顏龍杰，沈建東，張凌晶,，翁 凌,，胡莉蘋，曹敏杰,,3,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)調(diào)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361102）

凡納濱對蝦組織蛋白酶L性質(zhì)分析及其對肌肉蛋白的降解

顏龍杰1，沈建東2，張凌晶1,2，翁 凌1,2，胡莉蘋1，曹敏杰1,2,3,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021；3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)調(diào)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361102）

本研究從凡納濱對蝦肝胰腺中純化獲得一種組織蛋白酶L，其分子質(zhì)量約為31 kD，肽質(zhì)量指紋圖譜分析得到8 個片段共112 個氨基酸殘基，與報道的凡納濱對蝦組織蛋白酶L序列完全一致。該酶的最適溫度和最適pH值分別為35 ℃和5.5，且在0～40 ℃以及pH 5.5～6.5之間酶活力穩(wěn)定。該酶僅對底物Z-Phe-Arg-MCA特異分解。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和Leupeptin對其有明顯的抑制作用，而金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸對其有少量的激活作用。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，隨著低溫貯藏時間的延長，對蝦肌肉纖維的斷裂程度不斷增加。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，組織蛋白酶L可使肌肉蛋白發(fā)生分解，推測其可能參與對蝦低溫貯藏過程中肌肉的降解。

凡納濱對蝦；組織蛋白酶L；純化；肌原纖維；掃描電子顯微鏡；降解

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是世界三大養(yǎng)殖蝦品種之一[1]。2014年，我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)157.6萬 t[2]。凡納濱對蝦因味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受人們喜愛。對蝦在流通過程中的貯藏通常采用0～4 ℃短期冷藏、-18 ℃長期凍藏等方式。雖然0～4 ℃低溫貯藏可以延長其貨架期，但黑變、肌肉彈性下降等問題難以避免[3-5]。此外，-18 ℃凍藏的對蝦在解凍過程中蝦肉會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，肌肉蛋白的降解是蝦肉貯藏過程中組織軟化、自溶的主要原因[6]，而內(nèi)源性蛋白酶是造成肌肉蛋白降解的關(guān)鍵因素[3,7-9]。在多種內(nèi)源性蛋白酶中，組織蛋白酶L是一類容易使肌原纖維蛋白降解的蛋白酶[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，該酶基因在蝦的肝胰腺、血細(xì)胞、腮、肌肉、腸、胃及卵巢等組織均有表達(dá)，而在肝胰腺中的表達(dá)水平最高。雖然有研究[14-15]嘗試通過添加不同類型抑制劑判斷組織蛋白酶L在貯藏過程中的作用，但是其相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)以及對肌肉蛋白降解作用的研究鮮有報道。本研究以凡納濱對蝦為研究對象，運用生化分離技術(shù)獲得高純度組織蛋白酶L，分析酶學(xué)性質(zhì)，進(jìn)一步采用掃描電鏡觀察貯藏過程中蝦肉的微觀變化情況，探索組織蛋白酶L對肌肉蛋白的降解作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活凡納濱對蝦（平均個體質(zhì)量10 g） 廈門集美農(nóng)貿(mào)市場；SP-Sepharose陽離子層析柱 美國GE Healthcare公司；Z-Phe-A rg-MCA、Z-A rg-A rg-M CA、Boc-G ln-A rg-A rg-M CA等熒光底物 日本Peptide Institute公司；反式琥珀酸-亮氨酰胺-胍基丁酮（E-64） 美國Am resco公司；胃蛋白酶抑制劑Pepstatin 瑞士Roche公司；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、苯甲脒、亮肽素 美國Sigma公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pro高分辨率掃描電鏡 荷蘭Phenom公司；PT2500E高速組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國Agilent公司；Avanti J-265xp高速冷凍離心機(jī)、手持式500型pH計 美國Beckman公司；WB-10L1型恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；YP6001N電子天平 中國上海精科天平廠；M ini Protean Cell垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

鮮活凡納濱對蝦采用冰水混合致死（1∶2（g/m L）冰水中浸泡20 m in）[3]，無菌水洗凈，瀝干，分3 組，裝入無菌真空包裝袋，置于4 ℃冷藏，用于實驗。

1.3.2 組織掃描電鏡分析

平行于凡納濱對蝦肌肉紋理進(jìn)行切片，獲得片狀組織（1 cm×1 cm×2 mm），體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液4 ℃固定24 h，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗2 次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨溶液25 ℃浸泡1 h，之后采用不同體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇梯度脫水，20 m in/次，再用100%乙醇脫水3 次，15 m in/次，處理后，再用乙酸異戊酯置換乙醇。乙醇置換后，用濺射儀在樣品表面濺射鍍金，最后用掃描電鏡進(jìn)行觀察，記錄結(jié)果。

