侯祥位+陳立俠

【摘要】 目的：探討Rap1蛋白卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)及其在漿液性癌細(xì)胞增殖中的作用。方法：對(duì)筆者所在醫(yī)院2015年4月-2017年4月手術(shù)切除的卵巢標(biāo)本資料實(shí)施統(tǒng)計(jì)分析，其中20份為漿液性卵巢癌組織標(biāo)本，良性腫瘤組織標(biāo)本10份。另對(duì)同期手術(shù)切除的正常卵巢組織標(biāo)本10份的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、Western blot檢測(cè)，設(shè)計(jì)siRNA靶序列，構(gòu)建靶向Rap1 的siRNA 真核表達(dá)載體，建立SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，然后對(duì)卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達(dá)、SKOV3細(xì)胞增殖受Rap1基因下調(diào)的影響進(jìn)行分析。結(jié)果：卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達(dá)線顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Rap1組細(xì)胞的增殖速度顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont組細(xì)胞的增殖速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達(dá)較高，其會(huì)對(duì)漿液性癌細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制。

【關(guān)鍵詞】 卵巢漿液性癌組織； Rap1蛋白表達(dá)； 漿液性癌細(xì)胞增殖； 作用

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.25.028 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2017）25-0055-02

為了將漿液性癌細(xì)胞增殖中Rap1蛋白表達(dá)的作用闡明，本研究對(duì)卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達(dá)進(jìn)行了比較，同時(shí)將Rap1 shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建了起來(lái)，在此過(guò)程中將RNA干擾技術(shù)充分利用了起來(lái)，并建立了SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選，對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖能力（Rap1表達(dá)缺失）的變化進(jìn)行檢測(cè)，在此過(guò)程中運(yùn)用MTT法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

對(duì)筆者所在醫(yī)院2015年4月-2017年4月手術(shù)切除的卵巢標(biāo)本的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均具有完整的臨床病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：將合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、術(shù)前接受放化療治療等卵巢癌患者排除在外。其中20份為液性卵巢癌組織標(biāo)本，良性腫瘤組織標(biāo)本10份。另對(duì)同期手術(shù)切除的正常卵巢組織標(biāo)本10份的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有標(biāo)本均以子宮肌瘤為原發(fā)病。切除離體后的標(biāo)本第一時(shí)間放置在液氮中保存?zhèn)溆?。病理科醫(yī)師閱片對(duì)所有標(biāo)本的病理診斷進(jìn)行證實(shí)。采用筆者所在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心提供的感受態(tài)宿主菌大腸桿菌DH-5α，購(gòu)買(mǎi)美國(guó)Oligo-engine公司生產(chǎn)的pSUPER.retro.neo/GFP（Empty）真核表達(dá)載體，GFP、Neo、Amp分別為綠色熒光標(biāo)記、真核篩選基因（G418）、氨芐抗性基因。EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ為酶切位點(diǎn)，含H1啟動(dòng)子。購(gòu)買(mǎi)重慶醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室提供的卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3。本課題組在前期工作中已經(jīng)將陰性質(zhì)粒（NT）、空載體（Empty）建立了起來(lái)。購(gòu)買(mǎi)寶生物工程（大連） 有限公司生產(chǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、兔抗Rap1單克隆抗體，美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，美國(guó)Progema公司生產(chǎn)的T4DNA連接酶，HyClone公司生產(chǎn)的胎牛血清、RPM1640培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)培養(yǎng)SKOV3-Rap1-RNAi 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（Rap1i-1）、SKOV3細(xì)胞野生型（WT）、陰性質(zhì)粒（NT.cont）、空載體（Empty）轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，位置為RPM1640培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)[1]。

1.2.2 Western blot檢測(cè) 將總蛋白提取出來(lái)，途徑為對(duì)各組組織及細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，然后進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）前將60μg總蛋白從每個(gè)上樣孔取出來(lái)，轉(zhuǎn)膜，ECI顯色前孵育，孵育過(guò)程中將抗體充分利用起來(lái)。成像過(guò)程中將凝膠成像儀充分利用起來(lái)，然后將各組蛋白條帶的灰度值計(jì)算出來(lái)，計(jì)算過(guò)程中將Quantity One圖像分析軟件充分利用起來(lái)。蛋白相對(duì)表達(dá)量=蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參灰度值[2]。

