邱化榮，周茜茜，何曉文，張宗營，張世忠，陳學森，吳樹敬

?

基于轉(zhuǎn)錄組分析蘋果水楊酸特異響應基因的啟動子鑒定

邱化榮，周茜茜，何曉文，張宗營，張世忠，陳學森，吳樹敬

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

探明水楊酸（SA）對蘋果葉片基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，鑒定SA信號途徑及其調(diào)控基因，為研究SA介導的抗病分子機制提供理論依據(jù)。生長30 d的‘嘎啦’組培苗葉片用2 mmol?L-1水楊酸（SA）處理12 h，以CTRL（0.2%乙醇）處理作為對照，利用Illumina HiSeqTM 2000進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過綜合的生物信息學分析（差異基因篩選、條件特異性分析、GO分類及KEGG富集分析等）篩選SA信號途徑的調(diào)控基因?？寺∈躍A特異性誘導表達基因的啟動子，利用蘋果細胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術，進行啟動子活性鑒定，確定對SA進行特異性響應的核苷酸序列。CTRL和SA處理分別獲得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始數(shù)據(jù)，分別有44.77%和43.88%與‘金冠’蘋果基因組完全匹配。獲得3 329個顯著性差異基因，包括苯丙烷類、類黃酮等次生代謝物生物合成途徑的相關基因（如木質(zhì)素合成關鍵酶CAD、細胞色素P450、真菌抗性相關的β-1,3-葡聚糖酶等），調(diào)控植物病原菌互作途徑重要功能基因（鈣調(diào)蛋白CaM、抗病蛋白RPM1、熱激蛋白HSP90、WRKY轉(zhuǎn)錄因子等）以及33個條件特異性誘導表達基因（NAC轉(zhuǎn)錄因子、NIMIN1、WRKY40、ERF轉(zhuǎn)錄因子等）。其中1 085個基因上調(diào)，2 244個基因下調(diào)。差異基因主要涉及細胞過程、代謝過程和基因綁定、催化活性等；根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學的結果，將SA響應基因的啟動子序列克隆到含有熒光素酶基因的表達載體中，置于熒光素酶基因的上游，轉(zhuǎn)化蘋果原生質(zhì)體細胞。SA處理的原生質(zhì)體細胞，熒光素酶的活性為未經(jīng)SA處理的20.6倍，而脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）對熒光素酶的活性沒有影響，說明該啟動子為蘋果中對SA進行特異性響應的啟動子序列。不同區(qū)段的啟動子片段對SA響應能力不同，從翻譯起始位點ATG向上游500—1 000 bp只能響應高濃度SA，而對低濃度SA不具有響應能力，1 500 bp片段對高濃度SA響應能力進一步顯著增強，對低濃度SA響應也有微弱提高；而長度為2 000 bp的核苷酸片段無論對高濃度SA還是對低濃度SA都具有顯著響應能力，且達到最強。與2 000 bp片段相比，2 500 bp的核苷酸片段沒有進一步增強啟動子片段對SA的響應能力。超表達MdWRKY40蛋白對其自身的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。2 mmol·L-1SA處理所影響的基因主要參與了苯丙烷類、類黃酮的生物合成，植物病原菌互作及植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑。位于開放閱讀框上游的2 500 bp核苷酸序列，為對SA進行特異性響應的核苷酸啟動子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有顯著提高啟動子對SA敏感性的未知核苷酸序列，另外，轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在反饋抑制機制。

SA；蘋果；轉(zhuǎn)錄組；信號轉(zhuǎn)導；植物病原菌互作

0 引言

【研究意義】蘋果是世界上栽培最廣泛的水果之一，因其味道鮮美，且富含營養(yǎng)價值，深受人們喜愛。作為多年生木本植物，其產(chǎn)量和果實品質(zhì)易受生物和非生物脅迫的影響，特別是病原菌侵害，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。水楊酸（salicylic acid，SA）作為一種植物激素，不僅能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育和代謝過程，而且在生物和非生物脅迫反應中起到積極的調(diào)控作用[2]。研究表明SA在鼠李糖脂誘導的植物抗性反應中處于中心位置，Sanchez等[3]通過對細菌中鼠李糖脂誘導的植物對活體營養(yǎng)型病菌、腐生營養(yǎng)型病菌及兼性寄生菌pv.的抗性研究發(fā)現(xiàn)，SA參與了這3種病菌的抗性，而乙烯僅僅參與了和pv.的抗性反應，茉莉酸僅參與了對的抗性。外源SA處理能夠增強蘋果葉片對炭疽病的抗性[4]，在富士蘋果中過表達SA信號途徑的關鍵調(diào)控因子能夠提高對白粉病的抗性[5]。外源SA處理能夠誘導辣椒的抗疫病[6]，以及水稻幼苗對白葉枯病的抗性[7]。除此之外，SA還能夠提高植物對非生物脅迫的抗性，如SA能夠誘導黃瓜中冷害響應基因的表達，并減弱冷害脅迫對黃瓜的傷害，增強植物對冷害的抗性[8]。SA信號途徑對植物抗病抗逆性調(diào)控具有重要作用。雖然根據(jù)前人的研究結果，顯示SA在植物的抗病抗逆信號轉(zhuǎn)導中具有舉足輕重的作用，但是，在蘋果這種多年生的高等植物中，SA的信號轉(zhuǎn)導途徑一直不清楚。利用RNA-seq探究SA對蘋果葉片轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，對解析SA信號轉(zhuǎn)導途徑具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】盡管SA在模式植物擬南芥中取得了很大的進展，但在蘋果中，SA如何進行信號轉(zhuǎn)導，依然知之甚少，蘋果SA 信號通路目前尚不明確。張計育等[9]構建了SA處理湖北海棠的全長cDNA文庫，并克隆了與病菌抗性相關的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因全長。不同濃度SA處理對表達產(chǎn)生不同影響，高濃度SA促進蘋果葉片中的表達，低濃度SA則抑制其表達[10]。外源SA提高了蘋果葉片中過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）及苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性并誘導和的上調(diào)表達[11]。羅昌國等[12]克隆了調(diào)控富士蘋果白粉病抗性的關鍵基因，該基因表達受SA的強烈誘導。SA通過與靶蛋白互作發(fā)揮其功能，目前其調(diào)控途徑的靶蛋白在很大程度上還未知[13]。SA信號通路主要圍繞、轉(zhuǎn)錄因子（TGACA元件綁定因子）及病程相關蛋白基因等進行研究。只在SA誘導條件下表達，是調(diào)控SA介導的系統(tǒng)獲得抗性（SAR）的關鍵基因。擬南芥突變體無法誘導的表達，增強了對病原菌的感病性[14]。研究表明TGA1-TGA7均可與NPR1互作，調(diào)控SA響應基因[15-16]。NPR1增強TGA轉(zhuǎn)錄因子與防衛(wèi)基因啟動子as-1元件的結合[17]。目前SA誘導植物抗病性研究主要利用不同植物和病原菌的互作。例如外源SA誘導顯著減弱了番茄維管束褐變及葉片黃萎現(xiàn)象，增強對鐮刀菌的抗性[18]?！颈狙芯壳腥朦c】蘋果SA信號途徑研究較少，其信號通路和分子機制有待明確。【擬解決的關鍵問題】RNA-seq是利用高通量測序研究細胞內(nèi)基因表達的方法，本研究以SA處理的蘋果葉片為研究試材，采用RNA-seq的研究方法，以獲得在蘋果中響應水楊酸的基因，構建能夠?qū)A進行特異性響應的啟動子鑒定體系，為深入研究SA信號轉(zhuǎn)導途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試材料為‘嘎啦’組培苗葉片，組培苗于24℃，12 h/12 h光暗環(huán)境下培養(yǎng)30 d，選取長勢一致的葉片、將其浸入2 mmol?L-1SA溶液中，24℃下處理12 h，濾紙吸干表面水分，液氮迅速冷凍，-80℃保存，以備RNA提取；以0.2%乙醇水溶液處理的葉片為對照。重復3次。

