陳哲，路娟，彭紀(jì)銘，2，柴瑞平，趙穎，王曉靜，2，陳曦*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

質(zhì)量工藝

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化紫檀茋納米混懸劑處方

陳哲1，路娟1，彭紀(jì)銘1，2，柴瑞平1，趙穎1，王曉靜1，2，陳曦1*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

目的：對(duì)紫檀茋納米混懸劑的處方及制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：采用反溶劑沉淀法制備紫檀茋納米混懸劑，以粒徑、多分散系數(shù)(PDI)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化紫檀茋納米混懸劑的處方，并對(duì)處方加以驗(yàn)證。 結(jié)果：通過(guò)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，用響應(yīng)面法預(yù)測(cè)最佳處方,所得處方為：紫檀茋的濃度為36 g/L，pluronic F68濃度 為2.2 g/L,?；悄懰徕c的濃度為3.0 g/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的紫檀茋納米混懸劑粒徑為(134.6±2.5)nm，PDI為(0.097±0.006)。體外溶出結(jié)果表明，紫檀茋的納米化促進(jìn)了其溶出速度。掃描電鏡觀察紫檀茋原料藥及紫檀茋納米混懸劑形態(tài)，可見紫檀茋納米混懸劑呈類球狀，且分布均勻。結(jié)論：Box-Behnken效應(yīng)面法能夠有效地優(yōu)化紫檀茋納米混懸劑處方，方法具有可行性。

Box-Behnken；效應(yīng)面法；紫檀茋；納米混懸劑

紫檀茋(Pterostilbene)是一種天然的非黃酮類多酚化合物，最早是在藍(lán)莓中發(fā)現(xiàn)的，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗缺血再灌注損傷的作用[1-3]。紫檀茋與白藜蘆醇分子結(jié)構(gòu)極其相似，互為同系衍生物，生物活性強(qiáng)于白藜蘆醇[1]。但紫檀茋為脂溶性化合物，其水溶性差這一問(wèn)題限制了其在臨床上的應(yīng)用。納米技術(shù)是藥物制劑領(lǐng)域一種比較成熟的技術(shù)[4],納米混懸劑是純的藥物納米粒子的膠態(tài)分散體系,該劑型不需要載體材料，通過(guò)表面活性劑穩(wěn)定體系，使用簡(jiǎn)單的工藝和處方改善難溶性藥物的生物利用度。Box-Behnken效應(yīng)面法是一種優(yōu)化試驗(yàn)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，傳統(tǒng)的優(yōu)化方法未考慮到試驗(yàn)的隨機(jī)誤差，而此方法對(duì)試驗(yàn)的隨機(jī)誤差也進(jìn)行了考察。同時(shí)Box-Behnken效應(yīng)面法建立了連續(xù)變量曲面模型，預(yù)測(cè)最佳方案，該方法科學(xué)合理，已被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[5-6]。本研究采用反溶劑沉淀法將紫檀茋制成納米混懸劑，通過(guò)Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測(cè)最佳處方。

1 試藥和儀器

1.1 試藥

紫檀茋購(gòu)于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司(批號(hào)0149449-131218000)；pluronic F68(綠葉生物，批號(hào)H25J7C9432)；?；悄懰徕c(Beijing Biotopped Science & Technology，批號(hào)20160517)；無(wú)水乙醇(北京化工廠)；SDS(Japan，批號(hào)20140105506)；蒸餾水(屈臣氏)。

1.2 儀器

Nano-ZS納米粒度及zeta電位分析儀(英國(guó)Malvern儀器公司)；Waters UPLC H-Class系統(tǒng)(含四元溶劑泵，自動(dòng)進(jìn)樣裝置，在線真空脫氣裝置，PDA檢測(cè)器，Empower2色譜工作站)；JSM-6510掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；磁力攪拌器(Barnstead Thermolyne)；FJ300-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；FD-1-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備方法

精密稱定紫檀茋溶于5 ml無(wú)水乙醇，pluronic F68和牛磺膽酸鈉溶于50 ml蒸餾水中，在3 000 r/min攪拌下緩慢滴加紫檀茋乙醇溶液，使其均勻分散在水相中，攪拌除去乙醇，制備得紫檀茋粗混懸劑。將粗混懸劑置于0℃冰水浴中，高速均質(zhì)，即得納米混懸液。

