陳鐘 鄭曉丹 徐勇

蛋白激酶C激活對口腔鱗癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

陳鐘 鄭曉丹 徐勇

目的利用舌癌細胞系HN12探索激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)對口腔鱗癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial-mesenchymal transition，EMT)的影響。方法采用質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP-P120ctn轉(zhuǎn)染HN12細胞，使HN12過表達P120-連環(huán)蛋白(P120-catenin，P120ctn)，再加入蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活劑佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，采用實時熒光定量PCR、Western blot檢測PMA處理前后 PKC、P120ctn、E-cad的mRNA和蛋白表達，通過Transwell細胞侵襲及細胞遷移試驗等方法檢測細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果當PKC被PMA活化時，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞中P120ctn的表達顯著降低，E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)也隨之降低，間質(zhì)標記蛋白N-鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)和波形蛋白(Vimentin，Vim)的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力顯著提高(P<0.05)。結(jié)論PKC可能通過磷酸化調(diào)節(jié)P120ctn的表達，參與細胞黏附的調(diào)控，促進EMT，在口腔鱗癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮作用。

P120-連環(huán)蛋白(P120ctn)； 蛋白激酶C(PKC)； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)； 口腔鱗狀細胞癌(OSCC)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胚胎發(fā)育過程中一種基本的生理現(xiàn)象，以上皮細胞極性的喪失及運動能力增強為重要特征。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EMT與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)展、遷移和耐藥性形成等過程中發(fā)揮了重要的生物作用[1-2]，在口腔鱗狀細胞癌(oral squamous-cell cancer，OSCC)細胞系中多種EMT標記物的表達發(fā)生了上調(diào)或下調(diào)[3]。Wells等[4]發(fā)現(xiàn)EMT最重要的標志性變化是E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)的減少或丟失。我們之前的免疫組化試驗發(fā)現(xiàn)E-cad在OSCC中的表達與蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和P120-連環(huán)蛋白(P120-cantenin，Pl20ctn)具有相關(guān)性，且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等惡性表型有關(guān)[5]。本試驗以舌癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞系HN12(具有極強的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[6]為研究對象，探索PKC、Pl20ctn和E-cad在口腔鱗癌細胞系EMT中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

鼠抗人P120ctn單克隆抗、鼠抗人E-cad單克隆抗體(Abcam,美國)，兔抗人PKC單克隆抗體，pCMV6-AC-GFP- P120ctn(Origene，加拿大)，X-tremeGene HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑(Roche，瑞士)，佛波酯(Sigma，美國)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)(Gibco，美國)，TRIzol (Invitrogen，加拿大)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)。CO2培養(yǎng)箱(Thermal，美國)、倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)、熒光PCR儀(Corbett美國)、Transwell小室(Corning，美國)。

1.2 基因轉(zhuǎn)染及篩選

HN12細胞接種至6 孔板，每孔3×105個細胞/2 ml DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。用無血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP-P120ctn至1 μg/100 μl，取100 μl加入X-tremeGene HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑3 μl，15～25 ℃孵育30 min，將混合液加入每孔中。37 ℃孵育24 h后，改用含80 μg/ml G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。反復(fù)篩選，收集具有G418抗性的細胞克隆增殖，命名為HN12/P120ctn。

1.3 PMA激活試驗

HN12/P120ctn細胞加入PKC激活劑佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，命名為HN12/P120ctn+PMA，使終濃度分別為0、25、50、100 ng/ml。觀察0、24、48、72 h細胞遷移和侵襲的情況，篩選出最佳分析時間點和濃度點，并根據(jù)所選出的最佳分析時間點和濃度點，進行PKC、P120ctn、E-cad、N-cad、Vim mRNA和蛋白水平的檢測。

