楊云喬+鄭建高+姜軍華+黃旭偉+湯里平+尚秋辰+謝鑫峰+張友敏+金文杰+許小琴

摘要：選取12～20日齡感染流行性腹瀉病毒腹瀉豬，采用復(fù)方中藥和西藥抗生素進(jìn)行臨床治療，治療結(jié)束后取胃底部、十二指腸中段、空腸中段、回腸中段和結(jié)腸中段，通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡和透射電鏡對(duì)比觀察消化道病變；取回腸，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)琥珀酸脫氫酶、單胺氧化酶、5′-核苷酸酶和Na+-K+-ATP酶活性變化。場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察結(jié)果表明，中藥治療豬未見(jiàn)異常，西藥治療豬十二指腸黏膜表面見(jiàn)少量黏附的大腸桿菌。透射電鏡觀察結(jié)果表明，中藥治療豬細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，無(wú)嚴(yán)重細(xì)胞損傷，但細(xì)胞微絲管、骨架等結(jié)構(gòu)不如健康豬清晰；西藥治療豬消化道可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體斷裂，核形態(tài)和核染色質(zhì)異常。琥珀酸脫氫酶、單胺氧化酶和Na+-K+-ATP酶檢測(cè)結(jié)果均為中藥治療豬酶活性顯著高于西藥治療豬。由結(jié)果可以推測(cè)，復(fù)方中藥治療豬流行性腹瀉的良好效果可能與保護(hù)線(xiàn)粒體、穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、調(diào)整酶活性和抗繼發(fā)感染有關(guān)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉；復(fù)方中藥；消化道黏膜；電鏡觀察；琥珀酸脫氫酶；單胺氧化酶；Na+-K+-ATP酶

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0159-05

通信作者，許小琴，博士，教授，主要從事中獸醫(yī)學(xué)相關(guān)研究。E-mail：xuxq@yzu.edu.cn。豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，簡(jiǎn)稱(chēng)PED）是豬病毒性腹瀉病，可引起仔豬高死亡率、成年豬掉膘和飼料報(bào)酬率降低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)PED的防治主要通過(guò)接種疫苗、注射卵黃抗體和應(yīng)用傳統(tǒng)西藥，但效果較差，因此，應(yīng)用中藥治療PED成為熱門(mén)的研究方向。筆者所在實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果（未見(jiàn)刊）表明，中藥治療組平均442 d治愈，治愈率達(dá)86.67%，復(fù)發(fā)率為0，體質(zhì)量最大下降0.59%，11 d增質(zhì)量22.44%；西藥對(duì)照組平均4.91 d治愈，治愈率達(dá)84.61%，復(fù)發(fā)率為7.69%，體質(zhì)量最大下降508%，與中藥組相比差異性極顯著（P<0.01），11 d增質(zhì)量20.94%，證實(shí)復(fù)方中藥治療可使豬群在PED疫情出現(xiàn)時(shí)較西藥療法掉膘少、恢復(fù)快、復(fù)發(fā)率低和增質(zhì)量迅速穩(wěn)定，從而減少養(yǎng)殖損失，本試驗(yàn)將探究其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1藥物、試劑和儀器中藥材：80 g白頭翁、80 g黃芩、50 g秦皮、60 g黨參、50 g蒼術(shù)、30 g甘草、40 g當(dāng)歸、50 g肉桂、50 g厚樸、60 g訶子、50 g山楂，均購(gòu)自江蘇省溧陽(yáng)市時(shí)珍中醫(yī)藥有限公司。

慶大霉素、環(huán)丙沙星、乙酰甲喹、林可霉素，均購(gòu)自上海公誼獸藥廠。

抗體試劑：Mouse/Porcine 5′-Nucleotidase/CD73 Affinity Purified PAb（25 μg）、Donkey Anti-Sheep IgG HRP Affinity Purified PAb（1 mL），均購(gòu)自美國(guó)R&D Systems Inc；ANTI-Na+/K+ATPASE，α1 50 μg，購(gòu)自德國(guó)達(dá)姆施塔特默克集團(tuán)；Mouse IHC Kit[免疫組化試劑盒（一抗小鼠來(lái)源）]、Rabbit IHC Kit[免疫組化試劑盒（一抗兔來(lái)源）]，均購(gòu)自中國(guó)福麥斯生物技術(shù)有限公司；琥珀酸脫氫酶復(fù)合體B亞基抗體（SDHB Antibody）（FL-280）、單胺氧化酶A/B抗體（MAO-A/B Antibody）（H-50），均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