將得到的納米混懸液加入8%的甘露醇做凍干保護(hù)劑，溶解攪拌均勻，放入-80℃冰箱預(yù)凍24 h后，取出放置預(yù)冷0.5 h的冷凍干燥機(jī)中，凍干48 h，取出，即得納米混懸劑凍干粉。

2.2 單因素考察

2.2.1 均質(zhì)剪切速度對(duì)粒徑的影響

按“2.1”項(xiàng)下制備方法制備紫檀茋粗混懸劑，所得粗混懸劑分別在5 000 r/min，8 000 r/min，10 000 r/min，15 000 r/min，18 000 r/min均質(zhì)2 min，用Nano-ZS納米粒度及zeta電位分析儀測(cè)定平均粒徑。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示選用18 000 r/min的剪切速度制備納米混懸劑。結(jié)果見圖1。

圖1 均質(zhì)速度對(duì)粒徑的影響(n=3)

2.2.2 均質(zhì)時(shí)間對(duì)粒徑的影響

按“2.1”項(xiàng)下納米混懸劑制備方法制備粗混懸劑，分別于18 000 r/min下均質(zhì),在1 min，2 min，3 min，4 min，5 min取樣，用激光粒度分布儀測(cè)定平均粒徑。由表1所示，可見均質(zhì)2 min較均質(zhì)1 min所得的納米混懸劑粒徑有明顯減小，2 min后，納米混懸劑的粒徑變化較小，同時(shí)考慮到儀器使用注意事項(xiàng)要求實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)機(jī)連續(xù)工作時(shí)間要小于等于5 min，故選用均質(zhì)時(shí)間為2 min。

表1 均質(zhì)時(shí)間對(duì)粒徑的影響(n=3)

2.2.3 乙醇用量對(duì)粒徑的影響

分別將紫檀茋溶于1 ml，5 ml，10 ml無(wú)水乙醇中按“2.1”項(xiàng)下納米混懸劑制備方法制備粗混懸劑，在18 000 r/min下均質(zhì)2 min，得紫檀茋納米混懸劑，用激光粒度分布儀測(cè)定平均粒徑。由表2可知，乙醇用量越大，所得納米混懸劑的粒徑越小，綜合各因素折中后選擇5 ml無(wú)水乙醇溶解紫檀茋。

表2 乙醇用量對(duì)粒徑的影響(n=3)

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法處方優(yōu)化

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以紫檀茋的濃度(X1)，pluronic F68濃度(X2)和?；悄懰徕c的濃度(X3)為考察因素，以粒徑、多分散系數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)以上3個(gè)影響因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及水平值見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及水平值

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及響應(yīng)值

2.4 二次回歸方程的建立

2.5 方差分析和顯著性差異

表5 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

2.6 效應(yīng)面分析與優(yōu)化

使用Design-Expert8.05b軟件，根據(jù)回歸方程結(jié)果，選擇X2設(shè)為中心點(diǎn)值，考察X1、X3對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，并做出曲面圖(圖2)。根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行適當(dāng)范圍的限定，得到優(yōu)化后的處方為X1=36 g/L，X2=2.2 g/L，X3=3.0 g/L。

圖2 各因素對(duì)響應(yīng)值影響的三維效應(yīng)曲面圖

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

依據(jù)優(yōu)化后處方制備3個(gè)平行紫檀茋納米混懸劑，測(cè)定PDI(R1)和粒徑(R2),結(jié)果見表6及圖3。

表6 紫檀茋納米混懸劑的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值

圖3 紫檀茋納米混懸劑粒徑分布圖

2.8 HPLC 測(cè)定紫檀茋方法的建立

2.8.1 色譜條件

XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫0～8 min，45%等度；8～9 min，45%～70%；9～15 min，70%乙腈等度；15～16 min，70%～45%乙腈；16～20 min，45%等度；流速:0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.8.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取紫檀茋對(duì)照品10.24 mg置于10 ml容量瓶中，甲醇溶解，定容至10 ml，混勻，即得紫檀茋對(duì)照品母液。

