetermination of Multi Herbicides Residues in Vegetables by Dispersive Solid Phase Extraction and Ultra-high Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

PING Hua1,2, LI Yang1, LI BingRu1, HE ZhaoYing1, LIU JiPei3, MA ZhiHong1

(1Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097;2College of Information and Electrical Engineering, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866;3Soil and Fertilizer Workstation of Daxing Beijing, Beijing 102600)

To study the purification efficiency of different amount of absorption on the recovery of the herbicides, the ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) with dispersive solid phase extraction method was developed for the determination of 24 herbicides in vegetables．The vegetable samples were extracted with acetonitrile and purified by primary-secondary amine (PSA) with different dosage of 0.05 g, 0.10 g and 0.20 g. UPLC-MS/MS method was performed with electrospray ionization (ESI) source under the multiple reaction monitoring (MRM) mode．0.1% formic acid water-acetonitrile was chosen as mobile phase in gradient elution, and the peaks of all the compounds were sharp with high sensitivity under this conditions. 24 kinds of herbicides were detected by UPLC-MS/MS within 10 min. Adding 0.10 g and 0.20 g PSA, the recovery rate of acifluorfen, 2,4-Dicholrophenoxyacetic acid, flumetsulam, thifensulfuron methyl, tribenuron methyl, and chlorimuron ethyl was decreased significantly, and the rest of the herbicides recovery did not change significantly, ranging from 75.5% to 114.7%. When adding 0.05 g PSA, 24 herbicides recovery rate was 65.6%-114.7%. Standards concentration ranged from 1.0 μg·L-1to 250 μg·L-1had a good linear relationship, and the correlation coefficient was 0.9946-0.9998. Limits of detection of 24 herbicides in vegetables ranged from 1.2 to 160.8 μg·kg-1, and limit of quantitative between 4.0 and 536.0 μg·kg-1, which can satisfy the requirement of quantitative analysis. The mixed standard solution of 24 herbicides were spiked in the blank vegetable samples at three levels 50, 100, 200 μg·kg-1, and the recovery of 24 kinds of herbicides at the rate of 66.5%-116%, the relative standard deviation between 2.3%-9.7%, which can meet the requirements. Using the established determination method, 38 vegetable samples were detected, and only atrazine was detected in all vegetable samples with the detection rate of 57.9% and the detection range from not detected to 0.84 μg·kg-1. The other remaining 23 kinds of herbicides were not detected.The UPLC-MS/MS method is simple, rapid, solvent saving and sensitive, which is suitable for the determination of herbicides in a large number of vegetable samples.

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; vegetables; herbicides; dispersive solid phase extraction

2017-06-03；接受日期：2017-07-27

北京市優(yōu)秀人才項目（2015000020060G131）、北京市農林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項（KJCX20150301）、北京市農林科學院青年科研基金（QNJJ201521）

平華，E-mail：pingh@brcast.org.cn。通信作者馬智宏，Tel：010-51503405；E-mail：mazh@brcast.org.cn