1.2 RNA提取及測序

利用天根公司的植物總RNA提取試劑盒（DP424）提取RNA（操作步驟見說明書）。檢測合格后，經(jīng)DNase I處理，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，高溫條件下加入適量打斷試劑使其片斷化，再以片段mRNA為模板合成cDNA，經(jīng)過磁珠純化、末端修復、3′末端加堿基A、加測序接頭后，進行PCR擴增，完成文庫制備。Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlusRealTime PCR System進行文庫質(zhì)量和產(chǎn)量檢測。測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)堿基識別分析后得到原始測序序列，去除含接頭、含N比例大于10%、低質(zhì)量的序列后得到適合分析的數(shù)據(jù)。使用比對軟件BWA[19]和Bowtie[20]將數(shù)據(jù)比對‘金冠’蘋果基因組。

1.3 差異基因篩選、功能分析及條件特異性表達分析

差異基因篩選：利用RSEM工具進行基因表達定量，表達定量結果以FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）為單位，F(xiàn)DR（false discovery rate）≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因為差異基因。將差異基因與Nr數(shù)據(jù)庫比對后進行注釋。

條件特異性表達分析：條件特異性表達分析通過幾種不同條件下差異基因的比較，鑒定在某種特定條件下才表達的基因。利用3種植物激素處理蘋果葉片進行轉(zhuǎn)錄組學研究，對CTRL1（無菌水）、CTRL2（0.2%乙醇）、水楊酸（2 mmol?L-1SA）、1-氨基環(huán)丙烷羧酸（10 μmol?L-1ACC）、茉莉酸甲酯（100 μmol?L-1MeJA）這5個處理樣品的測序數(shù)據(jù)進行分析，根據(jù)其他兩類激素轉(zhuǎn)錄組學的研究結果，應用如下統(tǒng)計學研究方法，得到SA特異性誘導表達的基因。其計算公式為：

其中，g為基因，i為樣品，x=ei(g)為基因g在樣品i中的數(shù)據(jù)數(shù)目，E(g)為基因g在所有樣品中數(shù)據(jù)數(shù)目。si為樣品i中所有數(shù)據(jù)數(shù)目，pi=si/∑isi。p≤0.05的基因定義為條件特異表達基因。

差異基因功能分析：所有SA處理得到的差異基因提交Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/），用WEGO軟件[21]對其進行GO功能分類分析。數(shù)據(jù)提交KEGG數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of gene and genomes），以KEGG途徑為單位，Qvalue≤0.05的途徑定義為在差異基因中顯著富集的途徑，分析差異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號途徑。

1.4 差異基因的qRT-PCR熒光定量分析

采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo公司）對1.2中RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以SYBRGreen染料進行熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。蘋果肌動蛋白基因（序列號為GQ339778）作為內(nèi)參，基因表達倍數(shù)通過2-△△Ct法計算。3次重復。差異基因的特異性引物由生工生物工程有限公司合成（詳細引物序列見表1）。

1.5 SA信號途徑特異性啟動子的鑒定及其生物信息學分析

根據(jù)qRT-PCR分析結果，選定SA誘導上調(diào)最顯著的基因以及受SA誘導調(diào)控不顯著的基因，克隆其啟動子序列，將啟動子克隆到含有編碼熒光素酶基因的表達載體中，并置于熒光素酶基因之前，用以驅(qū)動熒光素酶基因。采用PEG法轉(zhuǎn)化蘋果愈傷原生質(zhì)體，常溫表達3 h后，利用2 mmol?L-1SA、100 μmol?L-1MeJA、10 μmol?L-1ACC、10 μmol?L-1ABA、5 mmol?L-1EGTA（Ca2+螯合劑）分別處理3 h，收集原生質(zhì)體，加入裂解液，用酶標儀（PerkinElmer公司，型號為VICTOR X4）測定LUC（熒光素酶，luciferase）和GUS值，分析LUC/GUS比值，鑒定SA途徑的特異性響應啟動子序列。表達載體構建及原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化的詳細流程參見He等[22]的方法。

構建該基因的MBP融合表達載體pMAL-gene- 2HA，誘導蛋白表達并進行純化，用于后續(xù)研究。利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子順式作用元件分析。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)測序質(zhì)量評估及差異基因、條件特異表達基因的篩選

對照和SA處理分別得到750 439 459 bp和751 596 153 bp測序數(shù)據(jù)，其中，71.72%和71.29%定位于蘋果基因組，44.77%和43.88%的序列與‘金冠’蘋果基因組數(shù)據(jù)[23]中的基因完全匹配（表2）。結果表明：共篩選到3 329個差異表達基因，其中上調(diào)基因1 085個，下調(diào)基因2 244個（圖1）。

在本轉(zhuǎn)錄組學的研究中，除對SA進行轉(zhuǎn)錄組學研究外，還對ACC（乙烯合成前體物質(zhì)）、MeJA（茉莉酸甲酯）的轉(zhuǎn)錄組學進行對比與統(tǒng)計學計算，篩選到蘋果基因組中33個只被SA誘導的特異表達基因（圖2），包括轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000252435）、轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000263349）、（MDP0000280322）、鋅指結構基因（MDP0000289278）、轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000830129）以及未知功能基因等（表3）。

左圖：橫坐標表示CTRL樣品表達量的對數(shù)值，縱坐標表示SA樣品表達量的對數(shù)值。橙色三角代表上調(diào)基因，藍色方塊代表下調(diào)基因，褐色圓點代表非顯著差異基因。右圖：1代表上調(diào)基因，2代表非顯著差異基因，3代表下調(diào)基因

表1 用于qRT-PCR分析的基因及引物

2.2 差異基因的GO分類

GO分析將差異基因分為參與生物過程、細胞成分和分子功能3部分（圖3）。參與生物過程差異基因分為16類，其中細胞過程（cellular process，54.2%）、代謝過程（metabolic process，78.4%）所占比例最多，其次為單細胞過程（single-organism process，33.6%）。細胞成分中，細胞（cell，64.1%）、細胞組分（cell part，64.1%）所占比例最多，其次為膜結構（membrane，39.6%）以及細胞器（organelle，33%）。分子功能的綁定（binding，55.4%）、催化活性（catalytic activity，77%）差異基因所占比例最多，其次為轉(zhuǎn)運活性（transporter activity，7.2%）、分子轉(zhuǎn)導活性（molecular transducer activity，3.6%）以及核酸綁定轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity，2.2%）等。

圖2 條件特異表達基因的篩選

表2 樣品與‘金冠’蘋果基因組序列的比對結果

表3 SA誘導的條件特異表達基因

1：生物相；2：生物調(diào)節(jié)；3：細胞組分組織或生物形成；4：細胞過程；5：發(fā)育過程；6：免疫系統(tǒng)過程：；7：定位；8：代謝過程；9：多細胞有機體過程；10：生物過程積極調(diào)控；11：生物過程調(diào)控；12：復制；13：復制過程；14：刺激反應；15：信號；16：單一生物過程；17：細胞；18：細胞成分；19：胞外區(qū)：；20：胞外區(qū)部分；21：大分子復合物；22：膜；23：膜附著腔；24：膜組分；25：細胞器；26：細胞器部分；27：抗氧化活性；28：綁定；29：催化活性；30：酶調(diào)節(jié)器活性；31：分子轉(zhuǎn)導活性；32：核酸綁定轉(zhuǎn)錄因子活性；33：蛋白綁定轉(zhuǎn)錄因子活性；34:受體活性；35：結構分子活性；36：轉(zhuǎn)運蛋白活性

2.3 差異基因KEGG富集分析及受SA影響的次生代謝基因

通過KEGG富集分析，確定差異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號途徑。根據(jù)≤0.01，找到30個與整個基因組背景相比顯著富集的途徑（圖4）。KEGG分析的結果發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集途徑主要有4個，其中代謝途徑差異基因608個，占29.49%；次生代謝物質(zhì)合成途徑411個，占19.93%；植物-病原菌互作途徑235個，占11.4%；植物信號轉(zhuǎn)導途徑182個，占8.83%。

1：次生代謝的生物合成；2：代謝途徑；3：果糖和甘露醇代謝；4：植物激素信號轉(zhuǎn)導；5：維生素B6代謝；6：晝夜節(jié)律；7：光合作用-天線蛋白；8：脂肪酸代謝；9：類黃酮生物合成；10：卟啉和葉綠素代謝；11：甘油酯代謝；12：類胡蘿卜素生物合成；13：丙酮酸代謝；14: 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸退化；15：油菜素內(nèi)酯生物合成；16：谷胱甘肽代謝：17：半乳糖代謝：18：糖酵解和糖質(zhì)新生；19：苯丙素的生物合成；20：亞麻酸代謝；21：維生素C代謝；22：植物-病原菌互作；23：其他多糖降解；24：萜類化合物生物合成；25：ABC轉(zhuǎn)運蛋白；26：糖胺聚糖降解；27：二羧酸代謝；28：類單萜生物合成；29：半胱氨酸和蛋氨酸代謝；30：氨基糖和核苷酸糖代謝

