宋彬妤 ，趙嘉偉 ，宋靜 ，陳思思 ，胡志廷 ，韓昕 ，王敏敏 ，任來峰

（1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 科技中心，山西 汾陽 032200；2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系，福建 廈門 361002；3.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗系，山西 汾陽 032200）

HCV NS4B表達載體的構(gòu)建及其對細胞凋亡的影響*

宋彬妤1，趙嘉偉2，宋靜3，陳思思3，胡志廷3，韓昕3，王敏敏1，任來峰3

（1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 科技中心，山西 汾陽 032200；2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系，福建 廈門 361002；3.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗系，山西 汾陽 032200）

目的 構(gòu)建丙型肝炎病毒（HCV）2a型非結(jié)構(gòu)蛋白4B（NS4B）的真核表達載體，并觀察其對骨肉瘤細胞U2OS凋亡的影響。方法 以質(zhì)粒PJFH1為模板，通過PCR反應(yīng)擴增NS4B目的基因片段，采用同源重組法與PCMV-tag2b載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，篩選正確的克隆。以脂質(zhì)體為介導(dǎo)轉(zhuǎn)染U2OS細胞，通過Western blot檢測NS4B蛋白的表達，免疫熒光檢測細胞的凋亡。結(jié)果 構(gòu)建pCMV-tag2b-NS4B重組質(zhì)粒，經(jīng)測序其與NCBI公布的序列完全一致，并可在U2OS細胞中表達，DAPI檢測顯示細胞凋亡率為（17.25±2.95）%，對照組凋亡率為（6.53±2.36）%。結(jié)論 成功構(gòu)建NS4B的真核表達載體，并可在U2OS細胞中表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。

丙型肝炎病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白4B；重組質(zhì)粒；凋亡

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是造成慢性肝炎、肝纖維化及肝細胞肝癌的重要病因之一，嚴重威脅人類的生命健康[1]。研究表明，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白 4B（nonstructural protein 4B，NS4B）參與病毒復(fù)制、組裝及釋放等過程[2-3]。最近研究表明，NS4B可能參與宿主細胞的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，干擾轉(zhuǎn)錄調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、惡性轉(zhuǎn)化等過程，但各研究結(jié)果存在分歧[4-6]。因此，本研究構(gòu)建HCV NS4B表達載體，并觀察其對人骨肉瘤細胞U2OS凋亡的影響，為后續(xù)進一步研究其致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

U2OS細胞株保存在液氮中，質(zhì)粒pCMV-Tag 2b和pJFH1（HCV 2a型cDNA）置入-20℃冰箱冷凍保存，大腸埃希菌DH5α購自北京康為世紀生物科技有限公司，In-Fusion HD Cloning Kit購自美國Clontech公司，限制性內(nèi)切酶HindⅢ購自美國NEB公司，質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自美國Promega公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM（高糖）培養(yǎng)基、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，DNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000及核染料DAPI購自美國Invitrogen公司，抗Flag抗體和二抗（HRP標(biāo)記）購自美國Sigma公司，引物合成和DNA測序由上海生工生物工程股份有限公司完成，DM 4000型熒光顯微鏡購自德國Leica公司，Eon型酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 NS4B引物的設(shè)計與合成 根據(jù)質(zhì)粒pJFH1序列和質(zhì)粒pCMV-Tag 2bHindⅢ酶切位點兩端的序列，利用同源重組的原理設(shè)計NS4B引物，正向引物 P1：5'-ATTCGATATCAAGCTTGCCTCTAGGGCGG CTCTC-3'，正向引物 P2：5'-CGGTATCGATAAGCTT TCAGCATGGGATGGGGCAGT-3'。

1.2.2 NS4B擴增及鑒定 以質(zhì)粒pJFH1為模板，以P1、P2為引物，通過PCR反應(yīng)擴增目的基因NS4B，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min，95℃變性 25 s，55℃退火30 s，72℃延伸100 s，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸6 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)分子量大小初步鑒定。