1.3.3 組織蛋白酶L酶活力的測定

參考Barrett等[16]的方法稍作修改，操作如下：在900 μL 100 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，加入50 μL酶液和50 μL熒光底物Z-Phe-Arg-MCA（10 μmol/L）混勻，37 ℃孵育10 m in，加入1.5 m L終止液（水-甲醇-異丙醇體積比為35∶35∶30），混勻終止反應(yīng)。采用熒光分光光度計檢測混合液的熒光值，測定時激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為380 nm和450 nm，對照組用緩沖液代替熒光底物。酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol 7-氨基-4-甲基香豆素（7-am ino-4-methylcoumarin，AMC）所需酶量。

1.3.4 組織蛋白酶L的分離純化

分離純化過程均在4 ℃條件下進(jìn)行，具體步驟如下：取新鮮對蝦肝胰腺，加入4 倍體積50 mm o l/L乙酸鈉緩沖液（pH 4.5，含1 mmo l/L PMSF、1 mmol/L EDTA），進(jìn)行組織搗碎，于0 ℃，12 000×g離心20 m in，絹布過濾，上清液即為粗酶液。粗酶液進(jìn)行飽和度為40%～80%硫酸銨溶液分級沉淀，所得沉淀采用少量緩沖液溶解，4 ℃條件下充分透析。透析后的樣品上樣于S P-Sepharose陽離子交換層析柱（1.5 cm×12 cm），并淋洗至280 nm波長處檢測值到基線。接著用含0～0.5 mol/L NaCl的緩沖液線性洗脫。收集酶活性峰透析，再次上樣于SP-Sepharose預(yù)裝柱（體積1 m L），用含0.2～0.5 mol/L NaCl緩沖液線性洗脫，獲得純化的蛋白酶，并用于性質(zhì)分析。

1.3.5 組織蛋白酶L的質(zhì)譜鑒定

將純化的蛋白酶上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecy l sulfatepolyacrylam ide gel electrophoresis，SDS-PAGE），經(jīng)質(zhì)譜銀染后，切下目的條帶，送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性

蛋白酶最適溫度測定按照1.2.3節(jié)方法，其中孵育條件為不同溫度（4～80 ℃）孵育10 m in。熱穩(wěn)定性的測定，首先將酶液置于不同溫度（0～70 ℃）孵育30 m in，立即冰浴冷卻至室溫，在37 ℃條件下測定其剩余酶活力。

1.3.6.2 最適pH值和pH穩(wěn)定性

蛋白酶最適pH值測定時，孵育液為0.1 mol/L不同pH值的緩沖液（pH 2.0～8.0）。pH穩(wěn)定性測定方法為：將酶液加到不同pH值的緩沖液（pH 2.0～8.0）中，4 ℃孵育30 m in，取出少量酶液于100 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.5），測定其剩余酶活力。

1.3.6.3 底物特異性

底物特異性是將酶液與不同類型的熒光底物孵育反應(yīng)，按1.2.3節(jié)方法測定其對不同類型底物的水解程度，以水解Z-Phe-A rg-MCA熒光底物為對照。不同類型熒光底物包括Boc-Gln-Arg-A rg-MCA、Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA、Z-Phe-A rg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA。

1.3.6.4 蛋白酶抑制劑的作用

將酶液與不同類型的抑制劑混勻，在4 ℃孵育1 h后，用1.2.3節(jié)方法測定酶液剩余酶活力。對照樣品的反應(yīng)條件一致，但不加任何抑制劑。所用抑制劑包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E-64和Leupeptin）、金屬蛋白酶抑制劑（EDTA、EGTA）、絲氨酸蛋白酶抑制劑（PMSF、苯甲脒）。

1.3.7 組織蛋白酶L與肌肉蛋白降解的關(guān)系

1.3.7.1 肌肉蛋白的制備

新鮮凡納濱對蝦去殼取肉，加入4 倍體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，含0.15 moL/L NaCl溶液）組織搗碎，搗碎后的混合液即為肌肉總蛋白。