儀器：RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、13395H2X顯微鏡和EM CPD300全自動(dòng)臨界點(diǎn)干燥儀，均購(gòu)自德國(guó)萊卡集團(tuán)；108Auto高性能離子濺射儀，購(gòu)自英國(guó)Cressington Scientific Instruments Ltd；S-4800II場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，購(gòu)自日本日立集團(tuán)；CM100透射電子顯微鏡，購(gòu)自荷蘭飛利浦集團(tuán)；101C-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；BCD-290 W冰箱，購(gòu)自中國(guó)海爾集團(tuán)。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物選擇江蘇省溧陽(yáng)市某豬場(chǎng)仔豬按常規(guī)免疫程序接種疫苗的12～20日齡腹瀉仔豬，取肛門(mén)拭子經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，豬流行性腹瀉病毒檢出率為40%，豬輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒均為陰性。

選擇1頭江蘇省儀征市某無(wú)腹瀉疾病流行史豬場(chǎng)23日齡健康仔豬，取肛門(mén)拭子經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，豬流行性腹瀉病、豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒均為陰性，作為健康對(duì)照豬。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1分組和用藥情況從溧陽(yáng)市該豬場(chǎng)取56頭腹瀉仔豬按同窩，以及質(zhì)量、日齡相近的原則分成2組，其中30頭用中藥治療，26頭用西藥治療。復(fù)方中藥加水煎煮2次合并濾液濃縮到 1 000 mL 后灌服，0.75 mL/kg，2次/d，使用前加熱至25～30 ℃；西藥則肌肉注射0.75 mL/kg慶大霉素、0.75 mL/kg 林可霉素、0.15 mL/kg乙酰甲喹（豬場(chǎng)獸醫(yī)習(xí)慣用法）。

1.2.2采樣方法各取1頭經(jīng)過(guò)中藥治療和西藥治療5 d后基本痊愈的豬[治療前豬流行性腹瀉病毒（PEDV）檢測(cè)呈陽(yáng)性]，另取1頭治療失敗的豬（治療前PEDV檢測(cè)呈陽(yáng)性，西藥治療5 d后改用中藥治療3 d，病情未出現(xiàn)好轉(zhuǎn)）和1頭健康的豬，放血撲殺解剖。每頭豬各取胃底部、十二指腸中段、空腸中段、回腸中段和結(jié)腸中段，用4 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈腸道內(nèi)容物和黏膜面上的黏液，隨后用雙面刀片切成1 mm×1 mm大小的樣品，用2.5%戊二醛固定，供電鏡觀察。每頭豬取回腸中段2 cm，用10%中性福爾馬林固定并制成蠟塊，供免疫組化檢測(cè)。

1.2.3場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察黏膜組織經(jīng)PBS清洗后，乙醇梯度脫水、臨界點(diǎn)干燥、粘樣、噴金，置于S-4800Ⅱ場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡上觀察腸道黏膜上皮細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)。endprint

1.2.4透射電鏡觀察黏膜組織經(jīng)PBS清洗后，經(jīng)鋨酸固定、清洗、脫水、包埋、切片、染色，用透射電鏡CM-100（80 kV）觀察腸道黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷變化。

1.2.5免疫組化二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色檢測(cè)消化道酶的含量變化組織制成蠟塊后進(jìn)行切片、常規(guī)脫蠟、滅活、抗原修復(fù)、加一抗、加二抗、DAB顯色，每張切片設(shè)未加一抗的陰性對(duì)照。從每張切片中選取5個(gè)典型視野并拍照，用Image-Pro Plus 5.0.1圖像分析系統(tǒng)對(duì)指定檢測(cè)的酶進(jìn)行定量分析，結(jié)果以平均光密度值（MOD）表示。