1.4 實時熒光定量PCR

引物合成委托上海生工生物工程公司完成。用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，進行cDNA合成，反應(yīng)體系為Oligo dT primer(50 μmol/L)1 μl，dNTP Mixture 1 μl，Total RNA 5 μg，加入RNase free dH2O 補至10 μl，在PCR儀上進行以下條件的反轉(zhuǎn)錄：42 ℃，15 min,70 ℃ 30～60 min。-20 ℃保存。使用熒光PCR儀對HN4、HN12和HOK細胞中的P120ctn基因和E-cad基因進行定量檢測，反應(yīng)條件94 ℃、5 min，93 ℃預(yù)變性35 s，56 ℃變性30 s，71 ℃退火60 s，72 ℃延伸7 min，30 個循環(huán)。

1.5 Western blot

常規(guī)收獲細胞，提取蛋白上樣，加入瓊脂糖凝膠電泳10 mA 2 h，根據(jù)Marker分子量截取目的條帶，100 V衡壓1 h，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上， 5%的脫脂奶粉封閉后加入一抗4 ℃搖動孵育過夜，充分蕩洗，HRP標記二抗室溫孵育，洗膜曝光。

1.6 Transwell細胞侵襲及細胞遷移試驗

遷移實驗采用培養(yǎng)基和Transwell小室放在37 ℃溫育。消化對數(shù)生長期的HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA細胞，加入無血清培養(yǎng)基計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至2×105/ml，上室加入200 μl細胞懸液，下室加入800 μl含20%血清的培養(yǎng)，48 h后固定、染色，統(tǒng)計結(jié)果。侵襲實驗在Transwell上室底部中央鋪Matrigel膠，后續(xù)步驟同遷移實驗。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 HN12/P120ctn、HN12/P120ctn+PMA細胞形態(tài)的觀察

HN12/P120ctn以多角形細胞為主，細胞匯聚成片，HN12/P120ctn+PMA細胞的表現(xiàn)則為：出現(xiàn)較多梭形細胞，細胞大小不等，形態(tài)不規(guī)則，分布較為分散(圖 1)。

圖 1 HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后細胞形態(tài)

Fig 1 The cell morphology treated by HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA cell

2.2 PKC激活劑PMA對HN12/P120ctn細胞EMT的影響

用PMA處理HN12/P120ctn細胞后發(fā)現(xiàn)，隨著PKC表達的顯著降低，P120ctn、E-cad的mRNA(圖 2)和蛋白(圖 3)表達水平明顯升高，而其他EMT標記物N-cad和Vim mRNA(圖 4)和蛋白(圖 5)表達水平顯著降低。

2.3 PKC激活劑PMA對HN12/P120ctn細胞遷移和侵襲能力的影響

HN12/P120ctn細胞加入PMA，檢測細胞遷移(圖 6)和侵襲(圖 7)能力的變化，Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，HN12/P120ctn+PMA細胞穿過Transwell小室微孔的數(shù)量顯著高于HN12/P120ctn；侵襲實驗結(jié)果顯示，HN12/P120ctn+PMA顯著低高于HN12/P120ctn，因此，PMA對HN12/P120ctn細胞遷移和侵襲能力存在促進作用(P<0.05)。

3 討 論

PKC存在于細胞質(zhì)內(nèi)，是由鈣活化的磷脂依賴性絲-蘇氨酸蛋白激酶，被激活后與胞膜內(nèi)壁結(jié)合作用于底物，能夠使底物蛋白分子內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化。PKC與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，在OSCC細胞系TSCCA中，PKC的抑制劑staurosporine活化了細胞凋亡蛋白酶caspase-3[7]，降低了細胞遷移和侵襲的能力；此外，Lai等[8]也發(fā)現(xiàn)活化PKC途徑可以導(dǎo)致OSCC細胞遷移和侵襲，這些都提示PKC可能參與了OSCC的發(fā)生和發(fā)展。肝癌細胞系HepG2所處的酸性環(huán)境能夠誘導(dǎo)黏附連接中P120ctn的表達下調(diào)和絲氨酸去磷酸化，PKCα and δ基因敲除能夠阻斷這一過程的發(fā)生，提示PKC被激活后可能可以作用于在細胞膜表達的P120ctn，使P120ctn絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生去磷酸化[9,10]。

