劉 旸 李曉文 - 祝 紅 謝 濤 易翠平 -

(1. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410015；2. 湖南工程學院化學化工學院，湖南 湘潭 411104) (1. College of Chemistry and Biology Science, Changsha University of Science & Technology, Changsha, Hunan 410015,China; 2. College of Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering, Xiangtan, Hunan 411104, China)

有機酸-濕熱復(fù)合處理土豆抗性淀粉的益生特性

劉 旸1LIUYang1李曉文1LIXiao-wen1祝 紅1ZHUHong1謝 濤2XIETao2易翠平1YICui-ping1

(1. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410015；2. 湖南工程學院化學化工學院，湖南 湘潭 411104) (1.CollegeofChemistryandBiologyScience,ChangshaUniversityofScience&Technology,Changsha,Hunan410015,
China; 2.CollegeofChemicalEngineering,HunanInstituteofEngineering,Xiangtan,Hunan411104,China)

采取有機酸-濕熱復(fù)合處理制備了土豆抗性淀粉(AH-HMT RS3)，重點研究了有機酸種類及濃度、淀粉乳濃度對土豆AH-HMT RS3中慢速消化淀粉(SDS)、抗性淀粉(RS)的形成及其益生作用的影響。結(jié)果表明：無酸濕熱處理土豆淀粉時，淀粉乳濃度對SDS、RS的形成幾乎無影響；與無酸濕熱復(fù)合處理相比，無論淀粉乳濃度高低，4種有機酸-濕熱復(fù)合處理所得土豆AH-HMT RS3中RS含量增高了21.89%～45.09%，且高濃度酸比低濃度酸更能促進RS的生成，促進RS水平增高程度從大到小依次為檸檬酸、乙酸、琥珀酸和乳酸。隨著土豆AH-HMT RS3中RS含量增加，其對雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖作用更大，更能促進短鏈脂肪酸(SCFAs)特別是丁酸的大量產(chǎn)生。因此，土豆AH-HMT RS3具有開發(fā)成為新益生素的潛力。

土豆；抗性淀粉；有機酸-濕熱復(fù)合處理；益生特性

根據(jù)被酶消化的速率，淀粉可分為快速消化淀粉(RDS)、慢速消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)三類。RDS和SDS在消化道內(nèi)能完全消化，而RS對小腸的消化與吸收具有抗性，但在大腸內(nèi)能被腸道微生物發(fā)酵形成短鏈脂肪酸(SCFAs)，主要是乙酸、丙酸和丁酸[1]。RS的發(fā)酵產(chǎn)物有助于預(yù)防結(jié)腸癌、降低心臟病風險、影響代謝和炎性腸疾病如糖尿病、憩室炎。SDS也具有潛在的保健功能，如穩(wěn)定糖代謝、控制糖尿病、調(diào)節(jié)心理、消除飽腹感[1-2]。

鑒于RS與SDS的益生作用，已有許多研究[3-5]報道了如何提高不同來源淀粉中SDS和RS的含量。濕熱處理(HMT)就是其中最常見的方法，其影響因素有加熱溫度、濕含量、加熱時間、淀粉來源、直鏈淀粉含量、鏈長分布和淀粉結(jié)晶度等。除此之外，與單純濕熱處理比，如果在濕熱處理之前將淀粉部分酸水解，則可以進一步提高RS的產(chǎn)量[4,6]。據(jù)研究[7-10]，檸檬酸溶液在高溫下處理淀粉可提高SDS和RS的含量。

盡管已有許多關(guān)于檸檬酸-濕熱處理提高淀粉中SDS和RS含量的研究報道[11-13]，但有關(guān)不同有機酸影響淀粉中SDS和RS形成的研究仍非常有限。而多數(shù)有機酸處理都能改變淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，產(chǎn)生更多的短鏈、形成具有不同熔點的結(jié)晶體、增加表觀直鏈淀粉含量和冷水溶解性。因此，本試驗旨在研究在不同濕含量(或淀粉乳濃度)條件下采用不同有機酸(檸檬酸、乙酸、琥珀酸和乳酸)-濕熱復(fù)合處理土豆淀粉，測定其對SDS、RS形成以及對腸道益生菌增殖和SCFAs產(chǎn)生的影響，以期為全新土豆淀粉類益生因子的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淀粉：土豆淀粉，四川友嘉食品有限公司；