抗體條件：琥珀酸脫氫酶復(fù)合體B亞基檢測(cè)，一抗選用200倍稀釋的SDHB Antibody（FL-280），二抗和DAB顯色系統(tǒng)選用Rabbit IHC Kit[免疫組化試劑盒（一抗兔來(lái)源）]。單胺氧化酶檢測(cè)，一抗選用100倍稀釋的MAO-A/B Antibody（H-50），二抗和DAB顯色系統(tǒng)選用Rabbit IHC Kit[免疫組化試劑盒（一抗兔來(lái)源）]。5′-核苷酸酶檢測(cè)，一抗選用300倍稀釋的Mouse/Porcine 5′-Nucleotidase/CD73 Affinity Purified PAb（25 μg），二抗選用400倍稀釋的Donkey Anti-Sheep IgG HRP Affinity Purified PAb（1 mL），DAB顯色系統(tǒng)選用Rabbit IHC Kit[免疫組化試劑盒（一抗兔來(lái)源）]。Na+-K+-ATP酶檢測(cè)，一抗選用300倍稀釋的ANTI-NA+/K+ATPASE，α1 50 μg，二抗和DAB顯色系統(tǒng)選用Mouse IHC Kit[免疫組化試劑盒（一抗小鼠來(lái)源）]。

1.3數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異性顯著。

2結(jié)果與分析

2.1場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察結(jié)果

中藥治療豬：消化道黏膜未見(jiàn)異常損傷，腸黏膜細(xì)胞微絨毛長(zhǎng)度一致，排列整齊、均勻、致密（圖1-a、圖2-a）。

西藥治療豬：十二指腸黏膜微絨毛頂端出現(xiàn)不同程度的膨大，黏膜面偶見(jiàn)少量大腸桿菌，單個(gè)或成團(tuán)。空腸黏膜微絨毛略為稀疏，其他未見(jiàn)異常（圖1-b、圖2-b）。

治療失敗豬：胃黏膜上皮細(xì)胞短棒狀微絨毛和小隆起消失。十二指腸黏膜微絨毛頂端出現(xiàn)不同程度的膨大。空腸微絨毛雖沒(méi)西藥治療豬空腸微絨毛稀疏，但是微絨毛頂端分叉、膨大，而且黏液較多。回腸黏膜上覆蓋著大量大腸桿菌（圖1-c）。結(jié)腸黏膜有損傷，隱窩數(shù)量減少，隱窩凹陷加深、直徑增大（圖2-c）。

健康豬：和中藥治療豬類(lèi)似，消化道黏膜未見(jiàn)異常損傷，腸黏膜細(xì)胞微絨毛長(zhǎng)度一致，但細(xì)節(jié)較多，黏膜表面結(jié)構(gòu)更為清晰（圖1-d、圖2-d）。

2.2透射電鏡觀察結(jié)果

中藥治療豬：胃黏膜細(xì)胞無(wú)明顯病變，膜結(jié)構(gòu)清晰，核形態(tài)正常。十二指腸黏膜細(xì)胞微絨毛排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，長(zhǎng)度一致，微絨毛基底清晰完整，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病變?？漳c和回腸黏膜細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)區(qū)分性良好，細(xì)胞核多呈圓形，細(xì)胞核多呈圓形，細(xì)胞微絲管、骨架等結(jié)構(gòu)清晰度優(yōu)于西藥治療豬，但偶見(jiàn)巨噬細(xì)胞，少量線(xiàn)粒體出現(xiàn)損傷。中藥治療豬結(jié)腸出現(xiàn)黑色泡狀物體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊貼細(xì)胞核，膜結(jié)構(gòu)清晰完整。

西藥治療豬：胃無(wú)明顯病變。十二指腸上皮細(xì)胞偶見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂?？漳c和回腸偶見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、間隙增寬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體出現(xiàn)斷裂，核形態(tài)和核染色質(zhì)異常。結(jié)腸偶見(jiàn)核膜不清晰和染色質(zhì)異常。

