張 鵬，朱 靜，呂曉蘭，張興旺，崔 波

陜西省榆林市第一醫(yī)院(榆林719000)

·臨床病理·

PAK4與P54蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

張 鵬，朱 靜，呂曉蘭，張興旺，崔 波△

陜西省榆林市第一醫(yī)院(榆林719000)

目的：研究p21-activated kinase(pAK)-4和P54蛋白在乳腺癌中的表達(dá)和相互作用。方法：選擇乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌和乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤組織各20例，用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)pAK-4表達(dá)，比較其與不同病理特征的關(guān)系。用免疫熒光法體外觀察P54亞細(xì)胞定位及與PAK4的共定位情況。結(jié)果：乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤組織和乳腺癌中PAK4表達(dá)陽(yáng)性率逐漸增加，陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于胞漿，尤以核周明顯，細(xì)胞基質(zhì)未見明顯染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。非浸潤(rùn)性癌、早期浸潤(rùn)癌、晚期浸潤(rùn)癌中PAK4表達(dá)陽(yáng)性率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過(guò)共聚焦實(shí)驗(yàn)證實(shí)P54定位在細(xì)胞漿，且和PAK4有共定位。結(jié)論：PAK4和P54蛋白可能作為診斷和治療乳腺癌的重要敏感分子標(biāo)志物。

乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，約占全身惡性腫瘤的7%～10%[1]。外周血腫瘤標(biāo)志物是早期診斷乳腺癌的重要方法，目前常用的血清腫瘤標(biāo)志物有CA125、CEA、TPS[2]，病理標(biāo)本檢測(cè)HER-2/Neu、ER、PR、EGFR、VGFR、VEGF等[3]，陽(yáng)性率和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均不甚理想，往往僅作為臨床診斷和治療的參考指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的磷酸化和去磷酸化修飾之間的平衡狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[4]。已有部分研究指出[5]，p21-activated kinase(pAK)-4在乳腺癌和卵巢癌中呈高表達(dá)。基于此，該研究進(jìn)一步探討pAK-4和主要作用蛋白P54在不同乳腺疾病中的表達(dá)情況。

資料與方法

1 材料選擇 連續(xù)選擇2016年4月至2017年4月入我院確診的20例乳腺癌和20例乳腺纖維瘤患者，年齡29～66歲，平均(42.5±10.3)歲。無(wú)藥物治療、手術(shù)切除和放化療史，無(wú)嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能障礙，無(wú)其他惡性腫瘤。該研究取得患者和家屬的知情同意權(quán)，其中癌旁正常組織、乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移瘤組織均取自同一患者，每種組織取不同位點(diǎn)的3份標(biāo)本，由同一經(jīng)驗(yàn)豐富的專家完成，標(biāo)木經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，作4μm連續(xù)切片。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 主要試劑：兔抗人PAK4抗體(美國(guó)Sigma公司)，正常兔IgG(南京碧云天科技有限公司)，S-P免疫組化試劑盒(福建邁新生物技術(shù)公司)，過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(深圳晶美生物有限公司)，EDTA抗原修復(fù)液(上海奉賢申鑫化工廠)，DAB顯色試劑盒(廣州杰特偉公司)。

2.2 主要儀器與設(shè)備：OLYMPUSBX4O光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，3K30高速離心機(jī)(日木OLYMPUS公司)，UNO11型PCR儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，紫外透射儀(德國(guó)Biometra公司)，CU600型電熱恒溫水浴箱(日本柯達(dá)公司)，組織切片機(jī)(德國(guó)leica)，SANYO超低溫冰箱(日本)。

2.3 免疫組織化學(xué)：石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5～10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗、PBS浸泡、抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液室溫20min；滴加一抗兔抗人PAK4多克隆抗體50μl(l∶200稀釋)37℃孵育2h，4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫45min。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體37℃孵育30min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育30min。PBS洗滌、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、氨水返藍(lán)、脫水、透明、封片、鏡檢。

2.4 結(jié)果判定：參照Campo等標(biāo)準(zhǔn)：以陽(yáng)性染色細(xì)胞比率與染色強(qiáng)度之和為總積分，其中以陽(yáng)性染色細(xì)胞比率<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，≥51%計(jì)3分；染色強(qiáng)度無(wú)計(jì)0分，弱染色計(jì)1分，中等強(qiáng)度計(jì)2分，高等強(qiáng)度計(jì)3分；總積分0～1分為陰性，2～3為弱陽(yáng)性，4分為中等陽(yáng)性，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性。

