孫 靜 王 振 張榮飛

（1.天津納爾生物科技有限公司，天津300457；2.北京五洲恒通認(rèn)證有限公司，北京100068）

復(fù)合植物提取物的安全性及抗球蟲作用的研究

孫 靜1王 振2張榮飛1

（1.天津納爾生物科技有限公司，天津300457；2.北京五洲恒通認(rèn)證有限公司，北京100068）

雞球蟲病是一種危害大且難以防治的寄生蟲病，該病可對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。本研究新型的復(fù)合植物提取物，通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)，驗(yàn)證產(chǎn)品的安全性，然后根據(jù)最低有效濃度，設(shè)計(jì)體外試驗(yàn)，研究產(chǎn)品對(duì)艾美爾球蟲病的抑制活性。結(jié)果顯示，該產(chǎn)品可以在一定濃度下可以有效地抑制球蟲病，且無細(xì)胞毒性。

植物提取物 細(xì)胞毒性 球蟲病

艾美耳球蟲和隱孢子蟲的寄生蟲無處不在，在原生動(dòng)物以及在人類的免疫抑制人群，及其發(fā)展和傳播的風(fēng)險(xiǎn)是持續(xù)的。

雞球蟲病由寄生在雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)的艾美耳屬多種球蟲原蟲引發(fā)[1]。作為嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的全球流行性雞病之一，該病的發(fā)生率較高，分布范圍廣，危害嚴(yán)重，其病死率可達(dá)35%～82%。全球因雞球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失可以達(dá)到1億～3億元美元[2，5]，給禽類養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來，養(yǎng)殖業(yè)一直依賴于抗球蟲藥物，化學(xué)藥物和抗生素類藥物對(duì)雞球蟲有積極的治療作用，但是也產(chǎn)生極大的耐藥性[6，7]，而且這些藥物造成了雞肉和雞蛋中的藥物殘留，給人類食品安全帶來極大隱患，同時(shí)也不利于養(yǎng)殖業(yè)健康的發(fā)展[8]。

本實(shí)驗(yàn)室研制出一種蛋雞用復(fù)合型植物提取物產(chǎn)品，體外試驗(yàn)研究顯示了產(chǎn)品的安全性和良好的抗球蟲效果。

1 T-Rova細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)

1.1 材料和方法

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)細(xì)胞系：本次試驗(yàn)選用了英國(guó)Rovamycine，100g/瓶，購自上海浩然生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞被稱為T-Rova。

1.1.2 主要試驗(yàn)用試劑

復(fù)合植物提取物，公司自有；MTT，F(xiàn)luka公司；細(xì)胞培養(yǎng)液M EM，GIBCO公司；胎牛血清，北京生物制品研究所；臺(tái)盼藍(lán)染色劑等。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀，Tecan Infinite F50，瑞士帝肯；二氧化碳培養(yǎng)箱，ICW190/ICA175，德國(guó)IRM；96孔培養(yǎng)板，康寧3599，北京賽因坦科技有限公司；生物顯微鏡，Eclipse Ni-U，日本尼康等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的制備

100μl普通培養(yǎng)基加入15%～20%的胎牛血清，制備成細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2 試驗(yàn)過程

在對(duì)照孔（T）中加入：100ul含有5000 TG180細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100μl普通培養(yǎng)基（含15%～20%的胎牛血清）[9]。

試驗(yàn)組中加入：100ul含有5000 TG180細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100μl產(chǎn)品，作連續(xù)倍比稀釋

稀釋濃度分別為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64。

1.2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色法

將1×105細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（100ul/孔），將7組試驗(yàn)組和1組試驗(yàn)組放于37°二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)[10]。5%C O2+95%空氣條件下培養(yǎng)四天后取出，通過生物顯微鏡觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，離心收集每四個(gè)孔板中的細(xì)胞，用臺(tái)盼蘭染色在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，活細(xì)胞不容易被染色，平滑，圓整，分離的；死細(xì)胞是藍(lán)色，無活力，呈海膽狀。吸取少量經(jīng)過染色的細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算活細(xì)胞率。

1.2.4 比色法

加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸除原液，加入DMSO，振蕩10min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為630 nm下測(cè)定吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖度（RG R）[11]。

