覃盼，王經緯，王斌，雷喜梅，李龍，黃耀偉*

中國東部5省豬呼腸孤病毒流行病學調查與分析

覃盼1，王經緯1，王斌1，雷喜梅1，李龍2，黃耀偉1*1

（1.浙江大學動物科學學院動物預防醫(yī)學研究所，杭州310058；2.杭州貝爾塔生物技術有限公司，杭州310004）

從核酸和抗體水平對我國東部5省豬呼腸孤病毒的流行情況進行研究。針對L1基因設計特異性引物，成功建立了豬呼腸孤病毒巢式反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測方法，利用該方法對2013—2014年從浙江、江西、山東、河南、黑龍江等5省共58個豬場采集的224份腹瀉豬糞便樣品進行檢測。同時，建立了血清型3型哺乳動物呼腸孤病毒（mammalian orthoreovirus,MRV）中和抗體檢測方法和以病毒衣殼蛋白δ1重組蛋白為包被抗原的間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的血清學檢測方法，并利用該方法分別測定了37份腹瀉豬血清樣品中和抗體滴度和抗σ1 IgG抗體水平。結果表明，從55個豬場中共檢出147份陽性樣品，豬場陽性率和樣品陽性率分別為94.8%和65.6%。在37份血清樣本中，中和抗體效價高于4的有33份（89.2%）；而采用間接ELISA方法測定在450 nm處的吸光度值高于臨界值（0.32）的樣品為32份（86.49%），二者具有較好的相關性：說明建立的間接ELISA檢測方法比較可靠。此外，利用建立的間接ELISA方法檢測了2015—2016年從江西、河南、浙江、黑龍江和山東等省收集的262份具有腹瀉癥狀的母豬、初生仔豬和3周齡斷奶仔豬血清樣品。結果表明，抗σ1 IgG抗體檢出率為84.4%。根據核酸和抗體水平檢測結果，我們認為呼腸孤病毒廣泛存在于中國東部5省各個豬場中，應該引起足夠的重視。

L1基因；巢式反轉錄聚合酶鏈式反應；中和抗體；σ1蛋白；間接酶聯(lián)免疫吸附測定；流行病學調查

近年來，新生仔豬腹瀉持續(xù)在中國爆發(fā)，發(fā)病仔豬呈現腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴重的能導致仔豬迅速脫水、死亡，給養(yǎng)豬產業(yè)帶來了巨大的經濟損失。目前，引起仔豬腹瀉的病原還沒有完全弄清，各國學者普遍認為豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）[1]主要以豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）[2]、輪狀病毒（rotavirus,RV）[3]等病毒性病原為主導，細菌性病原體和寄生蟲參與其中。近年來，一些新發(fā)腹瀉病毒如豬丁型冠狀病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）[4]、哺乳動物呼腸孤病毒（mammalian orthoreovirus,MRV）[5-11]也受到各國學者的關注。

MRV屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus）的雙鏈RNA病毒，其基因組由10條分節(jié)段的雙鏈RNA組成，根據10個節(jié)段大小可分為 L（L1，L2，L3）、M（M1，M2，M3）和 S（S1，S2，S3，S4）3種類型，是一類能引起人和哺乳動物呼吸道和消化道疾病的病原。自20世紀50年代起，先后在人類[12]、狗[13]、牛[14]、水貂[15]、果子貍[16]、蝙蝠[17-18]等哺乳動物上被分離到。MRV被證實不僅能引起人類出血性腸炎、急性呼吸道感染、腦炎等疾病，還能導致其他哺乳動物如狗、水貂等腹瀉。但是，關于豬呼腸孤病毒的研究相對較少，直到近10年，豬呼腸孤病毒才先后在中國、韓國、美國以及歐洲等地的腹瀉豬糞便樣品中被分離到[5-8,11,19]。NARAYANAPPA等[10]用從美國分離到的豬呼腸孤病毒感染新生仔豬，發(fā)現仔豬出現嚴重腹瀉，并且死亡率高達100%；LELLI等[20]對牛、豬、馬以及狗等的血清進行檢測，發(fā)現抗呼腸孤病毒中和抗體廣泛存在于各種哺乳動物中；KWON等[8]在對韓國78個豬場進行檢測時發(fā)現，豬呼腸孤病毒樣品陽性率達到19%。上述報道說明豬呼腸孤病毒可能廣泛流行于各個豬場。但是，目前關于我國豬呼腸孤病毒的流行情況報道還比較少。因此，本研究從核酸和抗體水平對我國東部5個省份多個豬場的豬呼腸孤病毒流行情況進行調查，為全面了解豬呼腸孤病毒在我國的流行情況提供數據支持，同時對該病毒的防控也具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬呼腸孤病毒（MRV3-ZJ2013，GenBank登錄號 ：KY419120～KY419129）、大 腸 埃 希 菌（Escherichia coli）Rosetta菌株、pET-22b（+）載體，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬丁型冠狀病毒（PDCoV）的陽性血清由筆者之一黃耀偉實驗室保存。一步法RT-PCR試劑盒（EasyScript one-step RT-PCR SuperMix kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix酶以及蛋白純化樹脂（ProteinIso Ni-NTA resin）均購自北京全式金公司，限制性內切酶購自美國NEB公司，TRizol購自美國Life公司，核酸儀用病毒RNA提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司，四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine,TMB）單組分顯色液購自北京索來寶公司。