圖 2 PKC mRNA、P120ctnmRNA和E-cad mRNA在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細胞中的表達 圖 4 N-cad mRNA和Vim mRNA在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細胞中的表達

Fig 2 Expression of PKC mRNA, P120ctnmRNA and E-cad mRNA in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells Fig 4 Expression of N-cad mRNA and Vim mRNA in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells

圖 3 PKC、P120ctn和E-cad蛋白在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細胞中的表達 圖 5 N-cad和Vim蛋白在HN12/P120ctn和HN12/P120ctn+PMA處理后的細胞中的表達

Fig 3 Expression of PKC, P120ctnand E-cad protein in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells Fig 5 Expression of N-cad and Vim protein in HN12/P120ctnand HN12/P120ctn+PMA treated cells

圖 6 PMA對HN12/P120ctn細胞遷移能力的影響

圖 7 PMA對HN12/P120ctn細胞侵襲能力的影響

P120ctn是連環(huán)蛋白家族的新成員，連環(huán)蛋白(catenin，ctn)是一個有相似結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)糖蛋白家族，能與E-cad構(gòu)成連環(huán)蛋白-鈣黏蛋白復(fù)合體(cadherin catenin complex，CCC)，使E-cad被固定在細胞骨架上，與相鄰細胞形成穩(wěn)定的連接。P120ctn是唯一與E-cad胞內(nèi)肽段近膜端(juxtamembrane domain，JMD)結(jié)合的連環(huán)蛋白，參與聚集和穩(wěn)定細胞膜上的鈣黏蛋白，調(diào)控鈣黏蛋白介導(dǎo)的細胞間的黏附穩(wěn)定[11,12]。P120ctn與E-cad結(jié)合的關(guān)鍵部位便是磷酸化位點，P120ctn的磷酸化可能調(diào)節(jié)了鈣黏蛋白的結(jié)合和穩(wěn)定性[13,14]，從而影響CCC的穩(wěn)定性，在磷酸化降低時，細胞黏附能力會發(fā)生異常。越來越多的證據(jù)表明，P120ctn的絲/蘇氨酸磷酸化可能直接調(diào)節(jié)著P120ctn的功能[9]，并且PKC可能是一個重要的信號媒介。我們的試驗發(fā)現(xiàn)當PKC被PMA激活時，P120ctn高表達的HN12/P120ctn細胞中P120ctn和E-cad的表達隨之降低，提示在OSCC中PKC可能通過磷酸化調(diào)節(jié)了P120ctn和E-cad的表達。