1.3 結(jié)果分析

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算活細(xì)胞率，對(duì)比不同組的試驗(yàn)結(jié)果。

表1 球蟲病在畜牧業(yè)中的分類

表2 T-Rova細(xì)胞毒性反應(yīng)結(jié)果

通過試驗(yàn)結(jié)果可知，稀釋到1/8濃度，該產(chǎn)品無細(xì)胞毒副作用，不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖。

2 抗球蟲有效性試驗(yàn)

2.1 試驗(yàn)方法

本研究的有效性試驗(yàn)濃度由1/8開始。研究中有兩個(gè)對(duì)照組，一個(gè)對(duì)照組不含有球蟲，與其他含有球蟲對(duì)比檢驗(yàn)細(xì)胞是否生長(zhǎng)正常[12]。

2.2 試驗(yàn)過程

對(duì)照組一（T1）無球蟲加入：100μl含有5000 TG180培養(yǎng)基加入150μl普通培養(yǎng)基。

對(duì)照組二（T2）有球蟲加入：100μl含有5000 TG180培養(yǎng)基加入100μl含有200艾美爾球蟲再加入50ul普通培養(yǎng)基。

試驗(yàn)組中加入：100ul含有5000 TG180培養(yǎng)基加入100ul含有200艾美爾球蟲再加入50μl此時(shí)產(chǎn)品濃度的5倍，最終稀釋濃度為1/16、1/64、1/128。

將96孔板放置于37°二氧化碳培養(yǎng)箱中，5%C O2+95%空氣混合條件下，培養(yǎng)4d。

2.3 結(jié)果分析

試驗(yàn)結(jié)果在低倍顯微鏡下觀察得出，陰性結(jié)果表明生長(zhǎng)狀況不好，標(biāo)記為（-），陽性試驗(yàn)結(jié)果表明生長(zhǎng)狀況良好，標(biāo)記為（+），可以看到菌群迅速增殖，細(xì)胞破裂后又長(zhǎng)出新的球蟲細(xì)胞[13，14]。

圖1 抗球蟲有效性試驗(yàn)結(jié)果

反復(fù)進(jìn)行生物學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在1/16濃度處有一個(gè)陽性對(duì)照，此外在1/16濃度處的細(xì)胞毒性結(jié)果表明此濃度下細(xì)胞可以緩慢生長(zhǎng)[15]。1/32濃度下產(chǎn)品對(duì)所有孔板中的球蟲起到抑制作用，說明該濃度下產(chǎn)品對(duì)球蟲有良好的抑制作用。

3 討論

在我國(guó)植物資源豐富，尤其是藥用植物品類繁多，并且毒副作用小，無藥物殘留，不易產(chǎn)生耐藥性。不同于化學(xué)藥品只有單一的功能，本研究中利用天然植物薄荷、牛至等復(fù)合成新型的飼料添加劑產(chǎn)品，通過多種植物提取物互相促進(jìn)、協(xié)同作用，可以有效地抑制球蟲病。

細(xì)胞安全性試驗(yàn)結(jié)果表明：在≤1/8濃度下，添加產(chǎn)品的T-Rova細(xì)胞系可以正常生長(zhǎng)和增殖，表明此濃度下不影響細(xì)胞正常的生長(zhǎng)，無毒性反應(yīng)。

抗球蟲有效性試驗(yàn)結(jié)果表明：在1/16濃度下，產(chǎn)品具有的抑制球蟲效果，在1/32濃度下，產(chǎn)品具有顯著的抑制球蟲效果，且此濃度下的細(xì)胞可以正常生產(chǎn)，無毒性反應(yīng)。

綜上所述，本研究中的復(fù)合植物提取物對(duì)球蟲有良好的抑制效果[16，17]，且不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，不破壞細(xì)胞性能。產(chǎn)品來源于植物提取物，安全性高[18]，有望開發(fā)成新型的抗球蟲飼料添加劑產(chǎn)品。

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國(guó)家科技支撐計(jì)劃 含有米糠活性物質(zhì)的安全高效新型飼料添加劑的研究與應(yīng)用（14ZCZDNC00006）

孫靜，碩士，畜牧師，動(dòng)物遺傳育種與繁殖專業(yè)。