2.8.3 供試品溶液的制備

取紫檀茋納米混懸劑凍干粉用蒸餾水溶解，精密量取1 ml加入透析袋中，以1%SDS磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)500 ml作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 rmp，溫度為37℃。在45 min取1 ml溶出介質(zhì)過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.8.4 專屬性考察

按處方比例制備空白制劑，按供試品溶液制備方法制備空白溶液，取1 ml過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)行高效液相色譜儀測(cè)定(色譜圖見圖4)?？瞻兹芤号c紫檀茋對(duì)照品未在同一保留時(shí)間出現(xiàn)色譜峰，可知空白輔料對(duì)紫檀茋的測(cè)定無(wú)干擾。

圖4 對(duì)照品(A)、空白對(duì)照(B)和供試品(C)HPLC色譜圖

2.8.5 線性關(guān)系考察

取“2.8.2”項(xiàng)下紫檀茋對(duì)照品母液，甲醇稀釋成0.17，0.25，0.51，1.02，2.56，5.12，10.24，15.36，20.48，25.60，35.84，46.08 μg/ml的系列濃度梯度的對(duì)照品溶液，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，紫檀茋的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)線性回歸，得回歸方程：Y=100 765X-41 146，r=0.999 6，結(jié)果表明紫檀茋在0.17～46.08 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.9 體外溶出測(cè)定

取紫檀茋納米混懸劑凍干粉、紫檀茋與輔料的物理混合物、紫檀茋原料藥適量用蒸餾水溶解(含紫檀茋約2 mg/ml)，精密量取1 ml加入透析袋中，以1%SDS磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)500 ml作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 rmp，溫度為37℃。分別在5 min，10 min，15 min，30 min，45 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h取1 ml溶出介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)加相同體積的新鮮的溶出介質(zhì)。將取出的溶出介質(zhì)過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，采用高效液相儀測(cè)定紫檀茋的濃度，計(jì)算累計(jì)溶出率。溶出曲線見圖5。

圖5 紫檀茋納米混懸劑，紫檀茋原料藥和物理混合物溶出曲線圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米混懸劑的在2 h時(shí)累計(jì)溶出率已達(dá)到68%，而物理混合物和原料藥均不到6%，8 h時(shí)納米混懸劑的累計(jì)溶出率達(dá)到平臺(tái)期。納米混懸劑粒徑較小，增大了藥物的表面積，故溶出速率得到較大提高，溶出速率的提高也有利于藥物在體內(nèi)吸收，提高藥物的生物利用度。

2.10 物理穩(wěn)定性考察

采用“2.1”項(xiàng)下制備工藝制備納米混懸液3個(gè)平行樣品，每個(gè)樣品分成兩份分別放置于室溫(25℃)和4℃保存7 d，觀察并測(cè)定納米混懸劑的粒徑變化，見表7。

表7 紫檀茋納米混懸劑物理穩(wěn)定性考察表

結(jié)果顯示，納米混懸劑在4℃條件下較在室溫放置下粒徑變化較小，PDI值均有所增大，但依舊小于0.200，說(shuō)明體系中的粒子有少量聚集現(xiàn)象。