營養(yǎng)培養(yǎng)基：9.240 g NaHCO3、7.125 g Na2HPO4·12H2O、0.470 g NaCl、 0.450 g KCl、0.100 g Na2SO4、0.055 g CaCl2、0.047 g MgCl2和0.400 g 尿素溶解于990 mL碳酸鹽緩沖液中，并與10 mL微量元素溶液[含36.8 mg FeSO4·7H2O、19.00 mg MnSO4·7H2O、4.40 mg ZnSO4·7H2O、1.20 mg CoCl2·6H2O、1.98 mg CuSO4·5H2O和0.17 mg Mo7(NH4)6O24·4H2O]混勻；

分離培養(yǎng)基：TP選擇性培養(yǎng)基(Bifidobacteriasp)和LBS選擇性培養(yǎng)基(Lactobacilli)，美國Life Tech公司；

淀粉轉(zhuǎn)葡萄苷酶：400 AGU/mL，丹麥Novozymes公司；

轉(zhuǎn)化酶：20萬 SU/g，丹麥Novozymes公司；

豬胰液素、葡萄糖氧化酶/過氧化物酶(GOPOD)試劑盒：美國Sigma-Aldrich公司；

檸檬酸、乙酸、琥珀酸、乳酸：食用級，蘇州奧德賽化學品有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 酸-濕熱復(fù)合處理

參照文獻[13]的方法，修改如下：稱取適量土豆淀粉置于500 mL錐形瓶中，分散到水中制成淀粉乳(淀粉∶水質(zhì)量比1∶3.5或1∶1)，分別加入檸檬酸、乙酸、琥珀酸、乳酸4種有機酸(0.25%和0.50%，干基)，混合均勻，將混合淀粉乳液置于高壓滅菌鍋中110 ℃加熱1 h。冷卻至室溫，儲存在4 ℃ 的環(huán)境中12 h，再次循環(huán)，將產(chǎn)品置于40 ℃干燥箱烘干，粉碎，過120目篩，即得土豆抗性淀粉(RS3)。

1.3 RDS、SDS與RS含量的測定

參照文獻[12]和[14]的方法，修改如下：稱取50 mg重結(jié)晶淀粉粉末放入15 mL離心管，取2.5 mL含0.02%疊氮鈉、pH 5.2的鹽酸-醋酸鈉緩沖液混勻，預(yù)熱至37 ℃。將8 g 豬胰α-淀粉酶溶于10 mL上述緩沖液中，于37 ℃孵育10 min，1 500×g離心得到的上清液即為α-淀粉酶溶液。使用前在α-淀粉酶溶液中混入125 μL(300 U/mL)淀粉葡萄糖酶即得混合酶液。5份200 μL混合酶液與100 μL淀粉乳液的混合液配制后，立即置于37 ℃往復(fù)式振蕩水浴(振幅35 mm，每分鐘振蕩170次)中依次反應(yīng)0，20，60，120，180 min，加入96%的乙醇溶液900 μL鈍化酶活性并使之沉淀。沉淀在4 ℃貯放1 h，4 ℃、5 000×g離心10 min。上清液中的還原糖含量采用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶(GOPOD)試劑盒測定。

快速消化淀粉、緩慢消化淀粉和抗性淀粉含量由0(G0)，20(G20)，120(G120) min時的葡萄糖含量以及樣品的初始干重(S)按式計算：

(1)

(2)

RS=1-(RDS+SDS)，

(3)

式中：

RDS——快速消化淀粉含量，%；

SDS——緩慢消化淀粉含量，%；

RS——抗性淀粉含量，%；

G0——0 min時葡萄糖含量，mg；

G20——20 min時葡萄糖含量，mg；

G120——120 min時葡萄糖含量，mg；

S——樣品的初始干重，mg。

1.4 體外厭氧發(fā)酵

1.4.1 混合酶液配制 2.8 mL淀粉轉(zhuǎn)葡萄苷酶用蒸餾水稀釋至8 mL(酶活力為140 AGU/mL)。4支離心管中每支放入1.8 g豬胰液素，分別用20 mL蒸餾水懸浮混勻，離心管振動10 min后于1 500×g離心10 min。從每支離心管中取出13.5 mL上清液合并得54 mL，再與6 mL稀淀粉轉(zhuǎn)葡萄苷酶溶液、4 mL轉(zhuǎn)化酶混合。

1.4.2 酶解消化 稱取1 g抗性淀粉放入50 mL帶蓋試管中，加入0.1 mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH 5.2)20 mL混合。將帶蓋試管放入沸水浴中振蕩糊化10 min，取出于冰浴中冷卻至37 ℃，放入5粒玻璃珠(Φ5 mm)，再移入37 ℃水浴中平衡20 min。加入5 mL混合酶液，帶蓋試管置于水平振蕩搖床(振幅35 mm，每分鐘振蕩160次)上消化6 h。之后移入85 ℃水浴中維持15 min鈍化酶。在帶蓋試管中加入95%的乙醇300 mL沉淀未消化淀粉，離心收集未消化淀粉，干燥粉碎過120目篩，用于厭氧發(fā)酵。