治療失敗豬：胃黏膜細(xì)胞表面凸起脫落，黏膜損傷嚴(yán)重。胞內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體，線(xiàn)粒體形態(tài)不規(guī)則、崩解，核糖體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，核呈多形性，出現(xiàn)巨核、雙核、多核或奇異形的核，核膜完整性降低。十二指腸黏膜細(xì)胞微絨毛偶見(jiàn)損傷，胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊，底部可見(jiàn)大量線(xiàn)粒體聚集，部分線(xiàn)粒體出現(xiàn)破裂，下層胞內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體，膜結(jié)構(gòu)完整性降低，胞間出現(xiàn)融合現(xiàn)象?？漳c黏膜細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)典型冠狀病毒顆粒，直徑120 nm（圖3-a，箭頭所示），呈圓形、橢圓形或梭形，纖突長(zhǎng)而稀疏，有1個(gè)電子透明中心，同時(shí)可見(jiàn)未組裝成熟的病毒粒子，微絨毛變短、散亂、脫落，基底完整性差（圖3-b），細(xì)胞膜出現(xiàn)斷裂，胞內(nèi)出現(xiàn)多量空泡，偶見(jiàn)大量黑色顆粒聚集，圍繞細(xì)胞核或在核旁一側(cè)，組織深層可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，并有大量漿細(xì)胞和少量嗜酸粒細(xì)胞?；啬c細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮、核碎裂（圖4-a），微絨毛上黏附大量大腸桿菌（圖4-b），黏膜面可見(jiàn)吞噬細(xì)胞。結(jié)腸黏膜細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷、破碎，胞內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體，微絨毛稀疏、變短，并出現(xiàn)分泌腺泡損傷。

健康豬：胃黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞內(nèi)微絲管、細(xì)胞骨架比其他3頭豬多，核多呈圓形、橢圓形或梭形。十二指腸黏膜細(xì)胞下層線(xiàn)粒體數(shù)量較多，細(xì)胞內(nèi)微絲管、細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)較其他3頭豬明顯?？漳c和回腸黏膜細(xì)胞線(xiàn)粒體大小相近，無(wú)線(xiàn)粒體腫脹現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)多種膜結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，核膜完整，核大小相近，微絨毛排列緊密一致，基底部完整性良好。結(jié)腸未見(jiàn)異常。

2.3免疫組化DAB顯色檢測(cè)回腸多種酶含量的變化

由表1可知，各組4種酶活性均有不同程度的變化，且所有陰性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，簡(jiǎn)稱(chēng)SDH）主要表達(dá)在黏膜下層基底部，細(xì)胞漿內(nèi)偶見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)（圖5），健康豬的琥珀酸脫氫酶活性高于中藥治療豬，兩者差異不顯著，中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的琥珀酸脫氫酶活性依次遞減，且健康豬、中藥治療豬與西藥治療豬、治療失敗豬之間的酶活性差異顯著（P<005）。單胺氧化酶主要表達(dá)在黏膜下層基底部，細(xì)胞漿內(nèi)偶見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)，健康豬的單胺氧化酶活性高于中藥治療豬，兩者差異不顯著，中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的單胺氧化酶活性依次遞減，且健康豬、中藥治療豬與西藥治療豬、治療失敗豬之間的酶活性差異極顯著（P<0.01）。5′-核苷酸酶主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，健康豬、中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的5′-核苷酸酶活性依次遞減，組間差異不顯著。Na+-K+-ATP酶主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)， 細(xì)胞膜表達(dá)量表1復(fù)方中藥和西藥治療流行性腹瀉病毒感染豬的回腸多種酶活性（MOD）變化情況endprint

較少。健康豬、中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的 Na+-K+-ATP酶活性依次遞減，且健康豬、中藥治療豬與西藥治療豬、治療失敗豬之間的酶活性差異極顯著（P<0.01）。

3討論

PEDV感染細(xì)胞后，利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行復(fù)制活動(dòng)，細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：核染色質(zhì)增多、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核蛋白顆粒和核糖體數(shù)量增加、細(xì)胞活力和功能增強(qiáng)，以維護(hù)自身系統(tǒng)代謝所需。隨著疾病發(fā)展，病毒對(duì)宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷，出現(xiàn)核濃縮、核碎裂等病理形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)腸黏膜損傷，微絨毛變短、斷裂、散亂，基底完整性降低，線(xiàn)粒體腫脹、溶解、崩解、破裂、脊結(jié)構(gòu)模糊或消失。遇秀玲等的研究結(jié)果表明，PEDV病毒粒子存在于胞漿內(nèi)而不是核內(nèi)[1]。趙珊珊的研究表明，豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）強(qiáng)毒株導(dǎo)致IPEC-J2細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重病變，廣泛引起細(xì)胞微絨毛散亂、脫落、部分膨大形成蘑菇化，細(xì)胞微結(jié)構(gòu)和骨架散亂、消失，細(xì)胞內(nèi)部線(xiàn)粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等雙層膜結(jié)構(gòu)消失而出現(xiàn)空泡狀或“U”形的單層膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核體積變大、內(nèi)外核膜分離、核固縮[2]。高君愷的研究表明，PEDV感染豬小腸上皮細(xì)胞后可影響微絲管等細(xì)胞骨架，影響相鄰細(xì)胞的緊密連接[3]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究的結(jié)果一致。