1：代謝途徑；2：次生代謝生物合成；3：植物病原菌互作；4：植物激素信號轉(zhuǎn)導

植物次生代謝途徑在植物抵抗生物與非生物脅迫反應中起重要的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)在次生代謝合成途徑中，SA上調(diào)基因124個，下調(diào)基因287個（圖5）。在24個上調(diào)比率≥5的基因中（表4），5個苯丙烷生物合成途徑基因，8個類黃酮合成途徑基因，3個花青苷生物合成途徑基因，4個維生素代謝途徑涉及基因，說明SA主要調(diào)控苯丙烷和類黃酮生物合成途徑。涉及苯丙烷生物合成途徑的基因包括羥基脯氨酸富集糖蛋白（MDP0000180381），甘露醇脫氫酶（MDP0000164361、MDP0000609114）和肉桂醇脫氫酶CAD（MDP0000448602、MDP0000858930），其中甘露醇脫氫酶通過調(diào)節(jié)甘露醇的合成增強植物的抗性[24]，其上調(diào)表達為研究SA增強抗性的分子機制提供理論依據(jù)。木質(zhì)素是植物細胞壁的一部分，增強了細胞壁的韌性，同時增強植物對脅迫反應的抵抗能力。肉桂醇脫氫酶CAD作用于整個木質(zhì)素合成途徑的最后一步，在木質(zhì)素合成中起到關鍵作用[25]。本研究中SA誘導CAD的上調(diào)表達，間接表明SA增強植物抵抗脅迫反應的能力，為研究SA誘導植物抗性的分子機制奠定了基礎。苯丙氨酸解氨酶PAL是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶，參與植物木質(zhì)素、類黃酮等次生代謝物質(zhì)的生物合成，其活性在SA誘導下呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[26]。本研究中SA未誘導PAL（MDP0000787168，-3.03）的上調(diào)，與前人研究結果不一致[11]，很可能是因為SA處理時間過長，導致PAL活性下降。在類黃酮生物合成途徑中，莨菪堿雙加氧酶（MDP0000472462、MDP0000183313、MDP0000229093），細胞色素P450家族（MDP0000221432、MDP0000196375），異黃酮羥化酶（MDP0000138677、MDP0000165503），黃酮醇合成酶（MDP0000130244）被SA誘導顯著上調(diào)。其中細胞色素P450一方面參與植物次生代謝的生物合成，一方面參與代謝解毒功能。維生素代謝途徑中的醛酮類還原酶（MDP0000804510、MDP0000046192、MDP0000158194、MDP0000246999）在SA誘導下表達量顯著提高，它們也是植物中重要的解毒酶，在植物的非生物脅迫反應中發(fā)揮重要作用[27]。SA調(diào)控花青苷的生物合成，其中3-氧-葡萄糖苷5-氧-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（MDP0000229280、MDP0000545122、MDP0000506825）在SA誘導下顯著上調(diào)。β-1,3-葡聚糖酶降解真菌細胞壁，有直接攻擊病原真菌的潛在能力[28]，在本研究中，SA誘導β-1,3-葡聚糖酶（MDP0000254363）的顯著上調(diào)，同時SA誘導上調(diào)細胞色素P450（MDP0000196375），該基因調(diào)控油菜素內(nèi)酯的生物合成。

表4 次生代謝生物合成途徑中的上調(diào)基因（表達比率≥5）

1：苯丙烷生物合成；2：類黃酮生物合成；3：油菜素內(nèi)酯生物合成；4：花青苷生物合成；5：萜類生物合成；6：維生素代謝

1: Phenylpropanoid biosynthesis; 2: Flavonoid biosynthesis; 3: Brassinosteroid biosynthesis; 4: Anthocyanin biosynthesis; 5: Terpenoid backbone biosynthesis; 6: Vitamin metabolism

2.4 植物病原菌互作途徑中受SA影響的抗病相關基因

在進化過程中，植物與病原菌的較量也在自然選擇過程中不斷改進，使植物形成了復雜的防御機制。植物的抗性分為基礎抗性和主動抗性。基礎抗性在病原菌入侵前就已存在，是植物抵抗病原菌的第一道防線，如植物本身的氣孔、皮孔、角質(zhì)層等。主動抗性是病原菌突破基礎抗性后激發(fā)的第二道防御系統(tǒng)，即免疫反應，激活一系列防衛(wèi)相關基因的表達，此過程需要轉(zhuǎn)錄因子等重要抗性功能基因的調(diào)控。其中植物與病原菌互作途徑在早期抵抗病原菌入侵中發(fā)揮重要作用。

本研究植物-病原菌互作途徑中被SA誘導61個基因上調(diào)，174個基因下調(diào)（圖5）。分析得到了該途徑中調(diào)控幅度較大的抗病相關基因（表5）。其中MAPK級聯(lián)反應在植物與病原菌互作過程中具有重要意義。MPK4能夠負調(diào)控植物的系統(tǒng)獲得抗性（SAR）。研究表明擬南芥突變體SA合成量提高，表達增強，表現(xiàn)出組成性的系統(tǒng)獲得抗性（SAR），提高了植物對病原菌的抗性[29]。利用外源SA對丹參處理2 h后能夠誘導及MAPK級聯(lián)途徑上游基因上調(diào)表達[30]，擬南芥被SA誘導且負調(diào)控SA介導的植物抗病反應[31]。本研究中SA誘導MAPK級聯(lián)途徑上游基因（MDP0000431417）上調(diào)，但對下游基因的轉(zhuǎn)錄水平無影響。調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進或抑制轉(zhuǎn)錄因子與下游靶蛋白啟動子結合，調(diào)控防衛(wèi)基因表達以及植物抗毒素的積累[32]。本研究SA對無影響，但下游轉(zhuǎn)錄因子被SA顯著誘導表達，包括與調(diào)控防衛(wèi)基因相關的轉(zhuǎn)錄因子MDP0000754989、MDP0000228304、MDP0000175240、MDP0000767097等。與MPK3/6相比，MPK4下游的轉(zhuǎn)錄因子MDP0000263349、MDP0000253189、MDP0000300712調(diào)控比率較大（表5）。由此推測，SA更側重于調(diào)控MPK4下游轉(zhuǎn)錄因子的表達。

植物病原菌互作途徑中上調(diào)趨勢較為明顯的還有抗病蛋白受體基因（MDP0000774112），（MDP0000300920），熱激蛋白基因（MDP0000254260），此外，鈣調(diào)蛋白（MDP0000785886）同樣被SA誘導上調(diào)表達。

熱激蛋白HSP90是一種高度保守且在脅迫反應中大量積累的蛋白，通常以分子伴侶的形式與靶蛋白形成復合物調(diào)控生物抗性反應[33]。核酸綁定和寡聚化域類受體（NLRs）感知不同病原菌的受體蛋白，病原菌受體的識別觸發(fā)植物防衛(wèi)反應，伴隨一系列細胞程序性死亡，即過敏反應[34]。RPM1屬于NLRs家族成員，擬南芥中HSP90對于NLRs的積累是必需的[35]。

表5 植物病原菌互作途徑調(diào)控基因（表達比率≥3）

HSP90與抗病蛋白RPM1結合，可通過改變分子伴侶活性改變RPM1的分子功能。本研究SA處理誘導（MDP0000254260）和（MDP0000774112）的上調(diào)，為研究SA增強植物抗病性的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