224份腹瀉豬糞便樣品由2013—2014年從浙江、江西、山東、河南、黑龍江等省共58個豬場收集而來。262份腹瀉豬血清樣本由2015—2016年從上述5省共25個豬場收集而來，其中86份為母豬血清樣本，95份為1周齡仔豬血清樣本，81份為3周齡仔豬血清樣本。

1.2 豬呼腸孤病毒巢式反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測方法的建立與樣品檢測

1.2.1 巢式RT-PCR方法建立

比對分析報道的豬呼腸孤病毒基因序列，選擇L1基因序列設計巢式PCR檢測引物（以MRV3-ZJ2013毒株為準，GenBank登錄號：KY419120），由杭州博尚生物有限公司合成。利用TRizol抽提MRV3-ZJ2013毒株的基因組RNA作為模板摸索檢測條件。巢式PCR第1輪利用EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒擴增。反應體系為：10 μL 2×One-Step Reaction Mix、0.4 μL TransScriptⅡ One-Step Enzyme Mix、2 μL 總 RNA、正向和反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，加雙蒸水至25 μL。反應條件為：50℃反轉錄30 min；94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共擴增35個循環(huán)；72℃延伸10 min。將上一輪獲得的PCR產物稀釋100倍作為模板，利用2×EasyTaq PCR SuperMix酶進行第2輪擴增。反應體系為：12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix、1 μL 模板、正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火 30 s，72℃延伸30 s，共擴增35個循環(huán)；72℃延伸10 min。在2輪反應中，采用溫度梯度PCR摸索最佳退火溫度，PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 臨床樣本檢測

將所采集的具有腹瀉仔豬糞便拭子用300 μL 1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）稀釋，反復凍融3次后，取100 μL用核酸提取儀NP968（西安天隆科技有限公司）按照天隆科技病毒RNA提取試劑盒說明書提取病毒總RNA。用1.2.1節(jié)摸索的最佳條件進行巢式PCR檢測，每一輪設置陰性對照和陽性對照，其中陽性對照為MRV3-ZJ2013病毒總RNA。

1.3 基于豬呼腸孤病毒δ1蛋白間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法的建立

1.3.1 δ1蛋白原核表達及純化

設計特異性引物擴增S1基因片段（F：5'-GGA ATTCCATATGGATCCTCGTTTACGTG-3'；R：5'-CC CAAGCTTCGTGAAACTGCGTGGATA-3'），經NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆于pET22b（+）載體中，并轉化Rosetta感受態(tài)細胞，經菌落PCR篩選出陽性克隆并測序驗證。將驗證正確的重組菌擴大培養(yǎng)至D（600 nm）等于0.6時，用1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）誘導表達。用Ni-NTA層析柱純化蛋白，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）檢驗純化。

1.3.2 陰性和陽性血清樣本篩選

由分離MRV3-ZJ2013毒株的豬場提供的具有腹瀉癥狀的20份仔豬血清用于篩選陽性血清，由本實驗室自行培育的后備母豬所產的10份仔豬血清用于篩選陰性血清。參考本實驗室已建立的方法篩選豬呼腸孤病毒陰性和陽性血清樣本[21]。

