孫陽，吳勃巖，孫敏，王艷杰，車艷新

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

貞術(shù)消積湯抑制STAT3/Survivin信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬實(shí)驗研究

孫陽，吳勃巖*，孫敏，王艷杰，車艷新

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：通過觀察貞術(shù)消積湯作用H22移植瘤后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，探討該復(fù)方體內(nèi)抗腫瘤的分子機(jī)制。方法：將小鼠肝癌細(xì)胞移植于 ICR小鼠皮下，貞術(shù)消積湯灌胃給藥10 d；采用蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化；應(yīng)用透射電鏡觀察模型組和貞術(shù)消積湯組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；熒光定量PCR法檢測Survivin mRNA表達(dá)；免疫組化法檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)蛋白和抗凋亡因子(Survivin)蛋白表達(dá)。結(jié)果：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，用藥組細(xì)胞排列稀疏，組織產(chǎn)生大量空泡；透射電鏡觀察可見，貞術(shù)消積湯組細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)自噬體和自噬溶酶體；與模型對照組相比，貞術(shù)消積湯組Survivin mRNA低于模型組；貞術(shù)消積湯組STAT3和Survivin表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：貞術(shù)消積湯體內(nèi)抗腫瘤的作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)，并通過抑制STAT信號通路發(fā)揮作用。

貞術(shù)消積湯；H22細(xì)胞；自噬；STAT3；Survivin

原發(fā)性肝癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，起病隱匿，病情發(fā)展迅速，患者平均存活時間短。中藥療法與手術(shù)、放療、化療等療法結(jié)合起來，可以提高臨床療效及患者生存質(zhì)量，減輕并發(fā)癥或毒副作用，因此研究中藥抗腫瘤具有重要意義。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,正氣虧虛是肝癌發(fā)生發(fā)展的主要因素，癌毒是肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，痰、瘀是發(fā)生肝癌的重要病理基礎(chǔ)[1-3]。貞術(shù)消積湯是依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論及多年的臨床經(jīng)驗而創(chuàng)，主治毒瘀互結(jié)、陰傷絡(luò)阻，治法為滋陰解毒、活血通絡(luò),由女貞子、莪術(shù)、夏枯草、白花蛇舌草和甘草組成。復(fù)方中以女貞子和莪術(shù)為君藥，女貞子滋補(bǔ)肝陰，扶助正氣[4]；莪術(shù)破血行氣，消積止痛[5]，可緩解諸藥寒涼之性，防止白花蛇舌草寒涼太過而斂邪。臣以白花蛇舌草，清熱解毒，清解癌毒，益氣利濕[6]。夏枯草可軟堅散結(jié)[7]，還具有助白花蛇舌草清熱的作用，與白花蛇舌草均為臣藥；佐使以甘草，助白花蛇舌草和夏枯草清熱解毒，調(diào)和諸藥。全方具有攻補(bǔ)兼施，寒溫并用的組方特點(diǎn)。通過前期實(shí)驗證實(shí)，女貞子發(fā)揮其抗腫瘤作用主要物質(zhì)基礎(chǔ)是齊墩果酸，主要通過免疫調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡起到抗腫瘤的作用[8-9]。在研究女貞子抗腫瘤作用的基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步開展貞術(shù)消積湯的實(shí)驗研究。本實(shí)驗通過研究貞術(shù)消積湯對H22肝癌荷瘤小鼠的形態(tài)學(xué)影響及其分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗動物及腫瘤細(xì)胞

ICR小鼠，體質(zhì)量20～22 g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP中心提供，許可證號SCXK(黑)2013-004；H22腹水型瘤株，購于北京腫瘤研究所。

1.2 藥品

中藥飲片由哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片責(zé)任有限公司提供(批號201507)。

1.3 儀器與試劑

顯微鏡(日本，尼康公司，型號TS100)；切片機(jī)(德國，LEICA公司，型號2135)；透射電鏡(荷蘭，F(xiàn)EI公司，型號TECNAI G2)；電子分析天平(中國，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，型號FA124)；實(shí)時熒光定量PCR儀(美國，伯樂公司，型號IQ5)；兔抗多克隆一抗rabbit anti-Survivin(博士德公司，批號BA1420-1)；rabbit anti-STAT3 (博士德公司，批號BA0621)；二抗(中山生物工程有限公司，批號PV6001)；臺盼藍(lán)(博士德公司，批號AR1175)；Survivin Antibody(RabMAb公司，批號2463-1)；GADPH antibody(Abcam公司，批號ab9485)。