1.3.7.2 酶在不同時間下對肌肉蛋白的降解

在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，將2.5 mg肌肉全蛋白（含約0.01 U酶活力的組織蛋白酶L）與0.4 U酶活力的組織蛋白酶L充分混合，在35 ℃分別反應(yīng)0、5、15、30、60、90、120、180 min后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察肌肉蛋白的降解情況。對照樣品的反應(yīng)條件為35 ℃，180 min，不添加組織蛋白酶L，其他條件相同。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究有關(guān)相對酶活力數(shù)據(jù)處理中，以同一組內(nèi)3個重復(fù)樣品的平均變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為組內(nèi)誤差進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織蛋白酶L的分離純化

粗酶液經(jīng)過預(yù)處理和硫酸銨鹽析后，上樣于預(yù)先平衡的SP-Sepharose陽離子交換層析柱。結(jié)果如圖1a所示，目的蛋白吸附于SP-Sepharose層析柱，而大量的雜蛋白未被吸附，因此該層析柱能有效地將雜蛋白與目的蛋白分開。吸附部分的蛋白采用含0～0.5 mol/L NaCl緩沖液線性洗脫，目的蛋白被洗脫下來。由圖1b所示，經(jīng)SP-Sepharose陽離子交換預(yù)裝柱進(jìn)一步純化。由圖1c可知，組織蛋白酶L在SDS-PAGE顯示單一條帶，分子質(zhì)量約為31 kD。該結(jié)果與來源于藍(lán)圓鲹、鮭魚肌肉以及海參內(nèi)臟的組織蛋白酶L分子質(zhì)量（30 kD左右）接近[12,17-18]，但略高于鮑魚（28.5 kD和28 kD）[11]、鯉魚（28 kD）[19]等的分子質(zhì)量。組織蛋白酶L是一種酸性蛋白酶，其等電點在5.0左右。因此，其在pH 4.5的緩沖液中帶正電荷，通過2 次陽離子交換層析柱分離純化，獲得了高度純化的組織蛋白酶L，如表1所示，酶活力、純化倍數(shù)和得率分別為666.7 U/mg、349.4 倍和9.6%。

圖1 組織蛋白酶L分離純化層析圖Fig. 1 Column chromatographic purification of cathepsin L

表1 凡納濱對蝦組織蛋白酶L的純化Table 1 Summary of the purification of cathepsin L from shrim p

2.2 肽質(zhì)量指紋圖譜分析

表2 純化蛋白質(zhì)譜分析獲得的肽段Table 2 Peptide sequences of purified protein obtained by peptide mass fingerprinting

由表2可知，利用肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)對純化蛋白進(jìn)行鑒定，獲得8 個氨基酸片段包含112 個氨基酸殘基。由圖2可知，經(jīng)過序列比對，發(fā)現(xiàn)所得片段與通過分子克隆獲得的凡納濱對蝦（L.vannamei）組織蛋白酶L（GenBank：CAA68066.1）的氨基酸序列完全一致，證明純化的酶為組織蛋白酶L。作為溶酶體中重要的半胱氨酸蛋白酶之一，組織蛋白酶L在多種動物中被發(fā)現(xiàn)存有潛在的糖基化位點[11,19-20]。鮑魚的組織蛋白酶L由于糖基化而出現(xiàn)2 個分子質(zhì)量不同的條帶[11]。凡納濱對蝦組織蛋白酶L的序列中同樣有一個潛在的糖基化位點（Asn298）[20]，但是在蛋白水平上并沒有出現(xiàn)糖基化修飾現(xiàn)象。利用空間預(yù)測軟件SW ISS-MODEL，以人的組織蛋白酶L（SMTL ID：1cs8.1）為模板，對凡納濱對蝦組織蛋白酶L進(jìn)行同源建模，如圖3所示，推測是由于潛在糖基化位點（Asn298）在空間結(jié)構(gòu)上處于蛋白內(nèi)部，被蛋白質(zhì)折疊所掩蓋而未發(fā)生糖基化。

圖2 純化蛋白的質(zhì)譜片段與報道的凡納濱對蝦（L. vannamei）組織蛋白酶L的序列比較Fig. 2 Sequence alignment of the peptide of purified p rotein w ith cathepsin L from Litopenaeus vannamei

圖3 凡納濱對蝦（L. vannamei）組織蛋白酶L中潛在N糖基化位點在三級結(jié)構(gòu)中位置Fig. 3 Potential N-glycosylated site of cathepsin L from Litopenaeus vannamei in the three-dimensional structure