1.3.3 反應條件優(yōu)化

采用棋盤滴定法，確定最佳的抗原包被濃度、血清稀釋度以及二抗稀釋度。用碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）2倍梯度稀釋δ1蛋白，然后包被不同稀釋度蛋白，4℃過夜。每孔用300 μL PBS-T洗滌緩沖液（0.01 mol/L PBS，0.05%Tween-20，pH 7.4）洗滌3次，用PBS-T配制的5%脫脂乳37℃封閉2 h。將 MRV3陽性豬血清按照 1∶10、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600稀釋后每孔加入100 μL，每組6個重復，并在37℃孵育1 h。然后用PBS-T洗滌緩沖液（0.01 mol/L PBS，0.05%Tween-20，pH 7.4）洗滌3次。將按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶8 000、1∶10 000等6個梯度稀釋的HRP標記的山羊抗豬Ig G以100 μL/孔分別加入上述6個板中，37℃孵育30 min。每孔加入100 μL TMB單組分顯色液，并于室溫孵育15 min。最后每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應，在450nm波長處讀數。上述試驗重復3次以確定最佳反應條件。

1.3.4 臨界（cut-off）值確定

利用構建好的間接ELISA方法測定陰性血清在450 nm波長處的吸光度值，并計算標準差（standard deviation,SD）。臨界值為平均值+3SD。收集的血清樣本在450 nm波長處的吸光度值若低于臨界值則判定為陰性，若等于或者高于臨界值則判定為陽性。

1.3.5 間接ELISA檢測方法可靠性驗證

從待檢血清樣品中隨機選取37份測定抗MRV3中和抗體。用DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）2倍系列稀釋血清樣品，每個樣品設置12個稀釋梯度，每個梯度8個重復。將稀釋的血清放入56℃水浴鍋中滅活30 min。將MRV3-ZJ2013病毒液用維持培養(yǎng)基（maintenance medium,MM）稀釋到100 TCID50（50%tissue culture infective dose，半數組織感染劑量）。取100 μL稀釋后的病毒與100 μL滅活的各稀釋度的血清混合均勻，置于37℃孵育1 h后加入到96孔板中，37℃孵育2 h。棄上清液，加入添加胰酶的維持培養(yǎng)基（maintenance medium with trypsin,MMT）繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每份血清設3個重復。觀察細胞病變并記錄，按Reed-Muench法計算血清中和效價。

1.3.6 臨床樣品檢測

應用建立的ELISA檢測方法，對收集具有腹瀉癥狀的262份豬血清樣品進行檢測，分別設置陽性和陰性對照。

2 結果

2.1 巢式RT-PCR檢測方法的建立

針對L1基因共設計3對引物，組合之后進行條件摸索（圖1），最終確定的檢測引物如表1所示。反應條件為第1輪循環(huán)數35，熔解溫度（tm）=55℃，第2輪循環(huán)數30，tm=57℃。

圖1 巢式RT-PCR檢測條件摸索結果Fig.1 Electropherogram of the nested RT-PCR product

2.2 巢式RT-PCR檢測結果

對從浙江、江西、山東、河南、黑龍江等5省共58個豬場采集的224份腹瀉仔豬糞便樣品進行巢式RT-PCR檢測。結果（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/EN/article/showSupportInfo.do?id=10520）顯示：從55個豬場中共檢出147個陽性樣品，豬場陽性率和樣品陽性率分別為94.8%和65.6%，其中第1輪從16個豬場（陽性率為27.5%）中檢出陽性樣品28個（陽性率為12.5%）；從地區(qū)來看，不同地區(qū)采集樣本量不同，樣本量最小的是黑龍江省，其陽性率也最高，達75%，浙江省采集的樣本量最大，從43個豬場中共采集到159份腹瀉樣品，其中在41個豬場中檢測到豬呼腸孤病毒，樣品陽性率達67.9%，且第1輪檢出陽性樣品的比例也最高，達15.7%（表2）。

表1 巢式RT-PCR檢測引物Table 1 Primers of the nested RT-PCR

表2 各地區(qū)樣品MRV3檢測結果匯總Table 2 Summary of positive rate of the MRV3

2.3 間接ELISA方法的建立

參考本實驗室已經建立的方法，從20份具有腹瀉癥狀的豬血清中最終篩選到3份陽性血清，結果如圖2所示。同時對初生仔豬血清進行篩選，確定了4份陰性血清。將上述3份陽性血清混合，用于摸索基于δ1蛋白間接ELISA檢測方法的最佳條件。最終確定的條件如下：抗原最佳包被量為0.387 ng/孔，血清樣品稀釋度為1∶100，HRP標記的羊抗豬抗體按照1∶2 000稀釋。間接ELISA檢測的臨界（cut-off）值為對照組（4份陰性血清）在450 nm波長處的吸光度平均值+3SD，即為0.32。若收集的血清樣本在450 nm波長處的吸光度值低于0.32則判定為陰性，若等于或者高于0.32則判定為陽性。