2 方法

2.1 貞術(shù)消積湯藥液的制備

依據(jù)人用藥量，結(jié)合轉(zhuǎn)換公式計算小鼠的用藥量。制備劑量為每毫升含1 g、2 g生藥的湯藥備用，置于4℃保存，用時混勻。

2.2 動物分組

將30只小鼠稱重，隨機(jī)分成3組：模型組和貞術(shù)消積湯高、低劑量組。

2.3 移植瘤造模及給藥方法

將H22肝癌細(xì)胞接種于ICR小鼠腹腔，待其腹部飽滿后處死，置于超凈工作臺上，經(jīng)消毒后抽取乳白色腹水。生理鹽水洗滌、離心2次后，將其稀釋成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞成活率達(dá)到95%，生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL，每只小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL細(xì)胞懸液，接種24 h后開始給藥。貞術(shù)消積湯組按0.2 mL/只灌胃，連續(xù)給藥10天；模型組以相同體積蒸餾水灌胃。

2.4 光鏡及透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)

切下1～2 mm3腫瘤組織在戊二醛溶液中固定，其余置于甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后HE染色、封片后在普通顯微鏡下觀察。戊二醛溶液中固定的腫瘤組織，經(jīng)漂洗、鋨酸處理、固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、切片及染色等步驟，在透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.5 Survivin mRNA表達(dá)

通過查找Genbank數(shù)據(jù)庫，查找Survivin mRNA和GAPDH mRNA的全基因序列。應(yīng)用premier primer5.0軟件設(shè)計引物。Survivin及GAPDH引物分別為：5′-AGCCAGATGACGACCCCATAGAGTGTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCCAG-3′和5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCTAGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。擴(kuò)增的基因片段分別為：132 bp和113 bp。應(yīng)用TRIzol試劑盒提取總DNA，瓊脂糖電泳RNA完整。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗方法及條件同文獻(xiàn)[4]。

2.6 STAT3和Survivin蛋白表達(dá)

采用PV二步法免疫組化檢測細(xì)胞中STAT3和Survivin蛋白的表達(dá)情況。應(yīng)用顯微攝影系統(tǒng)，在物鏡(40×)下隨機(jī)選取8個視野，采用Image-proplus 6.0病理圖像分析，統(tǒng)計各組陽性表達(dá)的積分光密度值。

2.7 統(tǒng)計分析

實(shí)驗結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析及LSD檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 光鏡下腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征變化情況

貞術(shù)消積湯對H22移植性實(shí)體瘤荷瘤鼠作用后，用藥組瘤體體積和質(zhì)量明顯小于模型組。模型組腫瘤細(xì)胞圓形或橢圓形，胞核呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞生長旺盛，排列緊密，核分裂相常見；腫瘤組織中血管豐富，并呈浸潤性生長，可浸潤到胸骨、鎖骨等處，部分可見血性積液。貞術(shù)消積湯組腫瘤細(xì)胞生長狀態(tài)不佳，排列漸進(jìn)稀疏，細(xì)胞變性、壞死明顯，腫瘤組織中也可見大量淋巴細(xì)胞，血管數(shù)量減少，出現(xiàn)許多空泡。

3.2 電鏡下腫瘤細(xì)胞學(xué)特征變化情況

透射電鏡是發(fā)現(xiàn)自噬靜態(tài)研究的技術(shù)，被視為自噬研究的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。自噬體的形成是自噬發(fā)生的關(guān)鍵性指標(biāo)。模型對照組H22細(xì)胞形態(tài)不一，胞質(zhì)中細(xì)胞器完整，線粒體中嵴清晰可見。相對于模型對照組(圖1A)，貞術(shù)消積湯組細(xì)胞變小，細(xì)胞核固縮、異染色質(zhì)邊集，高劑量組細(xì)胞中有明顯的自噬體和自噬溶酶體(如箭頭所示)，內(nèi)含胞漿成分或細(xì)胞器。貞術(shù)消積湯低劑量組線粒體出現(xiàn)空泡化，內(nèi)膜和嵴溶解改變(如圖1B，1C所示)。

圖1 電鏡下H22肝癌細(xì)胞(×11 500，單箭頭標(biāo)示自噬體，雙箭頭標(biāo)示自噬溶酶體)

3.3 Survivin mRNA表達(dá)的影響

通過qRT-PCR實(shí)驗結(jié)果顯示，貞術(shù)消積湯低劑量、高劑量組作用于H22肝癌細(xì)胞，相對于模型對照組Survivin基因mRNA表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)；相對于模型對照組2(2=1)，低、高劑量組分別為模型對照組的79%和53%(如表1所示)，分別降低了21%和47%。說明貞術(shù)消積湯對Survivin基因轉(zhuǎn)錄有明顯的抑制作用。結(jié)果見表1。

表1 貞術(shù)消積湯對H22細(xì)胞Survivin mRNA表達(dá)的影響

3.4 對Survivin蛋白和STAT3蛋白表達(dá)的影響

Survivin和STAT3蛋白在H22細(xì)胞陽性信號均以胞質(zhì)為主，顆粒呈棕黃色。比較各組積分光密度(IOD)，結(jié)果見表2，模型對照組IOD平均值最高。貞術(shù)消積湯組隨劑量增加，STAT3和Survivin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，具有劑量依賴性；貞術(shù)消積湯組與模型對照組相比，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；高劑量組與低劑量相比，也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 貞術(shù)消積湯對H22細(xì)胞Survivin和STAT3蛋白的影響

