張雪薇 劉 侖 魯黎明 李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130)

煙草NtCBL1基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)分析

張雪薇 劉 侖 魯黎明 李立芹*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130)

CBL是一類Ca2+感受蛋白，在植物適應(yīng)或抵制逆境脅迫的過程中發(fā)揮重要的作用。從煙草品種K326中克隆到了一個(gè)CBL1的同源基因，該序列包含了一個(gè)642 bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)由213個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，預(yù)測(cè)分子量為24.5 kDa，等電點(diǎn)為5.03。同源性分析結(jié)果顯示，該基因與林煙草CBL1、甜辣椒CBL1等具有較高的同源性，故命名為NtCBL1。生物信息學(xué)分析表明，NtCBL1具有CBL家族保守的EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)該基因在成熟期的根、莖、葉、花中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高。逆境脅迫實(shí)驗(yàn)表明，該基因表達(dá)受低鉀、高鹽、干旱、ABA和低溫誘導(dǎo)調(diào)控，參與煙草生物與非生物逆境脅迫的響應(yīng)。并成功構(gòu)建了NtCBL1-pBI121過表達(dá)載體。研究結(jié)果為解析NtCBL1在響應(yīng)逆境脅迫的功能奠定一定理論基礎(chǔ)。

煙草；NtCBL1；克隆；序列分析；表達(dá)

煙草作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，保障我國煙草產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)于我國財(cái)政收入以及煙區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展極為重要。低鉀、干旱、鹽堿、冷害、病害等生物與非生物脅迫嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量及品質(zhì)，尤其是低鉀脅迫對(duì)煙草的危害極為嚴(yán)重[1]。煙草對(duì)鉀元素的需求量相對(duì)較大，煙葉中的含鉀量更是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，而在我國的大部分耕地土壤中都不同程度的缺鉀[2]。如何提高煙草的抗逆性和提高鉀的利用效率已成為目前研究的重要課題。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，幾乎介導(dǎo)了植物生長發(fā)育的所有生理生化過程，在植物逆境應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的作用[3]。特異Ca2+感受器能感知特異刺激所產(chǎn)生的瞬間Ca2+信號(hào)，進(jìn)而通過特異的蛋白—蛋白間的相互作用或者通過特定的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程或者基因表達(dá)調(diào)控來傳遞這種特異的鈣信號(hào)，從而啟動(dòng)一系列的生理生化反應(yīng)使植物適應(yīng)或抵御各種逆境脅迫[4]。類鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白(Calcineurin B-Like protein,CBL)是一類小分子鈣離子感受器，含有典型的鈣離子結(jié)合域EF-hand。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥、水稻、玉米和楊樹CBL家族含有10個(gè)成員[5]，CBL在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫過程中發(fā)揮著一定作用。擬南芥中AtCBL1能與AtCIPK23(CBL-interacting protein kinase)互作調(diào)控鉀離子通道蛋白AKT1所介導(dǎo)的低鉀信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]；AtCBL1在響應(yīng)鹽和干旱脅迫的過程中起正向調(diào)控作用，在低溫脅迫應(yīng)答中起負(fù)調(diào)控作用[7]。過表達(dá)的紫花針茅SpCBL6轉(zhuǎn)入擬南芥后，能降低擬南芥耐旱性，增強(qiáng)低溫耐受性[8]；水稻中OsCBL6基因的表達(dá)受鹽，干旱，寒冷和ABA誘導(dǎo)[9]。大量研究結(jié)果表明：CBL在其他植物響應(yīng)低鉀、鹽堿、干旱、ABA和低溫等逆境脅迫應(yīng)答中也具有重要功能[10～13]。

本研究從煙草K326中克隆到一個(gè)NtCBL1基因，利用生物信息學(xué)對(duì)NtCBL1編碼的蛋白進(jìn)行相關(guān)分析，同時(shí)，運(yùn)用熒光定量PCR分析了其在根、莖、葉、花及低鉀、高鹽、干旱、ABA和低溫脅迫下基因的表達(dá)水平，并成功構(gòu)建NtCBL1-pBI121過表達(dá)載體，旨在為今后NtCBL1的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