2.5 差異基因qRT-PCR熒光定量分析

選定24個差異表達基因（15個上調(diào)基因，9個下調(diào)基因）進行qRT-PCR分析。如圖6所示，15個上調(diào)基因中，除（MDP0000868782，1.7倍）誘導表達倍數(shù)較弱，其他基因均被SA誘導顯著上調(diào)。（MDP0000263349，4 615倍）、（MDP0000226971，3 241倍）、鈣調(diào)蛋白（MDP0000785886，3 219倍）和類固醇還原酶（MDP0000383328，1 293倍）上調(diào)倍數(shù)最顯著，其次為（MDP0000280322，572倍）、（MDP0000254260，359倍）等，抗病蛋白基因（MDP0000774112，128倍）、（MDP0000300920，112倍）也被SA誘導上調(diào)。9個下調(diào)基因中，（MDP0000277999）、（MDP0000711379）、（MDP0000138686）、（MDP0000256492）下調(diào)趨勢較明顯。（MDP0000710349）、（MDP0000247896）和（MDP0000232344）雖然調(diào)控趨勢不明顯，但轉(zhuǎn)錄組分析其調(diào)控比率均≤1.5，表明SA對這3個基因的調(diào)控較弱。綜上所述，qRT-PCR結果表明各基因表達與轉(zhuǎn)錄組分析結果一致，只是在差異倍數(shù)上與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有所差別。

2.6 蘋果中SA特異性響應啟動子的鑒定

為進一步研究蘋果對SA的響應機制，本研究利用啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性進行分析。選定SA特異性響應基因作為研究對象，克隆了該基因的啟動子序列：從該基因開放閱讀框起始位點ATG，向上游2 500 bp的核苷酸序列（圖7）。以蘋果中對SA不敏感的基因（MDP0000710349）的啟動子（圖8）及擬南芥中對細菌鞭毛蛋白進行響應的（At2g19190）的啟動子（圖9）[36]為參考對照，檢測啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性。

熒光素酶活性分析表明，能夠?qū)A進行響應（圖10-A）。結果表明，經(jīng)SA處理，其熒光素酶活性為未經(jīng)SA處理的20.6倍；也能夠被SA誘導激活，但是，誘導倍數(shù)顯著低于；而另一基因（MDP0000710349）啟動子驅(qū)動的熒光素酶，經(jīng)SA處理后其活性僅為未處理的2.29倍，說明該片段對SA不具有或僅具有微弱的響應能力。

對基因的啟動子序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)序列中存在ABA/MeJA/GA/SA響應順式作用元件、病菌響應元件、防衛(wèi)脅迫響應元件等（圖7）。但是，進一步應用該啟動子序列的研究表明，除SA外，其他激素不能夠引起該啟動子片段的響應（圖10-B），說明該片段是對SA進行特異性響應的啟動子序列。同時，對和的啟動子序列進行分析發(fā)現(xiàn)，啟動子序列含有4個SA響應元件位點（圖9），而啟動子序列中不含SA響應元件（圖8）。

為進一步精細區(qū)分界定啟動子中對SA響應的順式作用元件，分別克隆了從開放閱讀框的翻譯起始位點ATG向上游500 bp、1 000 bp、1 500 bp、2 000 bp的核苷酸序列，并構建到表達載體中置于熒光素酶編碼基因的上游，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，檢測對SA的響應能力。研究表明，500 bp、1 000 bp的核苷酸序列，不具有對低濃度SA（0.2 mmol?L-1）的響應能力，而在1 500 bp時，對SA表現(xiàn)出微弱響應，但與1 000 bp相比，二者在統(tǒng)計學上差異不顯著；而長度達到2 000 bp時，顯著提高了熒光素酶活性，為未用SA處理的4.1倍，分別是500 bp、1 000 bp時SA處理條件下熒光素酶活性的2.3倍、3.3倍。說明，在1 000 bp—2 000 bp間具有顯著提高SA響應能力的核苷酸序列。而2 000 bp、2 500 bp的核苷酸序列在響應SA的水平上，不具有顯著差異（圖10-C，左）。

應用高濃度的SA處理，同樣證明了這一結論。用0.5 mmol?L-1SA處理原生質(zhì)體細胞，發(fā)現(xiàn)500 bp、1 000 bp的核苷酸序列即具有對SA的響應能力，熒光素酶活性分別為未用SA處理的4.2倍、3.3倍，500 bp、1 000 bp二者響應能力處于同一水平。而長度為1 500 bp時，熒光素酶活性進一步升高，為未用SA處理的7.4倍，與1 000 bp、500 bp核苷酸序列相比，具有顯著差異。核苷酸序列長度增加到2 000 bp時，對SA響應能力進一步增強，熒光素酶活性升高倍數(shù)為11.5倍，與1 500 bp核苷酸序列相比，具有顯著差異。該研究結果說明，在1 000 bp—1 500 bp及1 500—2 000 bp，具有增強SA響應能力的順式作用元件。而2 000—2 500 bp，在對SA響應的熒光素酶活性變化上，沒有進一步提高（圖10-C，右）。

圖6 差異基因的qRT-PCR分析

圖7 MdWRKY40啟動子序列的生物信息學分析

結合低濃度（0.2 mmol?L-1）與高濃度（0.5 mmol?L-1）SA的研究結果可以看出，從ATG開始向上游500 bp的核苷酸序列已具有對SA的響應能力，但是，該區(qū)段不能響應低濃度SA，而在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp，尤其是后者，具有顯著增強蘋果細胞對SA敏感性的未知核苷酸序列。

2.7 MdWRKY40轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在反饋抑制機制

研究表明，一些重要的轉(zhuǎn)錄因子存在自我催化或反饋抑制的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，以達到快速響應外界信號或及時阻抑過高表達的目的，前者如調(diào)控蘋果果實著色的重要轉(zhuǎn)錄因子[37]與歐芹[38]，后者如擬南芥中調(diào)控植物衰老進程的重要轉(zhuǎn)錄因子[39]。

為探究是否存在自我調(diào)控機制，將35S啟動子驅(qū)動的MdWRKY40蛋白與Promoter- WRKY40-Luciferase在原生質(zhì)體中進行共轉(zhuǎn)化。共轉(zhuǎn)后的熒光素酶活性僅為對照的35%，Western blot顯示MdWRKY40蛋白在原生質(zhì)體中成功表達，其分子量為37 kD（圖10-D），說明MdWRKY40蛋白的表達對其自身RNA水平的轉(zhuǎn)錄具有反饋抑制作用。

圖8 MdChiB-1啟動子序列的生物信息學分析

在本研究中，還克隆了的開放閱讀框序列，構建到含有MBP融合蛋白表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，成功得到WRKY40誘導蛋白（MBP蛋白分子量為40 kD，加上WRKY40后，總的蛋白分子量約為77 kD，圖10-E），為解析該蛋白在SA信號途徑的功能奠定了生化基礎。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選到SA介導抗病信號途徑的重要功能基因

由于SA調(diào)控蘋果抗病的分子機制尚不明確，SA信號途徑的關鍵基因尚未找到，本研究利用外源SA處理蘋果葉片，構建SA誘導的轉(zhuǎn)錄組文庫，并進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，探討SA處理后差異表達基因、基因富集通路的變化，尋找SA調(diào)控抗病反應的關鍵基因。對照和SA處理測序數(shù)據(jù)可靠，覆蓋率高，適合用于數(shù)據(jù)分析。（nonexpressor of PR genes 1）是SA信號途徑的關鍵調(diào)控因子[40]。擬南芥和小麥過量表達能夠增強二者對病原菌的抗性[41]。Chai等[42]的研究表明，利用0.1 mmol?L-1SA處理擬南芥離體葉片2 d，轉(zhuǎn)錄水平表達倍數(shù)為對照的3倍，處理4 d，的表達提高到9倍，而在本研究中，未檢測到SA處理后蘋果（MDP0000292425）基因表達的變化，一方面可能與SA處理濃度（2 mmol·L-1）與取樣時間（12 h）有關；另一方面，在SA信號轉(zhuǎn)導中，作為SAR（系統(tǒng)獲得抗性）的分子開關，其泛素化降解啟動SAR信號轉(zhuǎn)導過程，而旁系同源基因和作為SA的受體，介導了泛素化降解[43]。在本研究中（MDP0000868782）被SA處理誘導表達（表達比率為1.7）。因此，推測在表達水平上不受調(diào)控，而主要發(fā)生在蛋白水平上。表達與SA處理濃度及時間的關系，以及與SA信號轉(zhuǎn)導的關系，需要進一步研究。