注：與模型組相比，1)P<0.05，2)P<0.01;與貞術(shù)消積湯低劑量組相比，3)P<0.05。

4 討論

自噬是真核細(xì)胞中細(xì)胞器和部分細(xì)胞質(zhì)由雙層膜包裹，形成自噬體，并與內(nèi)涵體融合形成自噬內(nèi)涵體，最后與溶酶體融合形成自噬性溶酶體，并將包裹的內(nèi)容物降解的過程[11]。自噬是細(xì)胞維持自我平衡，保證細(xì)胞正常的分化和增殖，并在細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[12]。對腫瘤細(xì)胞而言，自噬既可起到保護(hù)性作用，也可起到殺傷作用。自噬的細(xì)胞死亡方式屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，也稱為自噬性程序性細(xì)胞死亡[13]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，H22肝癌細(xì)胞內(nèi)有大量自噬體和自噬溶酶體，說明藥物可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。

調(diào)控自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑很多，作為細(xì)胞中重要的信號分子，多種腫瘤細(xì)胞和組織中都能檢測到過度表達(dá)的STAT3與自噬水平的異常改變，并且發(fā)生在腫瘤病理變化的不同階段[14]。Siegelin等[15]用STAT3抑制劑(索拉非尼)作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，降低了細(xì)胞中的STAT3蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖。Su等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抑制肝癌細(xì)胞中STAT3的過表達(dá)可以抑制自噬。這都說明STAT3對腫瘤自噬具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。但也有學(xué)者認(rèn)為，STAT3對腫瘤自噬具有正性調(diào)節(jié)作用[17]。因此STAT3與腫瘤細(xì)胞自噬的關(guān)系存在爭議。本課題研究發(fā)現(xiàn)，貞術(shù)消積湯對STAT3信號通路有抑制作用，并抑制其下游Survivin基因表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。說明貞術(shù)消積湯可通過負(fù)性調(diào)節(jié)STAT/Surviivn信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。STAT3/Survivin信號通路不僅與自噬有關(guān)，與細(xì)胞凋亡也密切相關(guān)[18-19]。本課題組已證實(shí)鱉甲煎丸可以通過抑制STAT3信號通路誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡[20]。而自噬和凋亡之間不是孤立存在的，他們之間的關(guān)系包括：自噬為凋亡所需，自噬發(fā)生先于凋亡；自噬與凋亡相互拮抗；自噬與凋亡協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞死亡[21]。貞術(shù)消積湯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，如果增加劑量，是否會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡？凋亡與自噬是協(xié)同作用還是拮抗作用，針對這一問題，我們將進(jìn)一步深入研究。

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ExpenimentalStudyofZhenzhuXiaojiDecoctionInducingAutophagyviaSTAT3/SurvivinSignalPathwayinHepatomaCells

SUN Yang, WU Bo-yan*, SUN Min, WANG Yan-jie, CHE Yan-xin

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To explore the in vivo antitumor mechanism of Zhenzhu Xiaoji decoction by detecting the morphology changes of H22cells. Methods: Murine hepatocarcinoma cells were injected into ICR mice and then they were given Zhenzhu Xiaoji decoction once a day for ten continuous days. The changes of cell morphology were observed under light microscopy and transmission electron microscopy(TEM); the expression of Survivin mRNA was detected by RT- PCR; and the protein expressions of STAT3 and Survivin were observed by IHC. Results: Under light microscopy, cell lineage was sparse and lots of vacuoles were produced in tissues with the medication; under TEM, there were autophagosome and autolysosome in cells; the expression of Survivin, Survivin mRNA, and STAT3 were down-regulated in the medication group compared to the model control group. Conclusion: The in vivo antitumor effect of Zhenzhu Xiaoji decoction is probably related to inducing cell autophagy by inhibiting STAT3/Survivin signal pathway.

Zhenzhu Xiaoji decoction; H22Cell; Autophagy; STAT3; Survivin

R285.5

A

1002-2406(2017)06-0041-04

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(No.81704054);中國博士后科學(xué)基金資助項目(No.2014M551288)；黑龍江省博士后資助項目(No.LBH-Z13205)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年教師支持計劃(No.051234)

孫陽(1979-)，女，副教授，醫(yī)學(xué)博士，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)博士后在站，主要從事中醫(yī)藥抗腫瘤分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究工作。

吳勃巖*(1958-)，女，教授，主要從事中醫(yī)藥抗腫瘤分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究工作。

2017-05-03

修回日期：2017-05-30