根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室此前的研究結(jié)果（尚未發(fā)表），取經(jīng)腹腔注射大腸桿菌O101株后急性死亡的小鼠小腸組織進(jìn)行掃描電鏡觀察，可見(jiàn)小腸絨毛上皮細(xì)胞嚴(yán)重剝落，基底部暴露，損傷嚴(yán)重；取自然感染犬細(xì)小病毒后急性死亡的幼犬小腸進(jìn)行掃描電鏡觀察，同樣可見(jiàn)上述類(lèi)似病理變化。本試驗(yàn)未出現(xiàn)類(lèi)似病變，而且腸微絨毛也有較為完整的區(qū)域，掃描電鏡下可見(jiàn)微絨毛頂端雖有損傷但長(zhǎng)度和其他組相比無(wú)明顯縮短，推測(cè)可能是由于治療失敗組的豬解剖時(shí)已經(jīng)是出現(xiàn)腹瀉癥狀的第8天，屬于轉(zhuǎn)歸期，而且經(jīng)過(guò)中藥治療，方劑的君藥白頭翁具有一定的黏膜修復(fù)作用[4]，因此腸黏膜損傷情況可以得到減緩，或損傷的黏膜細(xì)胞已經(jīng)重新長(zhǎng)出。另外，一般來(lái)說(shuō)豬流行性腹瀉引起仔豬病變僅限于小腸[5]，且沒(méi)有直接證據(jù)證明PEDV亞洲株病毒可以在結(jié)腸中復(fù)制[6]。但本試驗(yàn)中，治療失敗豬的結(jié)腸中同樣存在著嚴(yán)重的病變。這可能是因?yàn)橹委熓∝i病程較長(zhǎng)，消化酶活性的降低和脫落的黏膜細(xì)胞及內(nèi)容物腐敗發(fā)酵，腸腔內(nèi)pH值和濃度發(fā)生改變，當(dāng)變質(zhì)的內(nèi)容物流經(jīng)并持續(xù)刺激結(jié)腸時(shí)，即引起結(jié)腸黏膜損傷。中藥治療豬的腸黏膜細(xì)胞器病理?yè)p傷情況以及細(xì)胞微絲管、骨架等結(jié)構(gòu)清晰度優(yōu)于西藥治療豬，但不如健康豬，可推測(cè)中藥治療豬預(yù)后良好，完全康復(fù)還需一段時(shí)間，而西藥治療豬有復(fù)發(fā)的可能。

琥珀酸脫氫酶在真核生物中結(jié)合于線(xiàn)粒體內(nèi)膜，可為真核細(xì)胞線(xiàn)粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，其比活性可以反映細(xì)胞氧化磷酸化供能情況，是三羧酸循環(huán)運(yùn)行的評(píng)價(jià)指標(biāo)，即SDH活性越高，線(xiàn)粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的能力越強(qiáng)[7-10]。消化道是機(jī)體重要的器官，體積大，血管網(wǎng)絡(luò)豐富，集分泌、肌肉運(yùn)動(dòng)、消化、吸收等物質(zhì)交換活動(dòng)和免疫功能于一體，所需能量要求較高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，琥珀酸脫氫酶復(fù)合體B亞基蛋白主要表達(dá)在黏膜下層基底部，細(xì)胞漿內(nèi)偶見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)，健康豬的酶活性高于中藥治療豬，兩者差異不顯著，中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的琥珀酸脫氫酶活性依次遞減，且健康豬、中藥治療豬與西藥治療豬、治療失敗豬之間的酶活性差異顯著（P<0.05）。可知，仔豬感染PEDV后回腸ATP產(chǎn)能降低，治療后有所好轉(zhuǎn)。中藥治療豬回腸SDH活性比西藥治療豬高，這可能與復(fù)方中藥具有線(xiàn)粒體保護(hù)作用有關(guān)。