1.2.3 pCMV-tag2b-NS4B重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定HindⅢ酶切pCMV-tag2b載體與目的基因PCR產(chǎn)物由In-Fusion重組酶進行連接，重組反應(yīng)體系：目的片段 3 μl，pCMV-tag2b 1 μl，In-fusion 重組酶混合物 2 μl，ddH2O 4 μl，總體系為 10 μl，55℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，在LB固體培養(yǎng)基上挑取數(shù)個單克隆菌落，篩選重組質(zhì)粒提取其質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進一步測序鑒定。

1.2.4 細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將液氮中的U2OS細胞株取出，放入37℃水浴箱中快速攪動融化，置于3倍體積DMEM（高糖，含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)基的無菌離心管中，1 500 r/min離心3 min，棄上清液，并加入含有DMEM培養(yǎng)基的細胞瓶中，于5%二氧化碳CO2、37℃孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細胞匯合度達85%左右時，用0.25%胰酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前，將U2OS細胞培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)板/孔中，待匯合度達50%～60%時，按Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。設(shè)置PCMV-tag2b空載體組和PCMV-tag2b-NS4B載體組，在轉(zhuǎn)染后48～72 h，進行后續(xù)實驗。

1.2.5 細胞凋亡檢測 U2OS細胞接種到細胞爬片上，按上述方法轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后收樣，室溫下用PBS漂洗5～10 min/次，共3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次；再經(jīng)0.3%TritonX-100通透處理10 min，PBS漂洗；DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。凋亡細胞計數(shù)參照文獻[7]的方法進行。

1.2.6 Western blot檢測 細胞轉(zhuǎn)染pCMV-tag2b-NS4B 48 h后，用RIPA細胞裂解液裂解轉(zhuǎn)染細胞（設(shè)未轉(zhuǎn)染組為對照），抽提總蛋白，經(jīng)Bradford法定量，加入5×上樣緩沖液煮沸備用；經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法（200 mA，2 h）將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，根據(jù)蛋白分子量條帶剪下所需的膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h；抗Flag（1∶500比例稀釋）或α-tublin（1∶5 000比例稀釋）單克隆抗體4℃過夜，TBST漂洗5 min/次，共3次；再用HRP標(biāo)記的抗鼠二抗（1∶2 000比例稀釋）孵育1.0～1.5 h，TBST漂洗5 min/次，共3次；混合ECL發(fā)光試劑顯色，用Fluor Chem FC2成像儀采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pCMV-tag2b-NS4B載體

本研究所用載體為pCMV-tag2b。構(gòu)建策略為選用HindⅢ為內(nèi)切酶，設(shè)計目的基因PCR引物時，在正、反向引物的5'-端分別添加16個與載體酶切位點上游同源的堿基序列，應(yīng)用同源重組的原理將酶切的載體與PCR產(chǎn)物連接起來（見圖1）。首先擴增HCV NS4B基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約780bp的特異性條帶（見圖2）；然后進行重組質(zhì)粒的克隆。挑取獲得的細菌克隆擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，HindⅢ酶切，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析（見圖2）。酶切產(chǎn)物與PCR產(chǎn)物均在約750 bp處出現(xiàn)一條帶，與NS4B的片段長度接近，初步提示重組質(zhì)?？寺〕晒?。

圖1 pCMV-Tag2b載體結(jié)構(gòu)

圖2 pCMV-tag2b-NS4B重組質(zhì)粒鑒定

2.2 pCMV-tag2b-NS4B質(zhì)粒測序

將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司測序，測序引物為CMV正向引物：CGCA AATGGGCGGTAGGCGTG（見圖3）。將結(jié)果序列與pJFH1 NS4Bb的標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對，顯示匹配度為100%，表明成功構(gòu)建NS4B真核表達質(zhì)粒pCMV-tag 2b-NS4B。

2.3 NS4B蛋白在U2OS細胞中的表達

將U2OS細胞復(fù)蘇并在細胞瓶中培養(yǎng)（見圖4）。細胞轉(zhuǎn)染pCMV-tag2b-NS4B或pCMV-tag2b（同時設(shè)不轉(zhuǎn)染組對照）48 h后，收集細胞，經(jīng)Western blot檢測U2OS細胞中NS4B蛋白的表達，結(jié)果顯示，只有在轉(zhuǎn)染PCMV-tag2b-NS4B載體的細胞（實驗組）中才表達NS4B蛋白（見圖5）。