EMT是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要因素之一，是指在某些特定的生理病理情況下，上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為上皮細胞極性喪失，細胞黏附減弱，轉(zhuǎn)化為成纖維細胞樣形態(tài)，運動能力增強。鈣黏蛋白屬于黏蛋白家族，與膜轉(zhuǎn)移相關(guān)，是EMT的重要的分子生物學基礎(chǔ)，是鈣依賴的具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細胞黏附分子[15]。E-cad是近年來研究較多的一種細胞黏附分子，它可能通過增強同型質(zhì)細胞間的黏附，使腫瘤細胞之間連接緊密，難以脫離原發(fā)部位進入周圍的組織或血管，從而抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)生。當E-cad缺失時單個腫瘤細胞通過以下2 種方式之一運動遷移：間充質(zhì)樣細胞運動(通過蛋白水解酶使腫瘤組織邊緣的單個細胞發(fā)生定向運動)或阿米巴運動。后者通常表現(xiàn)為細胞極性缺失的非定向運動。與之相反，另一種鈣黏蛋白，N-鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)在發(fā)生EMT時表達上調(diào)[16]，N-cad可能促進了腫瘤細胞的運動和遷移，在三維環(huán)境中N-cad是調(diào)控細胞集體遷移的重要因素。波形蛋白(Vimentin，Vim)是EMT的另一個特征性標記蛋白，正常表達于各種細胞類型中，在各種腫瘤細胞系中高表達，包括前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、惡性黑色素瘤和胃腸道腫瘤[17]。腫瘤蛋白質(zhì)組學的研究發(fā)現(xiàn)與其他特異性蛋白改變包括能量代謝和信號傳導(dǎo)以及細胞骨架構(gòu)成和細胞運動一致，在肝內(nèi)膽管癌[18]、SK-Hep-1肝癌細胞系[19]和胰腺導(dǎo)管癌[20]中Vim的表達水平與EMT的啟動和高度惡性表型相關(guān)。Chaw[21]等對100 例口腔組織(包括正常組織、輕度異常增生、中重度異常增生和口腔鱗癌)的免疫組化研究表明，EMT標記物的表達趨勢提示它們參與了口腔癌的發(fā)展，它們的異常表達是惡性轉(zhuǎn)化的潛在標記物。

本試驗發(fā)現(xiàn)當PKC被激活時，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)梭形細胞；除E-cad表達發(fā)生改變之外，其他EMT標記物N-cad和Vim的表達水平顯著升高，同時HN12/P120ctn細胞的遷移和侵襲能力顯著提高，提示在口腔鱗癌細胞系中PKC可能通過P120ctn參與了EMT，在腫瘤的遷移和侵襲中發(fā)揮了作用。這與前人在乳腺癌中的研究結(jié)果一致，在三陰乳腺癌中，P120ctn在S268絲氨酸位點的磷酸化調(diào)節(jié)依賴于PKC ε，在一個PKCε激活的模型中，抑制PKCε將阻斷其向間質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)化[22]，從而抑制EMT的發(fā)生。

綜上，我們推測，PKC可能通過磷酸化調(diào)節(jié)了P120ctn的表達，參與了細胞黏附的調(diào)控，促進了EMT，在口腔鱗癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮了作用。

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TheeffectsofPKCactivationontheepithelial-mesenchymaltransitionoforalsquamouscellcancercells

CHENZhong，ZHENGXiaodan，XUYong.

361008,DepartmentofStomatology,XiamenMedicalCollege,China

Objective： To study the effects of activating protein kinase C(PKC)on oral squamous-cell cancer(OSCC) cell epithelial-mesenchymal transition(EMT).MethodsPlasmid pCMV6-AC-GFP-P120ctnwas used to transfect HN12 cells to make P120-catenin(120ctn) overexpress and thereafter PKC activator PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) was added to the culture. Real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot were adopted to test mRNA and protein expression of PKC, P120ctn, E-cadherin(E-cad), N-cadherin(N-cad) and Vimentin(Vim). Transwell cell invasion and cell migration assay were used to test the invasion and migration capacity before and after the activation.ResultsWhen PKC was activated by PMA, the expression of P120ctnand E-cad were decreased, the cell morphology changed, mRNA and protein expression of mesenchymal marker protein N-cad and Vim increased significantly. Meanwhile, the migration and invasion capacity of the tumor cells increased significantly(P<0.05).ConclusionIn OSCC cells, PKC may be involved in promoting EMT and the metastasis and invasion by adjusting P120ctn/E-cad expression and cell adhesion.

P120-catenin(P120ctn);ProteinkinaseC(PKC);Epithelial-mesenchymaltransition(EMT);Oralsquamous-cellcancer(OSCC)

廈門醫(yī)學院自然科學基金(編號： Z2013-02)

361008， 廈門醫(yī)學院口腔醫(yī)學系

陳鐘 E-mail： 310571932@qq.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.022

(收稿： 2017-05-25 修回： 2017-07-18)