從收集的血清樣品中隨機選取37份血清樣品測定中和效價。經過多次試驗認定，中和抗體滴度小于等于4時，無法判斷是否由非特異性結合產生干擾。在37份血清樣本中，中和抗體效價高于4的有33份（89.2%）。而用建立的間接ELISA方法測定血清樣品的陽性率為86.49%（表3），二者具有較高的一致性，說明建立的間接ELISA方法比較可靠。

圖2 陽性血清免疫印跡結果Fig.2 Result of Western blot analysis of positive serum

表3 血清樣品在450 nm處的吸光度值和中和抗體效價對比結果Table 3 Comparison of absorbance value at 450 nm and neutralization antibody titer(NT)of serum samples

2.4 臨床樣本間接ELISA檢測結果

利用建立的間接ELISA對收集的262份血清樣品進行檢測。結果（表4）表明：從整體來看，中國東部5省不同年齡段的豬中MRV3抗體陽性率比較高，達到84.4%。從不同年齡段來看，陽性率最高的是1周齡以內仔豬，達到89.5%；最低的是3周齡仔豬，陽性率為75.3%。從地區(qū)來看，江西省陽性率最高，達到95.7%；河南省最低，為72.5%。但是在450 nm處的吸光度平均值各省差異不明顯，最高的是山東省，而最低的是黑龍江?。▓D3）。

表4 不同地區(qū)不同年齡豬血清樣品中MRV3抗體陽性率匯總Table 4 Summary of antibody positive rates of the MRV3 in pig serum samples of different ages from different regions

圖3 不同地區(qū)血清抗體水平散點分布圖Fig.3 Distribution of σ1-based ELISA results(anti-MRV3 IgG antibodies)among serum samples collected from different regions

3 討論

仔豬腹瀉一直是困擾全球養(yǎng)豬產業(yè)發(fā)展的一大難題，對于引起腹瀉的病原也存在爭議。過去認為，引起仔豬腹瀉的病毒性病原主要是PEDV、TGEV、RV以及一些腸道病毒（EV），但是，近年來一些使用過疫苗的豬場仍然再次暴發(fā)腹瀉疫情，特別是一些新發(fā)病原例如PDCoV、MRV，引起了各國學者的注意。

目前針對豬呼腸孤病毒的報道主要集中在基因組分析以及致病性等，對于豬呼腸孤病毒的流行病學調查比較少。談晨[22]用RT-PCR方法檢測了2012年3月到2013年2月從上海、安徽、廣西、江蘇、浙江、廣東、四川、山東、湖北等省共31個規(guī)模豬場收集的102份腹瀉病料樣品，結果顯示，豬場陽性率為45.16%，病料樣品陽性率為26.47%。KWON等[8]對2004年1月至2005年12月從韓國78個豬場收集的237份2日齡至70日齡腹瀉豬糞便樣品檢測發(fā)現，呼腸孤病毒陽性率達到19%。XIAO等[19]利用熒光定量PCR技術檢測了2015年4月至5月從美國41個豬場收集的277份腹瀉糞便樣品，結果顯示，從8個豬場中（8/41，19.5%）檢測到了16份陽性樣品（16/277，5.7%）。本研究針對MRV L1基因保守區(qū)設計引物建立了巢式RT-PCR檢測方法。L1基因編碼的λ1蛋白具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，在不同血清型呼腸孤病毒之間具有較高的保守性。理論上，針對L1基因保守區(qū)設計引物能夠檢測到不同血清型的呼腸孤病毒。S1基因是呼腸孤病毒基因組中保守性最低的基因，不同血清型MRV中的S1序列差異比較大，因此，針對MRV3 S1基因設計的檢測引物可能不能有效地檢測到其他血清型MRV。因此，針對L1基因建立的檢測方法靈敏性更高。這可能是XIAO等[19]的檢測結果明顯低于本研究以及其他報道的原因之一。本研究建立的巢式PCR第2輪引物位于第1輪PCR產物內部，而非目的片段包含2套引物結合位點的可能性極小，因此確保了第2輪PCR產物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。因此，相對于KWON等[8]和談晨[22]針對L1建立的傳統(tǒng)RTPCR方法，本研究建立的檢測方法特異性更高。

本研究利用巢氏RT-PCR檢測了2013—2014年從浙江、江西、山東、河南、黑龍江等省共58個豬場收集的腹瀉樣品。結果顯示，從55個豬場中檢出了147份陽性樣品，豬場陽性率和樣品陽性率分別為94.8%和65.6%。這說明豬呼腸孤病毒廣泛存在于具有腹瀉癥狀的仔豬體內，可能單獨或者與其他病原共感染引起腹瀉。