本試驗(yàn)使用的植物材料為煙草K326。首先挑選籽粒飽滿、大小一致的煙草種子用75%的乙醇消毒1 min，然后20%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，用無菌水反復(fù)清洗5～6次，播種于MS培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上播種40粒左右，放置在16 h光/8 h暗，25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后，挑取長勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行低鉀、高鹽、干旱、ABA和低溫處理，每個(gè)處理設(shè)有3盤重復(fù)，處理相應(yīng)時(shí)間(3、6、12和24 h)后進(jìn)行整株取樣。低鉀處理時(shí)將待處理材料轉(zhuǎn)移到低鉀培養(yǎng)基上，低鉀培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基中的KNO3去掉，并且將KH2PO4替換為NH4H2PO4，其余成分相同。高鹽、干旱、ABA處理培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的分別加入NaCl(200 mmol·L-1)、PEG6000(5%)、ABA(1 μmol·L-1)。低溫處理時(shí)將待處理材料放置4℃的光照培養(yǎng)箱中。

大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自Vazyme Biotech公司，DNA凝膠純化回收試劑盒購自天根公司，Trizol試劑、載體PMD19-T、高保真Pfu酶，cDNA合成試劑盒，SYBR Green Master mix、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購自TaKaRa，引物合成與測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草NtCBL1基因的克隆

參考GenBank收錄的林煙草NsCBL1序列(LOC104239170)，采用同源克隆的方法，Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物NtCBL1-F和NtCBL1-R(表1)。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；57℃退火30 s；72℃延伸1 min；34個(gè)循環(huán)。目的片段純化后與pMD19-T載體16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，隨后在涂有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，菌落PCR檢測(cè)篩選陽性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 煙草NtCBL1基因生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam tool分析NtCBL1編碼蛋白的理化性質(zhì)；采用DNAMAN軟件分析其編碼蛋白的疏水性；運(yùn)用IBCP的在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)NtCBL1的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)NtCBL1的三級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果用RasTop軟件打開；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)在線分析NtCBL1編碼蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)域；采用在線工具PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)NtCBL1的亞細(xì)胞定位；利用Signal-P在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；運(yùn)用MEGA5軟件，以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 煙草NtCBL1基因的表達(dá)分析

根據(jù)基因序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Real Time PCR引物NtCBL1-qF和NtCBL1-qR(表1)，采用煙草的18SrRNA為內(nèi)參進(jìn)行表達(dá)差異研究。所有的樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，基因相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物序列

注：GGATCC為BamHⅠ；CCCGGG為SmaⅠ

Note:GGATCC isBamHⅠ；CCCGGG isSmaⅠ

1.2.4 構(gòu)建NtCBL1-pBI121過表達(dá)載體

PCR引物NtCBL1-pBI121-F和NtCBL1-pBI121-R(表1)，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；57℃退火30 s；72℃延伸1 min；34個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，酶切回收目的片段和pBI121載體，酶切體系10 μL：10×T Buffer,0.5 μL;BSA,1 μL;BamHⅠ,1 μL;SmaⅠ,1 μL;PCR產(chǎn)物/pBI121載體,4 μL;ddH2O,2.5 μL。

目的片段純化后與pBI121載體16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，隨后在涂有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，菌落PCR檢測(cè)篩選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

以煙草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在500～700 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。運(yùn)用菌落PCR方法鑒定陽性克隆，隨機(jī)挑選3個(gè)陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：目的片段大小為642 bp。

圖1 NtCBL1的克隆 M.Marker 2 000 bp; 1.NtCBL1基因Fig.1 Cloning of NtCBL1 M.Marker 2 000 bp; 1.NtCBL1 gene PCR product