生物體內(nèi)的單胺系含有苯乙胺結(jié)構(gòu)的化合物。主要有多巴胺、5-羥色胺、去甲腎上腺素、β-苯乙胺、腎上腺素和酪氨酸等，它們?cè)S多都具有較強(qiáng)的生理活性。單胺氧化酶可使多種胺類(lèi)氧化脫氨，從而具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)胺濃度的功能。MAO廣布于體內(nèi)多種組織器官，尤以肝、腎、胃和小腸中含量最多[11-15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，健康豬的MAO活性高于中藥治療豬，兩者差異不顯著，中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的MAO活性依次遞減，且健康豬、中藥治療豬與西藥治療豬、治療失敗豬之間的酶活性差異極顯著（P<0.01）。治療失敗豬和西藥治療豬回腸MAO活性極顯著低于健康豬，導(dǎo)致單胺類(lèi)物質(zhì)體內(nèi)聚集過(guò)多，出現(xiàn)精神和生理的異常，如狂躁、精神緊張、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)紊亂等現(xiàn)象[16-17]，造成耗能過(guò)多，影響治療。

Na+-K+-ATP酶是存在于細(xì)胞及細(xì)胞器生物膜上的一種蛋白酶，它能夠水解ATP為二磷酸腺苷（ADP），釋放磷酸基而產(chǎn)生能量。Na+-K+-ATP酶在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、維持細(xì)胞膜的完整及組織代謝等方面具有重要作用，可作為代謝紊亂和損傷組織恢復(fù)能力評(píng)價(jià)的可靠指標(biāo)。腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整很大程度上依賴(lài)Na+-K+-ATP酶來(lái)維持，因此，腸黏膜細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性亦能間接反映腸黏膜的屏障功能。仝鋼等用TGEV感染豬小腸黏膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)攻毒組Na+-K+-ATP酶活性與對(duì)照組相比顯著降低[18]。張貴海發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性下降從而提高侵襲力[19]。范穎等認(rèn)為，黃芪、黃芪黃酮及含黃芪黃酮的有效部位能夠降低糖尿病大鼠的血糖，其機(jī)制可能與改善Na+-K+-ATP酶活性、上調(diào)一磷酸腺苷依賴(lài)的蛋白激酶（AMPK）水平及蛋白表達(dá)有關(guān)[20]。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Na+-K+-ATP酶α1亞蛋白主要在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞膜表達(dá)量較少，健康豬、中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的Na+-K+-ATP酶活性依次遞減，且健康豬、中藥治療豬與西藥治療豬、治療失敗豬之間的酶活性差異極顯著（P<0.01），結(jié)合場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡結(jié)果，表明中藥治療PEDV感染豬可通過(guò)調(diào)整Na+-K+-ATP酶活性、穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)以發(fā)揮作用。因此，中藥治療豬出現(xiàn)良好的抗繼發(fā)感染效果，西藥治療豬則無(wú)此作用，復(fù)發(fā)和繼發(fā)感染的概率較大。

5′-核苷酸酶有多種類(lèi)型，目前發(fā)現(xiàn)的有6種，即膜結(jié)合性5′-核苷酸酶、胞漿-5′-核苷酸酶Ⅰ型、胞漿-5′-核苷酸酶Ⅱ型、胞漿-5′（3′）脫氧核糖核苷酸酶、線(xiàn)粒體-5′-核苷酸酶和僅存在于紅細(xì)胞中的嘧啶核苷酸酶[21-23]。5′-核苷酸酶不僅具有水解酶的活性，而且具有重要的非水解酶活性，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)、纖維蛋白合成、神經(jīng)傳遞、提高表皮或內(nèi)皮屏障功能及淋巴細(xì)胞的黏附、再循環(huán)、免疫應(yīng)答等方面均發(fā)揮重要的作用[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，5′-核苷酸酶主要在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，健康豬、中藥治療豬、西藥治療豬和治療失敗豬的5′-核苷酸酶活性依次遞減，組間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明PEDV雖然對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞連接有明顯的損傷，但可能與5′-核苷酸酶的關(guān)聯(lián)性不高，需要進(jìn)一步研究。endprint

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