2.3 組織蛋白酶L的性質(zhì)分析

2.3.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性

如圖4所示，組織蛋白酶L在35 ℃時對Z-Phe-A rg-M CA熒光底物的分解能力最強(qiáng)，與鮑魚來源的組織蛋白酶L（35 ℃）相近[11]，低于藍(lán)圓鲹（55 ℃）[12]、海參（50 ℃）[18]等水產(chǎn)動物的組織蛋白酶L。當(dāng)溫度為4 ℃時，組織蛋白酶L保持40%的相對酶活力，表明該酶在低溫條件下仍表現(xiàn)出較高的酶活力；當(dāng)溫度為60 ℃時，由于高溫引起蛋白變性，組織蛋白酶L出現(xiàn)了失活狀態(tài)。另外，組織蛋白酶L的熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示，當(dāng)溫度低于40 ℃時，酶的穩(wěn)定性良好，相對酶活力保持在60%以上。當(dāng)溫度高于40 ℃時，組織蛋白酶L酶活力下降明顯。在50 ℃孵育30 min后，組織蛋白酶L的相對酶活力僅為20%。

圖4 組織蛋白酶L的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig. 4 Op timal tem perature and thermal stability of cathepsin L

2.3.2 最適pH值和pH穩(wěn)定性

圖5 組織蛋白酶L的最適pH值和pH穩(wěn)定性Fig. 5 Optimal pH and pH stability of cathepsin L

如圖5所示，凡納濱對蝦組織蛋白酶L的最適pH值為5.5，這個特性與多數(shù)水產(chǎn)動物中組織蛋白酶L的性質(zhì)相似[11-12,17-18]。當(dāng)pH值為4.0時，酶活力較低，僅有40%的相對酶活力；當(dāng)pH值為8.0時，幾乎不表現(xiàn)酶活性。可見組織蛋白酶L是一種在酸性條件下表現(xiàn)酶活力并發(fā)揮其功能的蛋白酶。當(dāng)pH值大于6.5，酶活力下降明顯，到pH 8.0時，酶活力幾乎喪失。當(dāng)pH值小于5.5時，酶活力也呈下降趨勢，表明組織蛋白酶L在pH 5.5～6.5區(qū)域，其穩(wěn)定性良好，這與本實驗室先前報道的來源于鮑魚[11]、藍(lán)圓鲹[12]的組織蛋白酶L性質(zhì)相似。

2.3.3 底物特異性研究

表3 組織蛋白酶L的底物特異性Tab le 3 Substrate specificity of cathepsin L

本實驗選用不同類型的熒光底物對凡納濱對蝦組織蛋白酶L的底物特異性進(jìn)行研究，結(jié)果如表3所示。組織蛋白酶L對熒光底物的分解十分專一，僅對P1位（切割位點N端第一個氨基酸殘基）為堿性氨基酸[21]，P2位為疏水性氨基酸的底物的組織蛋白酶底物Z-Phe-A rg-MCA進(jìn)行強(qiáng)烈分解[22]，而對其他類型的熒光底物分解程度較低。Br?mme等[23]通過合成一系列底物進(jìn)行分析，指出組織蛋白酶L更偏向于切割P2為芳香族氨基酸殘基的底物，這一性質(zhì)與組織蛋白酶B和S不同。可見，組織蛋白酶L、B、S雖均屬于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族，但底物特異性仍存在差異。

2.3.4 蛋白酶抑制劑的影響

不同蛋白酶抑制劑對組織蛋白酶L分解Z-Phe-A rg-MCA的影響如表4所示。絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲脒有一定的抑制，但PMSF對其抑制作用不明顯。蛋白酶抑制劑亮肽素和E-64對該酶活力有強(qiáng)烈的抑制效果。Leupeptin既屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑，也是絲氨酸蛋白酶抑制劑，其抑制類型并不專一，而E-64是一種專一抑制劑半胱氨酸蛋白酶的抑制劑，這2 種抑制劑可以有效抑制該酶活性，也證明了純化的酶屬于半胱氨酸蛋白酶類。金屬蛋白酶抑制劑EDTA、EGTA對該酶有輕微的激活作用，推測是由于某種（或某幾種）金屬離子對該酶的活性存在抑制作用，而EDTA、EGTA螯合金屬離子，進(jìn)而激活了酶活性。類似的結(jié)果在鮑魚組織蛋白酶L也被觀察到[9]。