2.2 構(gòu)建NtCBL1-pBI121過表達(dá)載體

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pBI121載體分別進(jìn)行雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑選8個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果顯示：在500～700 bp的位置上有清晰的條帶(圖2)，挑取構(gòu)建成功的陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：目的片段大小為642 bp，表明NtCBL1-pBI121過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 NtCBL1-pBI121過表達(dá)載體的構(gòu)建 M. Marker 2 000 bp; 1～8.NtCBL1基因Fig.2 Construction of NtCBL1-pBI121 overexpression vector M.Marker 2 000 bp; 1-8. NtCBL1 gene PCR product

2.3 NtCBL1基因和蛋白序列分析

2.3.1 NtCBL1的理化性質(zhì)及疏水性分析

NtCBL1編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明：亮氨酸Leu(22,10.3%)，苯丙氨酸Phe(20,9.4%)，谷氨酸Glu(19,8.9%)，賴氨酸Lys(18,8.5%)，天冬氨酸Asp(16,7.5%)，而酪氨酸Tyr(2,0.9%)和色氨酸Trp(1,0.5%)含量較低。該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為24.5 kDa，理論等電點(diǎn)PI為5.03，不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)是35.75，該蛋白可能是一個(gè)穩(wěn)定的酸性蛋白。該蛋白總的親水性平均指數(shù)為-0.184，DNAMAN軟件進(jìn)行的疏水性分析結(jié)果顯示(圖3)，預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。

圖3 NtCBL1疏水區(qū)預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophobic region prediction of NtCBL1

2.3.2 NtCBL1的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用IBCP的在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)，對(duì)NtCBL1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白中45.54%氨基酸參與α-螺旋(Alpha helix)，26.29%的氨基酸參與無規(guī)則卷曲(Random coil)，17.37%的氨基酸參與延伸鏈(Extended strand)，僅有10.80%的氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)，由此可見，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的最大元件為α-螺旋(圖4)。運(yùn)用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)NtCBL1的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，RasTop軟件進(jìn)行顯示(圖5)，并將結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行比照，結(jié)果較為統(tǒng)一。

圖4 NtCBL1的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 The secondary structure prediction of NtCBL1

圖5 NtCBL1的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 The tertiary structure prediction of NtCBL1

2.3.3 NtCBL1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽的分析有助于蛋白質(zhì)功能域的區(qū)分及蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位(圖6)。利用Signal-P4.1，它根據(jù)信號(hào)肽序列特征，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法或隱馬氏模型方法，對(duì)信號(hào)肽位置及切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)用Y-score maximum來判斷，是否是分泌蛋白用mean S-score來判斷，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：mean S-score為0.097，小于0.5，則預(yù)測(cè)該蛋白不是分泌蛋白，不存在信號(hào)肽。

2.3.4編碼NtCBL1蛋白的結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的SMART軟件對(duì)NtCBL1編碼蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖7)，該蛋白含有3個(gè)保守的EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，作為鈣結(jié)合蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征，分別位于第71～99位、第108～136位、第152～180位氨基酸。另外，NtCBL1蛋白在N端含有豆蔻?；稽c(diǎn)MGXXXS/T，該位點(diǎn)在蛋白互作和蛋白與膜的附著方面起一定作用。在細(xì)胞內(nèi)的特異定位是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)響應(yīng)過程的重要環(huán)節(jié)。特異性Ca2+信號(hào)傳遞給哪條信號(hào)通路的哪種類型的Ca2+受體及其家族中的哪個(gè)成員，這在很大程度上取決于這些信號(hào)通路成員的組織和亞細(xì)胞定位。利用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)在線預(yù)測(cè)NtCBL1的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，在微體上占0.612，在細(xì)胞質(zhì)中占0.450，在線粒體基質(zhì)中占0.1，在質(zhì)膜上占0.1，預(yù)測(cè)NtCBL1可能定位在微體中。

圖6 NtCBL1的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6 Signal peptide prediction of NtCBL1

圖7 NtCBL1的結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Structure domain analysis of NtCBL1