圖9 FRK1啟動子序列的生物信息學分析

NIMIN1（MDP0000280322）是NPR1的互作蛋白，負調(diào)控表達[44-45]。本研究（MDP0000280322）被SA誘導顯著上調(diào)（其表達比率為6.56），是SA誘導的條件特異表達基因之一，且（MDP0000711379，-1.14）的轉(zhuǎn)錄水平同時降低，因此推測蘋果與擬南芥負調(diào)控的分子機制一致。其在蘋果中的具體功能尚不清楚，需要進行后續(xù)研究。

在本研究中，一些調(diào)控次生代謝的基因也能夠被SA誘導上調(diào)，其中包括葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，該基因在煙草中同樣被SA所誘導表達[46-47]。研究表明，病菌通過分泌甘露醇到質(zhì)外體來抑制活性氧介導的的宿主防衛(wèi)反應，植物中的甘露醇脫氫酶通過將病菌分泌的甘露醇轉(zhuǎn)變?yōu)楦事短?，從而增強植物的抗病反應，本研究中甘露醇脫氫酶基因被SA誘導上調(diào)表達，這與Cheng等[48]的研究一致。肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成的關鍵酶，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)，SA上調(diào)CAD的表達，在甘薯和茶樹中同樣證實了這一觀點[49-50]。表明不同物種之間SA響應次生代謝途徑的保守性很強。SA對次生代謝的調(diào)控，是調(diào)控植物抗性的一個非常重要的方面。

A：SA處理各啟動子的LUC/GUS比值；B：各種激素處理MdWRKY40啟動子的LUC/GUS比值；C：MdWRKY40啟動子的不同區(qū)段對不同濃度SA處理的LUC/GUS比值，0.2 mmol?L-1 SA（左）、0.5 mmol?L-1 SA（右）；D：MdWRKY40蛋白超表達對LUC/GUS比值的影響；E：MdWRKY40誘導蛋白表達。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

研究中還發(fā)現(xiàn)了參與活性氧途徑代謝的基因，在植物防衛(wèi)反應中，還有一種重要的次生代謝產(chǎn)物活性氧（ROS），對觸發(fā)過敏反應至關重要[51]。呼吸爆發(fā)氧化酶（Respiratory burst oxidase homologues，Rboh）是植物活性氧（ROS）的主要生產(chǎn)者[52]，PTI（pattern triggered immunity）和ETI（effector triggered immunity）均能調(diào)控植物防衛(wèi)反應，但ETI能夠更強更快速的引起局部過敏反應[53]。SA處理下調(diào)呼吸爆發(fā)氧化酶（Rboh）的轉(zhuǎn)錄水平，表明PTI途徑中由ROS引發(fā)的過敏反應被抑制，同時SA誘導蘋果中（MDP0000254260）和（MDP0000774112）的上調(diào)，激發(fā)ETI途徑中抗病基因介導的過敏反應，對于SA誘導蘋果抗病性的調(diào)控機制指明了研究方向。SA對非生物脅迫起到正面調(diào)控作用。研究表明SA處理顯著降低蘋果幼苗內(nèi)ROS水平，提高抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化水平，從而減輕低氧脅迫對植株的傷害，其調(diào)控機制尚不明確[54]。本研究中SA誘導呼吸爆發(fā)氧化酶Rboh下調(diào)，為SA能夠增強蘋果對低氧脅迫的抗性提供了分子證據(jù)。

研究表明持續(xù)的MAPK級聯(lián)途徑的激活有助于激發(fā)SA誘導的大部分響應基因的表達[55]。本研究SA誘導了蘋果MAPK級聯(lián)途徑頂端基因的上調(diào)，同時誘導下游轉(zhuǎn)錄因子的表達，但對及則無轉(zhuǎn)錄水平的影響。對差異基因進行條件特異表達分析發(fā)現(xiàn)SA特異性誘導了33個差異基因的表達，包括轉(zhuǎn)錄因子、、、轉(zhuǎn)錄因子等，這在之前蘋果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中未見報道。33個特異表達基因為揭示SA途徑的特異性生物過程提供了理論依據(jù)，其中的轉(zhuǎn)錄因子及植物病原菌互作相關蛋白，在SA誘導的植物抗病反應中發(fā)揮重要作用。Pandey等[56]的研究表明水稻中多種轉(zhuǎn)錄因子參與抗病反應，例如、和在稻瘟病菌的侵染過程中表現(xiàn)為差異性表達，白葉枯菌能夠誘導和的特異性表達，并與和互作從而負調(diào)控XA21介導的抗病反應[57-58]，本研究誘導的轉(zhuǎn)錄因子在蘋果抗病反應的具體功能尚不清楚，仍需進行深入研究。

從本研究轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)可以看出，SA顯著調(diào)控，次生代謝合成基因，活性氧代謝基因以及轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達，SA廣泛參與了對于蘋果系統(tǒng)抗性中各個過程的調(diào)控，其中，對每一方面的調(diào)控方式和作用位點，需要在本研究基礎上，進一步應用分子以及生化手段進行揭示。

3.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術與SA信號途徑

啟動子負責對外界誘導條件的響應，在本研究中只克隆了2 500 bp的核苷酸序列，有可能在上游序列中，仍然含有進一步提高對SA進行響應的特異性元件。為擬南芥中對細菌鞭毛蛋白flg22的22個氨基酸序列進行強烈誘導表達的基因，是細菌鞭毛蛋白響應的指示性基因[36]，在蘋果基因組中并未找到的同源基因，但是，將-LUC轉(zhuǎn)化于蘋果細胞中，經(jīng)SA處理，發(fā)現(xiàn)升高10.1倍，說明在蘋果細胞中啟動子序列仍然能夠被識別，這不僅表明蘋果細胞與擬南芥細胞中，信號轉(zhuǎn)導途徑的保守性，同時也說明，在蘋果細胞中，SA信號途徑具有影響PTI信號轉(zhuǎn)導的能力，說明SA在植物抗病信號轉(zhuǎn)導中，具有重要的作用。在的啟動子中，發(fā)現(xiàn)了對SA進行響應的4個序列元件，暗示的啟動子除了能夠?qū)毦廾鞍譮lg22進行響應外，還能夠?qū)A進行響應，而試驗結果也表明的啟動子可以響應SA，與生物信息學分析結果相一致。

啟動子序列通常包含多種順式作用元件，確定對信號應激反應起關鍵作用的順式作用元件對理解細胞的信號轉(zhuǎn)導極為重要。在本研究中，通過不同區(qū)段克隆的方式，發(fā)現(xiàn)在1 000—2 000 bp，存在增強SA信號響應能力的作用元件。生物信息學分析表明，在1 000 bp以內(nèi)，存在3個響應SA的順式作用元件，其中500 bp以內(nèi)含有2個，500—1 000 bp含有1個（圖7），這與500 bp的核苷酸序列已具有對SA的響應能力的試驗結果相一致，但是，500 bp、1 000 bp對SA的響應能力沒有區(qū)別，說明這3個順式元件可能功能上具有重疊。同時，該區(qū)段不能響應低濃度SA，而當核苷酸序列長度增長到2 000 bp時，具有了對低濃度SA的響應能力，說明，在1 000—2 000 bp，含有進一步增強SA信號轉(zhuǎn)導能力的作用元件。將這一區(qū)段一分為二，即1 000—1 500 bp、1 500—2 000 bp，發(fā)現(xiàn)這兩個區(qū)段在高濃度SA時，都能夠顯著增強SA信號轉(zhuǎn)導的功能，說明在這兩個區(qū)段中，分別具有提高對SA敏感性的作用元件，而在低濃度SA時，只有從1 000 bp增加到2 000 bp時，才能顯著提高蘋果細胞對SA的敏感性，說明這兩個區(qū)段的SA順式作用元件具有累積與加和效應。在啟動子的研究中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，多個元件具有累積效應，元件拷貝數(shù)目的不同會對啟動子響應的強度和誘導性產(chǎn)生不同的影響[59]。生物信息學分析表明，在1 000—1 500 bp存在2個茉莉酸甲酯響應元件（TGACG），1 500—2 000 bp存在3個病菌響應元件（ACGTG）、2個生長素響應元件（AACGAC）和1個W-box（TTGAC），并未預測到SA的響應元件，說明在這一區(qū)段中，可能存在增強細胞對SA敏感性的未知核苷酸序列。