1.4.3 厭氧發(fā)酵 參照文獻[15]的方法，修改如下：取年齡23～31歲健康男子(此前至少3個月以上未注射抗生素，沒有預(yù)先服用已知的益生元或益生菌，沒有胃腸病史)的糞便，貯存于充滿CO2的氣瓶中。糞便按1∶5 (g/mL)與營養(yǎng)培養(yǎng)基混合均勻，并用6層醫(yī)用紗布過濾。稱取100 mg混合酶液消化的樣品(唯一碳源)放入15 mL帶蓋試管中，加入10 mL 糞便濾液。同時制作一份加入糞便濾液的空白。在37 ℃水浴中鼓入CO2以維持發(fā)酵所需的厭氧環(huán)境。為使接種物分布均勻，每12 h振動帶蓋試管20 s。

1.4.4 活細菌計數(shù) 用厭氧稀釋液將種子培養(yǎng)液稀釋至合適的濃度，接種每個選擇性培養(yǎng)基，然后在好氧或厭氧條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)36 h，每12 h活菌計數(shù)一次。

1.4.5 短鏈脂肪酸(SCFA)分析 參照文獻[16]，總短鏈脂肪酸含量以乙酸、丙酸與丁酸的總和表示。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)為3個平行試驗的平均值，且采用SPSS 20.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RDS、SDS與RS含量

研究[17-18]發(fā)現(xiàn)通過向淀粉漿中加入有機酸(如檸檬酸)可以提高RS3中的RS含量，因為有機酸通過羥基使淀粉分子酯化，酸水解支鏈淀粉的分支點，淀粉結(jié)構(gòu)的改變對酶消化產(chǎn)生抗性。濕熱處理常被用于增加顆粒結(jié)構(gòu)完整的淀粉中SDS和RS的含量[3]。如果繼續(xù)對經(jīng)有機酸或淀粉酶類處理的淀粉進行加熱、冷卻處理，可以大幅增加RS3中RS含量[19-20]。由表1可知，無論淀粉乳濃度高低，4種有機酸-濕熱復(fù)合處理所得土豆RS3中RS的含量(54.96%～78.64%)都顯著高于無酸濕熱處理的(P<0.01)，說明有機酸-濕熱復(fù)合處理有利于促進RS的生成。而且高濃度酸比低濃度酸對RS生成的影響相對要顯著些，它們對土豆RS3中RS生成的影響程度從大到小依次為檸檬酸、乙酸、琥珀酸和乳酸。經(jīng)有機酸-濕熱復(fù)合處理得到的土豆RS3中RS含量增加，也可能是酸水解產(chǎn)生了低分子質(zhì)量的水解產(chǎn)物(既有來自直鏈淀粉的線性分子，也有來自支鏈淀粉的分支鏈與直鏈分子)，它們在濕熱作用下通過直鏈—直鏈、支鏈—支鏈、直鏈—支鏈分子之間的相互作用形成雙螺旋和區(qū)室化結(jié)構(gòu)，限制了酶的水解[5,16]；而且，有機酸與淀粉的酯化反應(yīng)可能在淀粉分子鏈之間形成對酶水解具有抗性的交聯(lián)結(jié)構(gòu)[8]。另外，與無酸濕熱處理相比，有機酸-濕熱復(fù)合處理后RDS含量顯著減少(P<0.01)，而SDS含量有降(檸檬酸和乙酸處理)有升(琥珀酸和乳酸處理)，可能是有機酸-濕熱處理淀粉中RDS和/或SDS更多地轉(zhuǎn)化成了對消化酶水解具有抗性的RS。在有機酸濃度不變情況下，檸檬酸或乙酸處理時，低濃度淀粉乳更能促進RS的生成，而琥珀酸或乳酸處理時，結(jié)果正好相反。

表1 無酸和有機酸-濕熱處理土豆淀粉的RDS、SDS與RS含量?Table 1 RDS, SDS and RS of potato starches without and with acid and heat-moisture treatments %

? 上標字母表示同列數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)；*表示同種酸濃度、不同淀粉含量的同類淀粉含量具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 腸道菌群的變化

RS在人體大腸內(nèi)能被不同的微生物發(fā)酵利用，涉及各種代謝過程，包括厭氧微生物降解有機質(zhì)產(chǎn)生代謝能用于菌體生長，改善腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)[21]。由表2可知，與空白對照相比，無酸-濕熱處理所得土豆RS3對雙歧桿菌與乳酸桿菌有較好的增殖作用(0.01