表4 不同蛋白酶抑制劑對組織蛋白酶L的影響Table 4 Effect of different p roteinase inhibitors on the activity of cathepsin L

2.4 凡納濱對蝦冷藏過程中肌肉微觀結(jié)構(gòu)的變化

對蝦在4 ℃冷藏過程中，肌肉結(jié)構(gòu)由緊密逐漸變?yōu)樗缮⑹菍?dǎo)致質(zhì)構(gòu)不斷下降的原因。掃描電鏡圖分析結(jié)果顯示，新鮮對蝦的肌肉結(jié)構(gòu)完整，成束狀平行規(guī)則排列，纖維結(jié)構(gòu)緊密（圖6a1、6a2）。冷藏3 d后，肌肉束狀纖維出現(xiàn)斷裂（箭頭所指向處），纖維之間變得疏松（圖6b1、6b2）。5 d后，肌肉束狀結(jié)構(gòu)斷裂加劇，出現(xiàn)片狀化現(xiàn)象（箭頭所指向處），肌肉結(jié)構(gòu)更加松散、肉質(zhì)軟化（圖6c1、6c2）。Pornrat等[24]運用超微結(jié)構(gòu)分析了羅氏沼蝦在5 ℃貯藏3 d后肌原纖維蛋白的變化情況，發(fā)現(xiàn)Z線發(fā)生斷裂，4～6 d后，Z線、I線和M線均發(fā)生斷裂。有研究發(fā)現(xiàn)對蝦在冷藏過程中，蛋白酶會造成肌肉彈性下降，是造成纖維不斷產(chǎn)生斷裂、片狀化的原因之一[25]。

圖6 凡納濱對蝦肌肉在4 ℃貯藏不同時間的掃描電鏡圖Fig. 6 EM photom icrographs of shrim p muscle stored at 4 ℃ for different time intervals

2.5 組織蛋白酶L與肌肉總蛋白降解的關(guān)系

為了探究組織蛋白酶L是否能夠?qū)е挛r肌肉軟化，研究了組織蛋白酶L對蝦肌肉蛋白的降解作用，結(jié)果如圖7所示。在磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，組織蛋白酶L與肌肉總蛋白在35 ℃共同孵育5 m in，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）迅速發(fā)生降解。隨著時間的延長，蝦肌肉中分子質(zhì)量大于60 kD的蛋白均出現(xiàn)降解現(xiàn)象。反應(yīng)180 min后，MHC幾乎被完全降解，同時，肌動蛋白和原肌球蛋白，以及其他蛋白（條帶1～5）等也發(fā)生降解。在4 ℃條件下，隨著作用時間延長，也可觀察到同樣的結(jié)果。

活蝦肌肉pH值約為7.0，蝦死后初期由于體內(nèi)糖原的降解，三磷酸腺苷分解導(dǎo)致酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，pH值下降至6.5左右。隨著貯藏時間延長，蝦體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸及含氮類物質(zhì)在自身蛋白酶和微生物的共同作用下分解產(chǎn)生胺類、吲哚等堿性物質(zhì)，使蝦肉pH值逐漸上升至8.0左右[24-25]。組織蛋白酶L的酶學(xué)性質(zhì)顯示，當(dāng)pH值大于6.5時，酶活力下降十分明顯，因此其可能參與蝦死后初期和中期肌肉蛋白質(zhì)的降解。

盡管本研究的組織蛋白酶L是從肝胰腺中分離獲得，但該酶廣泛存在于蝦肌肉中[28]，是肌肉中活性較高的內(nèi)源性蛋白酶之一[29]。同時，對蝦肝胰腺中存在高活力的絲氨酸蛋白酶[4,29-30]。隨著對蝦新鮮度的下降，肝胰腺中的蛋白酶可以逐漸向肌肉擴(kuò)散，并使肌肉蛋白發(fā)生降解。本研究也發(fā)現(xiàn)，在4 ℃貯藏過程中，蝦肉的第一腹節(jié)處最先出現(xiàn)肌肉斷裂現(xiàn)象，蛋白降解最劇烈，可能是蝦頭部豐富的蛋白酶逐漸向肌肉中擴(kuò)散并發(fā)揮作用。