在植物中一些具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子具有自我催化或自我抑制機制。研究發(fā)現(xiàn)，MdWRKY40蛋白能夠抑制自身基因的轉(zhuǎn)錄，這種自我抑制模式與擬南芥中調(diào)控衰老的關鍵基因的表達模式相同。Robatzek等[39]發(fā)現(xiàn)，將WRKY6蛋白在擬南芥細胞中超表達，其自身的轉(zhuǎn)錄活性降低12倍。這種反饋抑制機制可能有效阻止了由自身基因的過量表達而導致的植物早衰。在本研究中發(fā)現(xiàn)能夠快速高效響應SA，說明是抗性信號物質(zhì)SA信號轉(zhuǎn)導中的一個重要基因，該基因的反饋抑制作用，可能及時阻止了自身過量表達對植物帶來的危害。筆者實驗室已經(jīng)構建植物穩(wěn)定超表達載體，進行轉(zhuǎn)化蘋果愈傷和蘋果植株，對其基因功能進行進一步研究。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術廣泛應用于植物的基因功能、亞細胞定位、蛋白互作及瞬時表達等方面，可以高效準確的解析植物細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，是分子生物學和生物化學研究的有效手段[60]。不同植物原生質(zhì)體技術的成功應用，促進了植物基因組學及蛋白質(zhì)組學功能的研究。例如，水稻中利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術成功得到了MYBS3的亞細胞定位性質(zhì)[61]。擬南芥中利用原生質(zhì)體研究了不同基因的表達、信號轉(zhuǎn)導途徑[62]及蛋白互作情況[63]等。本研究利用蘋果愈傷的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術首次鑒定了在蘋果中對SA進行特異性響應的啟動子序列，即（MDP0000263349）的啟動子序列，為蘋果這種多年生木本植物中開展相關激素信號轉(zhuǎn)導途徑的研究提供了穩(wěn)定的鑒定體系，也為以后獲得更多特異途徑的靶標基因與調(diào)控基因提供了可能。大腸桿菌中成功誘導WRKY40蛋白的表達，為研究WRKY結構域的結合元件以及鑒定下游的靶基因奠定了生化基礎。的啟動子序列中包含各種激素響應元件、防衛(wèi)脅迫響應元件等，表明可能調(diào)控多種激素和脅迫反應過程。作為SA信號途徑的特異性啟動子，SA響應元件在誘導表達過程中占主導地位，圖8中3個位點的SA響應元件對于是否存在功能冗余，可對3個SA響應元件進行缺失突變，利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術進一步鑒定其關鍵調(diào)控元件。

SA調(diào)控的途徑復雜而精細，在植物抗性反應中起到顯著作用[64-66]。目前蘋果中關于SA誘導抗病的分子機制尚不完善。與模式植物相比，蘋果中SA誘導的途徑更為復雜，是蘋果抗病的重要機制之一。分析SA誘導蘋果葉片轉(zhuǎn)錄水平的基因表達差異，利于更好的理解SA信號途徑與植物病原菌互作的分子機制。本研究的轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)及啟動子的克隆，為SA在蘋果中信號轉(zhuǎn)導途徑的深入研究奠定了基礎。

4 結論

利用RNA-Seq技術獲得了水楊酸（SA）誘導蘋果葉片轉(zhuǎn)錄水平的差異基因，包括次生代謝、植物病原菌互作途徑相關基因以及33個條件特異表達基因。利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術鑒定了SA特異性響應基因（MDP0000263349）的啟動子序列，在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有顯著提高啟動子對SA敏感性的未知核苷酸序列，另外，MdWRKY40轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在反饋抑制機制，為蘋果中SA信號途徑的研究奠定了基礎。

[1] 國立耘, 李金云, 李保華, 張新忠, 周增強, 李廣旭, 王英姿, 李曉軍, 黃麗麗, 孫廣宇, 文耀東. 中國蘋果枝干輪紋病發(fā)生和防治情況. 植物保護, 2009, 35(4): 120-123.

GUO L Y, LI J Y, LI B H, ZHANG X Z, ZHOU Z Q, LI G X, WANG Y Z, LI X J, HUANG L L, SUN G Y, WEN Y D. Investigations on the ccurrence and chemical control ofcanker of apple in China., 2009, 35(4): 120-123. (in Chinese)

[2] KUMAR D. Salicylic acid signaling in disease resistance., 2014, 228(11): 127-134.

[3] SANCHEZ L, COURTEAUX B, HUBERT J, KAUFFMANN S, RENAULT J H, CLEMENT C, BAILLIEUL F, DOREY S. Rhamnolipids elicit defense responses and induce disease resistance against biotrophic, hemibiotrophic, and necrotrophic pathogens that require different signaling pathways inand highlight a central role for salicylic acid., 2012, 160(3): 1630-1641.

[4] ZHANG Y, SHI X, LI B, ZHANG Q, LIANG W, WANG C. Salicylic acid confers enhanced resistance to Glomerella leaf spot in apple., 2016, 106(9): 64-72.

[5] CHEN X K, ZHANG J Y, ZHANG Z, DU X L, DU B B, QU S C. Overexpressing, 2012, 39(8): 8083-8089.

[6] 毛愛軍, 王永健, 馮蘭香, 耿三省, 許勇. 水楊酸等4種誘導劑誘導辣椒抗疫病作用的研究. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37(10): 1481-1486.

MAO A J, WANG Y J, FENG L X, GENG S X, XU Y. Study on the resistance induced by salicylic acid againstin Pepper., 2004, 37(10): 1481-1486. (in Chinese)

[7] 劉鳳權, 王金生. 水楊酸誘導水稻幼苗抗白葉枯病研究. 植物保護學報，2000, 27(1): 48-52.

LIU F Q, WANG J S. Preliminary study on resistance of rice seedling to leaf blight induced by salicylic acid., 2000, 27(1): 48-52. (in Chinese)

[8] DONG C J, LI L, SHANG Q M, LIU X Y, ZHANG Z G. Endogenous salicylic acid accumulation is required for chilling tolerance in cucumber (L.) seedlings., 2014, 240(4): 687-700.

[9] 張計育, 渠慎春, 董暢, 高志紅, 喬玉山, 章鎮(zhèn). 水楊酸誘導湖北海棠全長cDNA文庫的構建及應用. 西北植物學報, 2010, 30(8): 1527-1533.

ZHANG J Y, LIANG S C, DONG C, GAO Z H, QIAO S Y, ZHANG Z. Utility and construction of full-length cDNA library ofpost-introduced with salicylic acid., 2010, 30(8): 1527-1533. (in Chinese)

[10] 瞿振芳, 符聰慧, 楊婷斐, 張軍科. SA誘導對蘋果葉片中基因表達的影響. 西北植物學報, 2013, 22(3): 103-109.

QU Z F, FU C H, YANG T F, ZHANG J K. The effects of SA induction on the expression ofgene in apple leaves., 2013, 22(3): 103-109. (in Chinese)

[11] 張穎, 李保華, 董向麗, 梁文星, 李桂舫, 王彩霞. 不同品種蘋果葉片對外源水楊酸的生理響應. 核農(nóng)學報, 2016, 30(5): 1005-1012.

ZHANG Y, LI B H, DONG X L, LIANG W X, LI G F, WANG C X. Physiological response of apple leaves from different cultivars to exogenous salicylic acid., 2016, 30(5): 1005-1012. (in Chinese)

[12] 羅昌國, 袁啟鳳, 裴曉紅, 吳亞維, 鄭偉, 章鎮(zhèn). 富士蘋果基因克隆及其對白粉病的抗性分析. 西北植物學報, 2013, 33(12): 2382-2387.

LUO C G, YUAN Q F, PEI X H, WU Y W, ZHENG W, ZHANG Z. Cloning ofgene in Fuji apple and its response to powdery mildew stress., 2013, 33(12): 2382-2387. (in Chinese)

[13] MAGALI M, TIMOTHY W, GIULIO Z, GEORGE P, MIAOYING T, CHRISTOS N , SORINA P. Theoligopeptidasesandare salicylic acid targets that modulate SA-mediated signaling and the immune response., 2013, 76(4): 603-614.

[14] KINKEMA M, FAN W, DONG X. Nuclear localization ofis required for activation ofgene expression., 2000, 12(12): 2339-2350.

[15] NDAMVKONG I, ABDALLAT A A, THUROW C, FODE B, ZANDER M, WEIGEL R, GATZ C. SA-inducible Arabidopsis glutaredoxin interacts with TGA factors and suppresses JA-responsivetranscription., 2007, 50(1): 128-139.