2.11 形態(tài)觀察

2.11.1 紫檀茋原料藥形態(tài)觀察

稱取適量紫檀茋原料藥，用蒸餾水分散后，滴一滴溶液至硅片上，使其均勻平鋪，用濾紙吸取多余的液體，烘箱中30℃烘干后在掃面電鏡下觀察(圖6a)。

圖6 紫檀茋原料藥(a)和紫檀茋納米混懸劑(b)掃描電鏡圖

2.11.2 紫檀茋納米混懸劑形態(tài)觀察

取適量紫檀茋納米混懸劑，將其稀釋至適當(dāng)濃度，滴一滴至硅片上，使其均勻平鋪，用濾紙吸取多余液體，在烘箱中30℃烘干后在掃描電鏡下觀察(圖6b)。

通過(guò)對(duì)比紫檀茋原料藥與紫檀茋納米混懸劑掃描電鏡圖看出，紫檀茋納米混懸劑呈類球狀粒子，表面較光滑，分布均勻，大小均一。

3 討論

目前，難溶性藥物的溶解度低的問(wèn)題是藥物在臨床應(yīng)用過(guò)程中的一個(gè)瓶頸，如何通過(guò)改良劑型提高難溶性的生物利用度是藥劑學(xué)研究的關(guān)鍵點(diǎn)所在。納米混懸劑是一種通過(guò)表面活性劑的穩(wěn)定作用，將納米級(jí)的藥物顆粒均勻的分散在水中的穩(wěn)定的膠態(tài)分散體系。由于其藥物顆粒粒徑小，且分布均勻大大增加了藥物的溶解度，解決了難溶性藥物在水中溶解度差的問(wèn)題[7-9]。納米混懸劑的制備最重要的是表面活性劑的選擇和處方工藝的優(yōu)化。

納米混懸劑提高生物利用度的方式主要是由于納米混懸劑粒子粒徑小，比表面積大，這些特點(diǎn)使其對(duì)胃腸黏膜有更高的黏附性，促使藥物在胃腸道中滯留時(shí)間增長(zhǎng)，從而提高藥物的生物利用度。另外，納米混懸劑還可以通過(guò)改變粒子的粒徑大小或者對(duì)其表面進(jìn)行修飾起到靶向作用，目前腦靶向和肺靶向的藥物已經(jīng)比較成熟，達(dá)拉根納米混懸劑用吐溫-80和聚異丁基氰丙烯酸鹽進(jìn)行表面修飾，實(shí)現(xiàn)了腦靶向，用PEG對(duì)藥物離子進(jìn)行表面修飾后，可使在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，并在炎性部位富集[10]。

該實(shí)驗(yàn)首先考察了均質(zhì)剪切速度，剪切時(shí)間，以及乙醇用量單因素對(duì)納米混懸劑的粒徑和PDI的影響，結(jié)果為剪切速度為18 000 r/min，剪切時(shí)間為2 min，乙醇用量為5 ml。紫檀茋的濃度(X1)，pluronic F68濃度(X2)和?；悄懰徕c的濃度(X3)則采用Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)軟件進(jìn)行分析，該試驗(yàn)方法與正交實(shí)驗(yàn)相比，更加全面地對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)其可預(yù)測(cè)未做過(guò)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這是Box-Behnken效應(yīng)面法在藥劑學(xué)中廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要原因[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)該方法篩選出最佳處方及工藝，并加以驗(yàn)證，為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究提供了研究基礎(chǔ)。

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OptimizedtheFormulationofPterostilbeneNanosuspensionbyBox-BehnkenDesign-ResponseSurfaceMethodology

CHEN Zhe1, LU Juan1, PENG Ji-ming1,2, CHAI Rui-ping1, ZHAO Ying1, WANG Xiao-jing1,2, CHEN Xi1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100193,China;2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective:To optimize the formulation and preparation technique of Pterostilbene nanosuspension. Methods:Pterostilbene nanosuspension was prepared by anti-solvent precipitation. Its formulation was testified and optimized by Box-Behnken design-response surface methodology, with average particle size and polydispersion index(PDI) as the indexes. Results:The model was fitted to the experimental data by software, and the best formulation was predicted by response surface method. The optimal formulation was as follows: the concentration of Pterostilbene, pluronic F68 and sodium cholytaurine were 36 g/L, 2.2 g/L, and 3.0 g/L respectively. The average particle size was(134.6±2.5)nm and PDI was(0.097±0.006). It showed that nanosuspension of Pterostilbene could improve its dissolution rate notably. Scanning electron microscope was used to observe the morphology of crude Pterostilbene and Pterostilbene nanosuspension, and Pterostilbene nanosuspension showed a near-spherical shape and evenly distributed. Conclusion:Box-Behnken design-response surface methodology can optimize the formulation of Pterostilbene nanosuspension effectively. The results proved the feasibility of this method.

Box-Behnken; Response surface methodology; Pterostilbene; Nanosuspension

R28

A

1002-2406(2017)06-0014-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81673667)；國(guó)家重大科技專項(xiàng)(No.2014ZX09201022-006)；云南省中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目(No.2013HB099)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助(No.2016-I2M-015)

陳哲(1991-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向：中藥藥理。

陳曦*(1973-)，男，副研究員，主要研究方向：中藥藥理與毒理。

2016-12-29

修回日期：2017-01-15