2.4 NS4B蛋白誘導(dǎo)U2OS細胞凋亡

細胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒48 h后，收集細胞，經(jīng)DAPI染細胞核后在熒光顯微鏡下觀察，分別計數(shù)其凋亡情況。轉(zhuǎn)染pCMV-tag2b-NS4B組凋亡率為（17.25±2.95）%，轉(zhuǎn)染PCMV-tag2b組凋亡率為（6.53±2.36）%，經(jīng) t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.919，P=0.008）。見圖6。

圖3 pCMV-tag2b-NS4B重組質(zhì)粒測序圖譜

圖4 U2OS細胞形態(tài) （×20）

圖5 NS4B在U2OS細胞中的表達

圖6 HCV NS4B對細胞凋亡的影響 （×100）

3 討論

分子克隆是現(xiàn)代生命科學(xué)研究中最基本的技術(shù)方法之一，傳統(tǒng)的分子克隆通過雙酶切法把目的基因連接到載體上。該方法首先應(yīng)用2種限制性內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體，產(chǎn)生帶有相同末端序列的目的基因片段和線性載體，然后用T4 DNA連接酶連接形成重組載體。最新發(fā)展起來的一種利用同源重組的原理進行分子克隆的方法，應(yīng)用本方法設(shè)計引物時須在目的基因的2條引物5'-端添加15～20個與載體酶切位點上游同源的核苷酸序列，最后加入重組酶，可將酶切后的載體和目的基因連接到一起，產(chǎn)生重組質(zhì)粒[8]。同源重組法跟雙酶切法相比，具有更加簡單、快速、克隆效率高等優(yōu)點[9-10]。本研究是利用同源重組的方法克隆HCV NS4B的重組載體pCMV-tag2b-NS4B，經(jīng)酶切和測序證明獲得的重組質(zhì)粒正確無誤。Western blot檢測證明，本實驗構(gòu)建的重組載體可以在U2OS細胞中正確表達目的基因產(chǎn)物NS4B蛋白。

本研究將PCMV-tag2b-NS4B載體轉(zhuǎn)染U2OS細胞，24 h后通過DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察到明顯的細胞凋亡。這與ZHAO等[5]在293T細胞和Huh7細胞中的研究結(jié)果一致。RUTKOWSKI[11]和張艷妮等[12]發(fā)現(xiàn)，NS4B可通過誘導(dǎo)細胞的非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)而啟動細胞凋亡。李昌平等[13]在人正常LO2肝細胞中轉(zhuǎn)染表達NS4B后，胰島素樣生長因子IGF-Ⅱ表達上調(diào)，而抑癌基因P16表達下調(diào)，具有促進肝細胞增殖；此外，NS4B可能抑制Caspase-3表達、促進Survivin的表達而抑制肝細胞凋亡[13-14]；最近研究表明，NS4B可活化EOR-Ca2+-ROS-NF-κB，抑制HCV感染誘導(dǎo)的肝細胞凋亡[15]。各實驗室得出矛盾的結(jié)果其原因可能是所用的載體、細胞系等實驗條件不同所致，具體細節(jié)尚待進一步研究。

綜上所述，本實驗利用同源重組法成功構(gòu)建HCV NS4B的真核表達載體，初步研究發(fā)現(xiàn)NS4B可誘導(dǎo)U2OS細胞凋亡，為后續(xù)進一步深入研究HCV NS4B的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

[1]ARZUMANYAN A,REIS H M,FEITELSON M A.Pathogenic mechanisms in HBV-and HCV-associated hepatocellular carcinoma[J].Nat Rev Cancer,2013,13(2):123-135.

[2]HUGLE T,FEHRMANN F,BIECK E,et al.The hepatitis C virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein[J].Virology,2001,284:70-81.

[3]KONG L,FUJIMOTO A,NAKAMURA M,et al.Prolactin regulatory element binding protein is involved in hepatitis C virus replication by interaction with NS4B[J].J Virol,2016,90(6):3093-3111.

[4]RAI R,DEVAL J.New opportunities in anti-hepatitis C virus drug discovery:targeting NS4B[J].Antiviral Res,2011,90(2):93-101.

[5]ZHAO P,HAN T,GUO J J,et al.HCV NS4B induces apoptosis through the mitochondrial death pathway[J].Virus Research,2012,169(1):1-7.