1.2.3 設(shè)計(jì)siRNA靶序列 對(duì)人Rap1基因全序列（NM_001010935.1）全長(zhǎng)序列進(jìn)行檢索，檢索過(guò)程中將GenBank充分利用起來(lái)，將3對(duì)Rap1 siRNA序列設(shè)計(jì)出來(lái)，Rap1 shRNA1基因序列為5-GATCCCCTGCCAACAGTGTATGCTCGTTCAAGAGACGAGCATACACTGTTGGCATTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA2基因序列為5-GATCCCCGATGAGCGAGTAGTTGGCATTCAAGAGATGCC-AACTACTCGCTCATCTTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA3基因序列為5GATCCCCAGTGGTGTAACTGTGCCTTTTCAAGAGAAAGGCACAGTTACACCACTTTTTTGGAAA-3。其含19 nt，設(shè)計(jì)過(guò)程中將Oligoengine RNAi設(shè)計(jì)軟件充分利用起來(lái)，并對(duì)siRNA設(shè)計(jì)原則進(jìn)行嚴(yán)格遵循，合成主體為invitrogen[3]。

1.2.4 構(gòu)建靶向Rap1 的siRNA 真核表達(dá)載體 將正義鏈、反義鏈退火，其由化學(xué)合成，將良好的前提條件提供給shRNA表達(dá)模板的形成，連接pSUPER.retro.neo/GFP 質(zhì)粒，其經(jīng)BglⅡ、HindⅢ雙酶切后線性化，然后向感受態(tài)宿主菌大腸桿菌DH-5α轉(zhuǎn)化，將質(zhì)粒提取出來(lái)，雙酶切重組質(zhì)粒，在此過(guò)程中將限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ充分利用起來(lái)，37 ℃水浴4 h，之后電泳分析，在此過(guò)程中將1%瓊脂糖凝膠充分利用起來(lái)。向invitrogen送往進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定前保證質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定成功[4]。endprint

1.2.5 建立SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞取出來(lái)，細(xì)胞滿意度達(dá)70%～80%后轉(zhuǎn)染，同時(shí)將多個(gè)單克隆細(xì)胞篩選制備出來(lái)，在此過(guò)程中將G418充分利用起來(lái)，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，將Rap1具有最顯著沉默效果的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選出來(lái)前將總蛋白提取出來(lái)，在此過(guò)程中將免疫印跡篩選出來(lái)[5]。

1.2.6 MTT試驗(yàn) 將200 μl細(xì)胞懸液取出來(lái)，有2000個(gè)細(xì)胞存在于每孔，向96孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接種，每組5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)將空白孔設(shè)立出來(lái)調(diào)零，共將7個(gè)培養(yǎng)板接種出來(lái)，在孵箱中放置進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。接種細(xì)胞，一周內(nèi)每天取1個(gè)96孔板，加入20μl的5mg/ml 噻唑藍(lán)（MTT）溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置進(jìn)行4 h的孵育，將培養(yǎng)終止，將孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)上清液小心吸棄，在此過(guò)程中將1 ml注射器充分利用起來(lái)。將150 μl二甲亞砜（DMSO）再加入到每孔中，進(jìn)行10 min的振蕩，對(duì)結(jié)晶物進(jìn)行充分溶解。將570 nm波長(zhǎng)選取出來(lái)，對(duì)各孔光密度值進(jìn)行測(cè)定，位置為酶標(biāo)儀，并將結(jié)果詳細(xì)記錄下來(lái)，將縱坐標(biāo)設(shè)定為光密度值，將橫坐標(biāo)設(shè)定為時(shí)間，將細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制出來(lái)[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達(dá)比較

卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達(dá)為（1.190±0.062）%，顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織的（0.613±0.080）%、（0.402±0.052）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具體見(jiàn)圖1。

2.2 SKOV3細(xì)胞增殖受Rap1基因下調(diào)的影響

Rap1組細(xì)胞的增殖速度為（1.5±0.2），顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細(xì)胞的0、（1.0±0.2）、（0.9±0.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont組細(xì)胞的增殖速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2。

3 討論

在婦科惡性腫瘤病死率中，卵巢癌位居首位，對(duì)婦女的健康及生命造成了嚴(yán)重威脅[7]。在腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)通路發(fā)揮著不同的作用，Rap1屬于類(lèi)Ras家族成員，是一種分子開(kāi)關(guān)，在細(xì)胞增殖、形態(tài)發(fā)生等多種信號(hào)通路中參與對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)[8]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明，Rapl活性一旦失調(diào)，惡性腫瘤就會(huì)發(fā)生發(fā)展，同時(shí)Rapl有細(xì)胞特異性功能，比如，對(duì)NIH3T3細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞（Ras轉(zhuǎn)染）增殖進(jìn)行抑制，但是卻為Swiss3T3細(xì)胞DNA合成提供良好的前提條件，促進(jìn)細(xì)胞增殖速度的加快[9-11]。本研究結(jié)果表明，卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達(dá)線顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Rap1組細(xì)胞的增殖速度顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明Rap1蛋白卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)較高，其會(huì)抑制漿液性癌細(xì)胞增殖，值得臨床充分重視。

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（收稿日期：2017-05-15）endprint