2.5 免疫熒光法：以PBS溶液重懸細(xì)胞濃度為1×106/ml，采用微量移液器將其轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔10μl，每組設(shè)立3個(gè)副孔，結(jié)果取其平均值。加入雙無(wú)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h，相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁外轉(zhuǎn)P54及PAK4蛋白表達(dá)質(zhì)粒；然后換成雙有DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，保證外轉(zhuǎn)質(zhì)粒的正常蛋白表達(dá)。棄去培養(yǎng)基，加700μl 4%多聚甲醛常溫固定10min。加入1ml 0.1%Triton-X-100常溫10min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化。1%羊血清常溫封閉1h，加入適宜濃度的一抗常溫孵育l h；加入Alexa-546紅色標(biāo)記的二抗避光常溫封閉l h，Topro-3染核避光染色30min；甘油封片，在共聚焦激光掃描顯微鏡上觀察P54及PAK4蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，非連續(xù)性等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PAK4蛋白在不同乳腺組織中的表達(dá) 乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤組織和乳腺癌中PAK4表達(dá)陽(yáng)性率逐漸增加，陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于胞漿,尤以核周明顯,細(xì)胞基質(zhì)未見明顯染色，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 PAK4蛋白在不同乳腺組織中的表達(dá)(例)

注：Kruskal-Wallis值15.623，P<0.001

2 PAK4蛋白在不同病理類型中的表達(dá) 非浸潤(rùn)性癌、早期浸潤(rùn)癌、晚期浸潤(rùn)癌中PAK4表達(dá)陽(yáng)性率逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2

表2 PAK4蛋白在不同病理類型中的表達(dá)(例)

注：Kruskal-Wallis值12.432，P<0.001

3 P54和PAK4蛋白的細(xì)胞定位 通過(guò)共聚焦實(shí)驗(yàn)證實(shí)P54定位在細(xì)胞漿,且和PAK4有共定位。

討 論

近年來(lái)，在分子水平對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞形成、增殖、分化、轉(zhuǎn)移等研究取得顯著進(jìn)展[6]。PAKs又稱p21小GTP酶活化激酶，相對(duì)分子量為21kD，是絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸化激酶家族的成員之一。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，調(diào)控PAKs基因轉(zhuǎn)錄的上游分子中有Rho家族的小GTP酶Cdc42和Racl，可表現(xiàn)激酶活性[7]。研究證實(shí)，PAK4在細(xì)胞損失修復(fù)、生長(zhǎng)增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管新生等病理生理方面發(fā)揮重要作用，是與人類多種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展關(guān)系十分密切的基因和蛋白[8]。通過(guò)該研究得出：乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤和乳腺癌中PAK4陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增加，陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于胞漿，核周最明顯，細(xì)胞基質(zhì)未見明顯染色，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非浸潤(rùn)性癌、早期浸潤(rùn)癌、晚期浸潤(rùn)癌中PAK4表達(dá)陽(yáng)性率逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明PAK4可能作為一種敏感檢測(cè)指標(biāo)，在判斷乳腺癌的惡性程度和病理類型中有重要意義。

李彥姝等研究[9]通過(guò)構(gòu)建PAK4過(guò)表達(dá)真核載體和ShRNA技術(shù)構(gòu)建低表達(dá)載體，并分別成功轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，結(jié)果得出上調(diào)乳腺癌細(xì)胞PAK4表達(dá)可以明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖活性，抑制其凋亡率，增加細(xì)胞粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)致瘤等活性，反之亦然。正常乳腺腺體上皮存在活躍的細(xì)胞增殖和凋亡，兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡可能是乳腺細(xì)胞清除受損衰老細(xì)胞的主要機(jī)制之一[10]。在細(xì)胞基因和結(jié)構(gòu)正常修復(fù)過(guò)程中，PAKs家族起重要作用，研究表明PAK4受生長(zhǎng)因子調(diào)控[11]。

P54蛋白是一種神經(jīng)特異性的蛋白，是有效的微管不穩(wěn)定因子-膜相關(guān)蛋白。P54為PAK4腫瘤信號(hào)通路的進(jìn)一步完善提供了新依據(jù)。P54的中心調(diào)節(jié)區(qū)域中存在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶 A(PKA)的磷酸化位點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)微管蛋白的解聚過(guò)程[12]。通過(guò)該研究得出：P54定位在細(xì)胞漿，和PAK4有共定位。有研究[13]通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出PAK4的相互作用蛋白中有P54，并將其共轉(zhuǎn)到AH109酵母菌體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示兩者能夠相互作用。此外，GST-pull down實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了兩者在體外的相互作用，而免疫沉淀實(shí)驗(yàn)則驗(yàn)證了兩者的體內(nèi)相互作用。

綜上所述，AK4和P54蛋白可能作為診斷和治療乳腺癌的重要敏感分子標(biāo)志物。

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△通訊作者

乳腺腫瘤/病理學(xué) PAK4蛋白 P54蛋白 免疫組織化學(xué)

R365

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.042

(收稿：2017-02-28)