[6]KONG L,LI S,YU X,et al.Hepatitis C virus and its protein NS4B activate the cancer-related STAT3 pathway via the endoplasmic reticulum overload response[J].Arch Virol,2016,161(8):2149-2159.

[7]任來峰,唐子執(zhí),吳惠文,等.HCV NS3/4A基因外來表達對Huh7細胞凋亡及DNA損傷應(yīng)答的影響[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報,2014,36(8):1110-1115.

[8]鄺翡婷,袁定陽,李莉,等.一種載體構(gòu)建的新方法:重組融合PCR法[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2012,31(6):634-639.

[9]WANG S,ZENG X,LIU Y,et al.Construction and characterization of a PDCD5 recombinant lentivirus vector and its expres-sion in tumor cells[J].Oncol Rep,2012,28(1):91-98.

[10]馬凱,胡紅霞,于婧,等.雙酶切和同源重組方法構(gòu)建pMIR-reporter載體的比較[J].中國病原生物學(xué)雜志,2015,10(6):495-499.

[11]RUTKOWSKI D T,KAUFMAN R J.A trip to the ER:coping with stress[J].Trends in Cell Biology,2004,14(1):20-28.

[12]張艷妮,張慶華,陳瑤,等.丙型肝炎病毒NS4B蛋白調(diào)控Hep3B細胞非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,34(1):165-169.

[13]李昌平,潘雯,楊春,等.丙型肝炎病毒NS4B調(diào)控肝細胞增殖的相關(guān)機制研究[J].西南國防醫(yī)藥,2011,21(4):367-370.

[14]潘雯,譚道玉,李昌平,等.丙型肝炎病毒NS4B調(diào)控肝細胞凋亡的相關(guān)機制研究[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,32(3):339-343.

[15]KONG L,LI S,HUANG M,et al.The roles of endoplasmic reticulum overload response induced by HCV and NS4B protein in human hepatocyte viability and virus replication[J].PLoS One,2015,10(4):DOI:10.1371/journal.pone.0123190.

Construction of expression vector of HCV NS4B and its effect on cell apoptosis*

Bin-yu Song1,Jia-wei Zhao2,Jing Song3,Si-si Chen3,Zhi-ting Hu3,Xin Han3,Min-min Wang1,Lai-feng Ren3
(1.Science and Technology Center,Fenyang College,Shanxi Medical University,Fenyang,Shanxi 032200,China;2.Department of Clinical Medicine,School of Medicine,Xiamen University,Xiamen,Fujian 361002,China;3.Department of Laboratory Medicine,Fenyang College,Shanxi Medical University,Fenyang,,Shanxi 032200,China)

Objective To constructan eukaryotic expression vector ofHepatitis C virus (HCV)nonstructural protein NS4B,and investigate the effect of this protein on apoptosis of U2OS cells.Methods The fragment of target gene NS4B was obtained by PCR,and connected with the PCMV-tag2b vector using the homologous recombination method,and the PCMV-tag2b-NS4B was transformed into theE.coliDH5a.The right recombinant plasmid was selected.Lipofectamine 2000 was used to transfect PCMV-tag2b-NS4B into U2OS cells.Western blot was applied to detect the expression of HCV NS4B protein in U2OS cells,and immunofluorescence(IF)was used to assess the apoptosis of U2OS cells.Results The data showed that the recombinant plasmid PCMV-tag2b-NS4B was consistent with the one published on NCBI and could express HCV NS4B protein in U2OS cells.DAPI staining showed that the apoptosis rate of the PCMV-tag2b-NS4B group was(17.25±2.95)%and that of the control group was(6.53±2.36)%.Conclusions The eukaryotic expression vector of HCV NS4B has been successfully constructed,and HCV NS4B protein is expressed in U2OS cells and induces apoptosis.

Hepatitis C virus;nonstructural protein 4B;recombinant plasmid;apoptosis

R373.21

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.005

1005-8982（2017）26-0025-05

2016-12-26

山西省自然科學(xué)基金（No：2014021037-9）；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（No：2014052）；山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技發(fā)展基金（No：2016B02）

任來峰，E-mail：rlaifeng@163.com，Tel:15333434863

（童穎丹 編輯）