同時，本研究對4 ℃貯藏過程中蝦肌肉中組織蛋白酶L相對活力進(jìn)行檢測，由圖8所示，隨時間延長，該酶活力有一定程度降低，但即便貯藏5 d，其相對活性仍保持在80%以上。因此，組織蛋白酶L在蝦貯藏過程中持續(xù)參與肌肉蛋白的分解，尤其對組成肌肉的主要蛋白MHC的降解最為顯著。

圖7 組織蛋白酶L對蝦肌肉蛋白的降解作用Fig. 7 SDS-PAGE profi les show ing degradation of shrim p muscular proteins by cathepsin L

圖8 4 ℃貯藏不同時間肌肉中組織蛋白酶L相對活力的變化Fig. 8 Relative activities of cathepsin L in shrimp muscle at different time intervals during storage at 4 ℃

3 結(jié) 論

本研究運用生化分離技術(shù)從凡納濱對蝦中純化獲得一種組織蛋白酶L，結(jié)果顯示該酶分子質(zhì)量為31 kD，最適溫度和pH值分別為35 ℃和5.5，在0～40 ℃以及pH 5.5～6.5之間酶活力穩(wěn)定。肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)一步確定該酶為組織蛋白酶L。該酶對組織蛋白酶底物Z-Phe-A rg-MCA分解作用顯著，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和Leupeptin對該酶活力有強(qiáng)烈的抑制效果。掃描電鏡結(jié)果顯示，蝦肌肉在冷藏解凍過程中，肌肉纖維出現(xiàn)斷裂、片狀化現(xiàn)象。純化的組織蛋白酶L能夠使蝦肉蛋白產(chǎn)生降解，推測其與蝦類貯藏過程中肌肉蛋白品質(zhì)下降直接相關(guān)。

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Characterization of Cathepsin L from Litopenaeus vannamei and Its Effect on Muscular Protein Degradation

YAN Longjie1, SHEN Jiandong2, ZHANG Lingjing1,2, WENG Ling1,2, HU Liping1, CAO M injie1,2,3,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China;2. National and Local Joint Engineering Research Center of Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China;3. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361102, China)

This study aimed to investigate the enzyme that m ight be involved in this process. Cathepsin L was purified to homogeneity from the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei, and its molecular mass was approximately 31 kD as analyzed by sodium dodecyl sulfate- polyacrylam ide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Peptide mass fingerprinting revealed that 8 peptide fragments w ith a total of 112 amino acid residues were completely identical to the cathepsin L gene of L. vannamei. Using Z-Phe-Arg-MCA as substrate, the proteinase revealed optimal activity at 35 ℃ and pH 5.5,respectively. Purified cathepsin L was stable at temperature up to 40 ℃ and in the pH range from 5.5 to 6.5. It exhibited high specificity towards the substrate Z-Phe-Arg-MCA. Its enzymatic activity was significantly suppressed by the cysteine proteinase inhibitors E-64 and leupeptin, while it could be slightly activated by the metalloproteinase inhibitors ethylene diam ine tetraacetic acid (EDTA) and ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA). In addition, the fibrous structure of shrimp meat was increasingly destroyed w ith the prolongation of cold storage time as observed by scanning electron m icroscope(SEM). Purified cathepsin L eff ectively hydrolyzed muscular proteins as detected by SDS-PAGE, suggesting its potential involvement in the degradation of shrimp muscular proteins during cold storage.

Litopenaeus vannamei; cathepsin L; purification; myofibillar protein; degradation; scanning electron m icroscope (SEM)

10.7506/spkx1002-6630-201722006

TS254.4

A

1002-6630（2017）22-0034-07

2016-10-13

國家自然科學(xué)基金面上項目（31271838）；廈門南方海洋研究中心項目（14CZP030HJ04）

顏龍杰（1988—），男，博士研究生，研究方向為水產(chǎn)加工。E-mail：yanlongjieg@163.com

*通信作者：曹敏杰（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品深加工與蛋白質(zhì)化學(xué)。E-mail：m jcao@jmu.edu.cn

顏龍杰, 沈建東, 張凌晶, 等. 凡納濱對蝦組織蛋白酶L性質(zhì)分析及其對肌肉蛋白的降解[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):34-40. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722006. http://www.spkx.net.cn

YAN Longjie, SHEN Jiandong, ZHANG Lingj ing, et al. Characterization of cathepsin L from Litopenaeus vannamei and its effect on muscular protein degradation[J]. Food Science, 2017, 38(22): 34-40. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722006. http://www.spkx.net.cn