2.3 短鏈脂肪酸的產(chǎn)生

RS主要的末端代謝產(chǎn)物是短鏈脂肪酸(SCFAs)、氣體(CO2、CH4、H2)和熱量。SCFAs對宿主能產(chǎn)生重要的生理作用，如降低胞內(nèi)pH值，促進礦物質(zhì)吸收，減少結(jié)腸內(nèi)次級代謝產(chǎn)物膽汗酸的生成，以及改善大腸內(nèi)微生物菌群分布等[1,24-25]。在SCFAs中，丁酸是大腸細胞優(yōu)先的能量來源，能抑制腸癌細胞的擴散[1]。有關(guān)RS促進SCFAs生產(chǎn)與改善微生物菌群分布的研究始終不斷，RS作為唯一碳源對丁酸的生成有很強的影響[22,26]。由表3可知?？瞻讓φ赵谡麄€發(fā)酵過程中產(chǎn)酸一直維持在低水平(P>0.05)，但以無酸、有機酸-濕熱處理所得土豆RS3作為唯一碳源時，隨著RS3中RS含量的增加，不僅產(chǎn)酸水平顯著高于空白對照(P<0.01)，而且前期(0～12 h)積累的乙酸在發(fā)酵后期(24～36 h)顯著減少(P<0.01)，同時伴隨后期丁酸水平的顯著提高(P<0.01)。這些結(jié)果與已有文獻[1,21,27]報道是一致的。

表2 大便接種物分批發(fā)酵過程中雙歧桿菌與乳酸桿菌計數(shù)變化?Table 2 Changes in bifidobacteria and lactobacilli counts during fecal batch fermentations lg(CFU/mL)

? 上標小寫字母表示同列數(shù)據(jù)雙歧桿菌具有顯著性差異(P<0.05)；上標大寫字母表示同列數(shù)據(jù)乳酸桿菌具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 大便接種物分批發(fā)酵過程中乙酸與丁酸的變化?Table 3 Changes in acetic acid and butyric acid during fecal batch fermentation mmol/L

? 上標小寫字母表示同列數(shù)據(jù)乙酸具有顯著性差異(P<0.05)；上標大寫字母表示同列數(shù)據(jù)丁酸具有顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

通過對比4種有機酸-濕熱復(fù)合處理土豆RS3中RS的含量變化，證明了在濕熱處理前用有機酸水解淀粉能有效地提高RS的產(chǎn)量，且4種有機酸對RS生成的提升幅度大小順序依次為檸檬酸、乙酸、琥珀酸和乳酸。同時發(fā)現(xiàn)采取有機酸-濕熱復(fù)合處理制備的土豆抗性淀粉因RS含量增加，能有效地改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，從而提高了具有重要生理作用的SCFAs含量，體現(xiàn)了土豆AH-HMT RS3的益生性。但未對不同有機酸前處理促進RS生成時對淀粉乳濃度高低需求的不一致做出研究，此外關(guān)于土豆RS3的未消化部分是如何促進腸道菌群生長也非常值得探索，或許與腸道復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。

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Probioticpropertiesofpotatoresistantstarchesmodifiedbyacombinationoforganicacidandheat-moisturetreatments

Some potato resistant starches (AH-HMT RS3) were made by using acid hydrolysis combined with heat-moisture treatment (AH-HMT), and the effects of different types and concentration of organic acids and the starch slurry concentration on the formation of slowly digestive starch (SDS) and resistant starch (RS) in potato RS3 were investigated. The results demonstrated that the starch slurry concentrations had no effect on the formation of SDS and RS when the potato starches were modified by no acid combined with heat-moisture treatment (HMT). Compared with no acid-HMT, the RS contents in potato AH-HMT RS3 made by AH-HMT increased 21.89%～45.09%, non-influenced by the starch slurry concentration. As to the improvement of RS formation, high acid concentration was better that the lower one. The increased levels of RS from high to low were ordered as citric acid, acetic acid, succinic acid and latic acid. With the increase of RS content, the potato AH-HMT RS3 had stronger effect on the proliferations of bifidobacteria and lactobacilli and could promote more short chain fatty acids (SCFAs), especially butyric acid formation. Therefore, potato AH-HMT RS3 had the developmental potential of a new probotic.

Potato resistant starch; Organic acid hydrolysis combined with heat-moisture treatment; Probiotic property

長沙市科技計劃項目(編號：Kq1602040)

劉旸，男，長沙理工大學在讀碩士研究生。

易翠平(1973—)，女，長沙理工大學教授，博士。

E-mail:109823769@qq.com

2017—03—07

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.007