[16] 田義, 張彩霞, 康國棟, 李武興, 張利益, 從佩華. 植物轉(zhuǎn)錄因子研究進展. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2016, 49(4): 632-642.

TIAN Y, ZHANG C X, KANG G D, LI W X, ZHANG L Y, CONG P H. Progress ontranscription factors in plant., 2016, 49(4): 632-642. (in Chinese)

[17] CHARLES D, CATHERINE D, SARAH G, ENWU L, PIERRE R F. The/protein enhances the DNA binding activity of a subgroup of thefamily oftranscription factors., 2000, 12(2): 279-290.

[18] MANDAL S, MALLICK N, MITRA A. Salicylic acid-induced resistance tof. sp.in tomato., 2009, 47(7): 642-649.

[19] LI H, DURBIN R. Fast and accurate short read alignment with burrows-wheeler transform., 2009, 25(14): 1754-1760.

[20] LANGMEAD B, TRAPNELL C, POP M, SALZBERG S L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome., 2009, 10(3): 25-34.

[21] YE J, FANG L, ZHENG H, ZHANG Y, CHEN J, ZHANG Z, WANG J, LI S, LI R, BOLUND L, WANG J. WEGO: A web tool for plotting GO annotations., 2006, 34(7): W293-297.

[22] HE P, SHAN L B, SHEEN J. The use of protoplasts to study innate immune responses., 2007, 354: 1-9.

[23] VELASCO R, ZHARKIKH A, AFFOURTIT J, DHINGRA A, CESTARO A, et al. The genome of the domesticated apple (Borkh)., 2010, 42(10): 833-839.

[24] 譚國飛, 王楓, 賈曉玲, 李巖, 熊愛生. 芹菜甘露醇脫氫酶基因的分離與表達分析. 園藝學報, 2013, 40(11): 2189-2198.

TAN G F, WANG F, JIA X L, LI Y, XIONG A S. Isolation and expression of mannitol dehydrogenase gene in celery., 2013, 40(11): 2189-2198. (in Chinese)

[25] 劉威, 陳昊, 靳亞忠, 齊紅巖. 高等植物醇脫氫酶及其基因家族研究進展. 植物生理學報, 2014, 50(10): 1479-1493.

LIU W, CHEN H, JIN Y Z, QI H Y. Advances in alcohol dehydrogenase enzymes and their gene families in higher plants., 2014, 50(10): 1479-1493. (in Chinese)

[26] 宋修鵬, 黃杏, 莫鳳連, 田丹丹, 楊麗濤, 李楊瑞, 陳保善. 甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（）的克隆和表達分析. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2013, 46(14): 2856-2868.

SONG X P, HUANG X, MO F L, TIAN D D, YANG L T, LI Y R, CHEN B S. Cloning and expression analysis of sugarcane phenylalanin ammonialyase () gene., 2013, 46(14): 2856-2868. (in Chinese)

[27] PENNING T M. Introduction and overview of the aldo-keto reductase superfamily., 2004, 865(12): 3-20.

[28] 左豫虎, 康振生, 楊傳平, 芮海英, 婁樹寶, 劉惕若. β-1,3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性與大豆對疫霉根腐病抗性的關系. 植物病理學報, 2009, 39(6): 600-607.

ZUO Y H, KANG ZH S, YANG C P, RUI H Y, LOU S B, LIU X R. Relationship between activities of β-1, 3-glacanase and chitinase and resistance to phytophthora root rot in soybean., 2009, 39(6): 600-607. (in Chinese)

[29] PETERSEN M, BRODERSEN P, NAESTED H, ANDREASSON E, LINDHART U, JOHANSEN B, NIELSEN H B, LACY M, AUSTIN M J, PARKER J E, SHARMA S B, KLESSIG D F, MARTINSSEN R, MATTSSON O, JENSEN A B, MUNDY J.MAP kinase 4 negatively regulates systemic acquired resistance., 2000, 103(7): 1111-1120.

[30] ZHANG X, DONG J, LIU H, WANG J, QI Y, LIANG Z. Transcriptome sequencing in response to salicylic acid in., 2016, 11(1): e0147849.

[31] FRYE C A, TANG D, INNES R W. Negative regulation of defense responses in plants by a conserved MAPKK kinase., 2001, 98(1): 373-378.

[32] MAO G, MENG X, LIU Y, ZHENG Z, CHEN Z, ZHANG S. Phosphorylation of atranscription factor by two pathogen- responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis., 2011, 23(4): 1639-1653.

[33] HUBERT D A, TORNERO P, BELKHADIR Y, KRISHNA P, TAKAHASHI A, SHIRASU K, DANGL J L. Cytosolicassociates with and modulates thedisease resistance protein., 2003, 22(21): 5679-5689.

[34] LI M, MA X, CHIANG Y H, YADETA K A, DING P, DONG L, ZHAO Y, LI X, YU Y, ZHANG L, SHEN Q H, XIA B, COAKER G, LIU D, ZHOU J M. Proline isomerization of the immune receptor-interacting protein RIN4 by a cyclophilin inhibits effector-triggered immunity in., 2014, 16(4): 473-483.

[35] HUANG S, MONAGHAN J, ZHONG X, LIN L, SUN T, DONG OX, LI X. HSP90s are required for NLR immune receptor accumulation in., 2014, 79(3): 427-439.

[36] HE P, SHAN L B, LIN N C, MARTIN GREGORY B, KEMMERLING B, NüRNBERGER T, SHEEN J.Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK ininnate immunity., 2006, 125(3): 563-575.

[37] ESPLEY R V, BRENDOLISE C, CHAGNE D, KUTTY-AMMA S, GREEN S, VOLZ R, PUTTERILL J, SCHOUTEN H J, GARDINER S E, HELLENS R P, ALLAN A C.Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples., 2009, 21(1): 168-183.

[38] TURCK F, ZHOU A, SOMSSICK I E. Stimulus-dependent, promoter- specific binding of transcription factorto its native promoter and the defense-related gene-in parsley., 2004, 16(10): 2573-2585.

[39] ROBATZEK S, SOMSSICH I E. Targets ofregulation during plant senescence and pathogen defense., 2002, 16(9): 1139-1149.

[40] CAO H, GLAZEBROOK J, CLARKE J D. The Arabidopsisgene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats., 1997, 88(1): 57-63.

[41] 周淼平, 楊學明, 姚金保, 張鵬, 余桂紅, 馬鴻翔. 過量表達擬南芥基因提高小麥紋枯病的抗性. 分子植物育種, 2012, 10(6): 655-661.

ZHOU M P, YANG X M, YAO J B, ZHANG P, YU G H, MA H X. Over-expression ofenhances resistance to wheat sharp eyespot in transgenic wheat., 2012, 10(6): 655-661. (in Chinese)

[42] CHAI J, LIU J, ZHOU J, XING D. Mitogen-activated protein kinase 6 regulatesgene expression and activation during leaf senescence induced by salicylic acid., 2014, 65(22): 6513-6528.

[43] FU Z Q, YAN S P, SALEH A, WANG W, RUBLE J, OKA N, MOHAN R, SPOEL S H, TADA Y, ZHENG N, DONG X N.andare receptors for the immune signal salicylic acid in plants., 2012, 486(7402): 228-232.

[44] ZWICKER S, MAST S, STOS V, PFITZNER A J, PFITZNER U M. Tobacco NIMIN2 proteins control PR gene induction through transient repression early in systemic acquired resistance., 2007, 8(4): 385-400.

[45] DELANEY T P, FRIDRICH L, RYALS J A.signal transduction mutant defective in chemically and biologically induced disease resistance., 1995, 92(14): 6602-6606.

[46] FRAISSINET T L, BALTZ R, CHONG J, KAUFFMANN S, FRITIG B, SAINDRENAN P. Two tobacco genes induced by infection, elicitor and salicylic acid encode glucosyltransferases acting on phenylpropanoids and benzoic acid derivatives, including salicylic acid., 1998, 437(3): 319-323.

[47] TAGUCHI G, YAZAWA T, HAYASHIDA N, OKAZAKI M. Molecular cloning and heterologous expression of novel glucosyltransferases from tobacco cultured cells that have broad substrate specificity and are induced by salicylic acid and auxin., 2001, 268(14): 4086-4094.