本研究還建立了呼腸孤病毒中和抗體測定方法以及以δ1蛋白為包被抗原的間接ELISA檢測方法，首次從抗體水平調查了我國豬MRV3流行情況。間接ELISA檢測結果顯示，在2015—2016年從山東、河南、江西、黑龍江和浙江等省共25個豬場收集到的262份腹瀉豬血清樣品中，陽性率達84.4%，并且各地區(qū)陽性樣品率以及在450 nm處的吸光度平均值差異不顯著。這從另一角度說明呼腸孤病毒廣泛存在于各個豬場中。

間接ELISA檢測樣品主要來自具有腹瀉癥狀的母豬、1周齡內仔豬以及3周齡仔豬。從不同年齡段來看，1周齡內仔豬樣品陽性率最高，母豬次之，3周齡仔豬最低。新生仔豬體內抗體主要是通過奶水從母體獲得的母源抗體。因此，我們推測母豬很有可能是仔豬感染的病毒源。到3周齡斷奶時母源抗體基本消失，病原入侵時自身免疫系統(tǒng)將會產生免疫應答，這可能是出現上述現象的原因之一。

盡管血清樣品和腹瀉糞便樣品采集時間以及來源有所差異，上述數據不能完全準確反映真實的感染情況，但可以說明豬呼腸孤病毒廣泛存在于中國東部5省各豬場中，在實際生產中應該做好該病毒的防控。

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QIN Pan1,WANG Jingwei1,WANG Bin1,LEI Ximei1,LI Long2,HUANG Yaowei1*
(1.Institute of Preventive Veterinary Medicine,College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Hangzhou Belta-Biotechnology Co.,Ltd.,Hangzhou 310004,China)

L1 gene;nested reverse transcription-polymerase chain reaction;neutralization antibody;σ 1 protein;indirect enzyme-linked immunosorbent assay;epidemiological survey

S 855.3

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2017.04.211

Summary Diarrhea is a common disorder in pigs,and associated dehydration is a leading cause of mortality among piglets,causing substantial economic losses.Studies have found that the etiology of diarrhea is varied,including multiple viral,bacterial,and parasitic pathogens,but viruses such as porcine epidemic diarrhea virus(PEDV),transmissible gastroenteritis virus(TGEV),rotavirus(RV)and other enteroviruses(EV),are the predominant factors in most cases.Repeated outbreaks have also been reported on farms in which piglets had been immunized by vaccines targeting these viruses.Recently,newly emerging viruses,such as mammalian orthoreovirus(MRV),which can cause diarrhea alone or in co-infections with other known pathogens,have been of great concern in China,South Korea,USA and Europe.Fewresearches on MRV,especially its epidemiological survey and analysis have been carried out in China.

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0500103）。

黃耀偉（http://orcid.org/0000-0001-9755-8411）,E-mail:yhuang@zju.edu.cn

（First author）：覃盼（http://orcid.org/0000-0003-0545-3044）,E-mail:qinpan@zju.edu.cn

2017-04-21；接受日期（Accepted）：2017-05-03

In order to understand the epidemicity of MRV in China,molecular and seroepidemiological survey of MRV type 3 in diarrheic pigs from five provinces of east China was performed in this study.A nested reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)method was designed to target the L1 gene.A total of 224 diarrheic fecal samples collected from 58 pig farms from Zhejiang,Jiangxi,Shandong,Henan and Heilongjiang provinces in 2013—2014 were examined by this method.Our data revealed that porcine orthoreovirus was present in 147 of 224(65.6%)diarrheic porcine fecal samples obtained from 55 of 58(94.8%)pig farms.At the same time,a neutralization test as well as an indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)with a purified σ1 protein as a coat antigen was developed.The neutralization antibody levels and the anti-σ1 IgG antibody levels of 37 serum samples were determined.A good linear relationship between the anti-σ1 antibodies and virus neutralization(VN)antibodies was observed,demonstrating the correlation between them.Then the σ1-based ELISA was applied to the subsequent seroepidemiological survey of MRV3.A total of 262 serum samples collected from the sows,one-week-old piglets as well as three-week-old weaning piglets in 2015—2016 were tested.The result showed these samples had a high positive rate of anti-MRV IgG(84.4%).

Overall,the preliminary results suggest that MRVs are widespread in piglets from five provinces of east China and may collectively contribute to the enteric disease along with other porcine pathogens.