[48] CHENG F Y, ZAMSKI E, GUO W W, PHARR D M, WILLIAMSON J D. Salicylic acid stimulates secretion of the normally symplastic enzyme mannitol dehydrogenase: A possible defense against mannitol-secreting fungal pathogens., 2009, 230(6): 1093-1103.

[49] KIM Y H, BAE J M, HUH G H. Transcriptional regulation of the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene from sweet potato in response to plant developmental stage and environmental stress., 2010, 29(7): 779-791.

[50] DENG W W, ZHANG M, WU J Q, JIANG Z Z, TANG L, LI Y Y, WEI C L, JIANG C J, WAN X C. Molecular cloning, functional analysis of three cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) genes in the leaves of tea plant,., 2013, 170(3): 272-282.

[51] XIA X J, ZHOU Y H, SHI K, ZHOU J, FOYER C H, YU J Q. Interplay between reactive oxygen species and hormones in the control of plant development and stress tolerance., 2015, 66(10): 2839-2856.

[52] 孫旭東, 胡向陽, 楊永平. 擬南芥基因家族成員的分子和功能學比較. 植物分類與資源學報, 2015, 37(4): 463-471.

SUN X D, HU X Y, YANG Y P. Molecular and functional comparisons of reactive burst oxygen species gene family in., 2015, 37(4): 463-471. (in Chinese)

[53] USTUN S, BARTETZKO V, BORNKE F.Theeffector XopJtriggers a conditional hypersensitive response upon treatment of.leaves with salicylic acid.,2015, 6: 599.

[54] 白團輝, 馬鋒旺, 李翠英, 束懷瑞, 韓明玉.水楊酸對根際低氧脅迫八棱海棠幼苗活性氧代謝的影響. 園藝學報, 2008, 35(2): 163-168.

BAI T H, MA F W, LI C Y, SHU H R, HAN M Y. Effects of salicylic acid on reactive oxygen species metabolism inrehd under root-zone hypoxia stress., 2008, 35(2): 163-168. (in Chinese)

[55] TSUDA K, MINE A, BETHKE G, IGARASHI D, BOTANGA C J, TSUDA Y, GLAZEBROOK J, SATO M, KATAGIRI F. Dual regulation of gene expression mediated by extended MAPK activation and salicylic acid contributes to robust innate immunity in., 2013, 9(12): e1004015.

[56] PANDEY S P, SOMSSICH I E. The role oftranscription factors in plant immunity., 2009, 150(4): 1648-1655.

[57] PENG Y, BARHLEY L E, CHEN X, DARDICK C, CHERN M, RUAN R, CANLAS P E, RONALD P C. OsWRKY62 is a negative regulator of basal and Xa21-mediated defense againstpv.in rice., 2008, 1(3): 446-458.

[58] PENG Y, BARTLEY L E, CANLANS P, RONALD P C.transcription factors modulate rice innate immunity., 2010, 3(1): 36-42.

[59] PAUL J R, ANJA R, VOLKER L, BERNADETTE L, IMRE E S, Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling., 2002, 14(4): 749-762.

[60] SHEN J, FU J, MA J, WANG X, GAO C, ZHUANG C, WAN J, JIANG L. Isolation, culture, and transient transformation of plant protoplasts., 2014, 63(6): 2.8.1-17. doi: 10.1002/0471143030.cb0208s63.

[61] SU C F, WANG Y C, HSIEH T H, LU C A, TSENG T H, YU S M. A novel MYBS3-dependent pathway confers cold tolerance in rice., 2010, 153(1): 145-158.

[62] SHEEN J. Signal transduction in maize andmesophyll protoplasts., 2001, 127(4): 1466-1475.

[63] XU J, LU H D, CHEN L Q, WANG Y, LIU L L, HE L, WU W H. A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+transporter AKT1 in., 2006, 125(7): 1347-1360.

[64] RASKIN I. Salicylate, a new plant hormone., 1992, 99(3): 799-803.

[65] NAZAR R, UMAR S, KHAN N A. Exogenous salicylic acid improves photosynthesis and growth through increase in ascorbate- glutathione metabolism and S assimilation in mustard under salt stress., 2015, 10(3): e1003751.

[66] DONG C J, LI L, SHANG Q M, LIU X Y, ZHANG Z G. Endogenous salicylic acid accumulation is required for chilling tolerance in cucumber (L.) seedlings., 2014, 240(4): 687-700.

（責任編輯 趙伶俐）

Identification ofpromoter Specific Response to Salicylic Acid by Transcriptome Sequencing

QIU HuaRong, ZHOU QianQian, HE XiaoWen, ZHANG ZongYing, ZHANG ShiZhong, CHEN XueSen, WU ShuJing

(College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai'an 271018, Shandong)

In order to explain the theoretical basis for disease resistance molecular mechanism mediated by SA, the influence of transcriptional regulation of apple leaves response to salicylic acid was studied, and the SA signaling pathway and its regulated genes were identified.The leaves of tissue culture apple ‘gala’ seedling growing under 24℃ for 30 d were treated with 2 mmol?L-1SA (0.2% ethanol treatment as control) for 12 h. Then the transcriptome libraries was constructed by using Illumina HiSeqTM 2000 sequencing technique, and the regulated genes of SA signaling pathway were screened by integrated bioinformatics analysis which included differential genes screening, condition specificity analysis, GO classification and KEGG enrichment analysis. The promotor of the gene which was specific response to SA was cloned and promotor activity was identified by using protoplast transformation technique. The specific response of different nucleotide fragment of promotor was verified.The original data of 750 439 459 and 751 596 153 bp sequences was obtained from CTRL and SA treatment samples, Which were 44.77% and 43.88% perfect match with the ‘golden delicious’ apple genome sequence, respectively. The transcriptome data of SA treated samples suggested that 3 329 genes were significantly expressed, including the genes related to biosynthesis of secondary metabolites pathway (the key enzyme of lignin synthetic pathway CAD, cytochrome P450, β-1,3-glucanase related to fungal resistance), the important functional genes involved in plant-pathogen pathway (calmodulin CaM, disease resistance protein RPM1, heat shock protein HSP90, WRKY transcription factors) and 33 condition specificity genes (NAC transcription factors, NIM1, WRKY40, Ethylene responsive factors and so on). Among them, 1 085 genes were up-regulated and 2 244 genes were down-regulated. Differentially expressed genes were participated in cellular process, metabolic process, binding, catalytic activity and so on. According to the transcriptome data, the promotor ofwas cloned into the expression vector and placed in the upstream of the luciferase gene. After transforming the vector to apple protoplasts, the luciferase activity of SA treated samples was 20.6 times of the control samples, and the SA treated samples did not affected by ABA, JA or ACC, only showed the specific response to SA. The results suggested that the promotor sequence was specially response to SA in apple. Different segments of the promoter with different response ability to SA. The region 500-1 000 bp of the promoter, which located in the upstream of the WRKY40 transcription start site ATG, only was response to high concentrations of SA and no response to low concentrations of SA. For 1 500 bp sequence, the response ability to high SA concentrations was enhanced significantly, but just slightly increased with low SA concentration. The length of the 2 000 bp nucleotide fragment had a significant response to both the high and low concentrations of SA and achieved the strongest ability level. Compared to 2 000 bp fragment, the 2 500 bp fragment didn’t show further enhanced response to SA. Overexpression of the MdWRKY40 protein inhibited its own transcription.The DEGs obtained under 2 mmol?L-1SA treatment in apple leaves were involved in biosynthesis of phenylpropanoid and flavonoid, plant-pathogen interaction and plant hormone signal transduction pathways. The 2 500 bp nucleotide promotor sequence upstream of WRKY40 open reading frame was specific response to SA. There were unknown nucleotide sequences between 1 000-1 500 bp and 1 500-2 000 bp that significantly enhanced the sensitivity of the promoter response to SA, and the transcription regulation ofexisted a feedback suppression mechanism.

SA; apple; transcriptome; signaling transduction; plant-pathogen interaction

2017-05-07；接受日期：2017-08-21

國家自然科學基金（31272132）、山東省泰山學者工程啟動基金（tshw20120712）

邱化榮，E-mail：qiu516@126.com。通信作者陳學森，Tel：0538-8249338；E-mail：chenxs@sdau.edu.cn。通信作者吳樹敬，Tel：0538-8246220；E-mail：wushujing666@163.com