2.3.5 NtCBL1同源性分析

把NtCBL1編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，按照相似性程度高低選擇20個(gè)基因編碼的氨基酸序列(包括NtCBL1)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明(圖8)，NtCBL1與林煙草CBL1、甜辣椒CBL1、番茄CBL1等具有較高的氨基酸序列同源性，分別為100%，95%，94%，與擬南芥CBL1的同源性最低，為83%。

圖8 NtCBL1的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.8 Phylogenetic analysis of NtCBL1

2.4 NtCBL1的組織表達(dá)分析

以成熟期的煙草品種K326根、莖、葉、花cDNA為模板進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，分析NtCBL1在各個(gè)組織的表達(dá)量，由圖9可知，NtCBL1的表達(dá)量由高到低依次為根>花>莖>葉，這說明NtCBL1基因主要在煙草K326植株的根中表達(dá)，并且其表達(dá)存在組織特異性。

圖9 NtCBL1在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.9 Analysis of relative expression of NtCBL1 in different tissues

2.5 逆境脅迫下NtCBL1的表達(dá)分析

2.5.1 低鉀和高鹽處理下NtCBL1的表達(dá)分析

采用Real Time PCR對(duì)NtCBL1在低鉀以及NaCl(200 mmol·L-1)處理下的表達(dá)量進(jìn)行了分析。由圖10可知，該基因在低鉀處理1～12 h內(nèi)表達(dá)量上調(diào)，12 h時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照(0 h)的2.31倍；隨后表達(dá)量下降。因此低鉀處理后，NtCBL1的表達(dá)量是先上調(diào)后降低。表明NtCBL1的表達(dá)受低鉀誘導(dǎo)。NtCBL1在高鹽誘導(dǎo)下，3 h表達(dá)量降至僅為對(duì)照(0 h)的6.9%，6 h表達(dá)量上升至最大，為對(duì)照的2.87倍；隨后表達(dá)量下降。因此高鹽處理后，NtCBL1的表達(dá)量是先下降再上調(diào)最后降低。

圖10 NtCBL1在低鉀和高鹽處理下的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Relative expression of NtCBL1 under low-K+ and high-salt treatment

圖11 NtCBL1在干旱、ABA和低溫處理下的相對(duì)表達(dá)量Fig.11 Relative expression of NtCBL1 under dry,ABA and low-temperature treatmen

2.5.2干旱、ABA和低溫處理下NtCBL1的表達(dá)分析

5% PEG6000模擬干旱環(huán)境，采用Real Time PCR對(duì)NtCBL1在干旱處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析。由圖11可知，該基因在干旱誘導(dǎo)6 h表達(dá)量上升至最大，為對(duì)照(0 h)的3.34倍；隨后表達(dá)量下降。表明NtCBL1基因的表達(dá)受干旱誘導(dǎo)。1 μmol·L-1ABA處理后，NtCBL1的表達(dá)量3 h上升至最大，為對(duì)照(0 h)的1.23倍；隨后表達(dá)量下降，6 h表達(dá)量低于對(duì)照；而12 h表達(dá)量再次出現(xiàn)上升；24 h表達(dá)量下降至對(duì)照的31%，因此ABA處理后，NtCBL1的表達(dá)量是先上調(diào)后降低。低溫4℃處理后，對(duì)NtCBL1表達(dá)量進(jìn)行定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)：該基因表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，在處理6 h后表達(dá)量上升至最大，為對(duì)照(0 h)的2.13倍；隨后表達(dá)量下降，NtCBL1的表達(dá)量總體趨勢(shì)是先上調(diào)后降低。

3 討論

在植物中，生物和非生物脅迫都會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度呈現(xiàn)時(shí)空特異性的變化，這種特異鈣信號(hào)通過各種鈣離子結(jié)合蛋白傳遞給下游，從而產(chǎn)生引起植物生理變化的反應(yīng)。植物CBL家族是研究比較深入的鈣離子結(jié)合蛋白。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，對(duì)普通煙草CBL基因的研究相對(duì)較少，本研究從普通煙草K326中克隆到一個(gè)CBL家族成員NtCBL1的cDNA序列，功能保守域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有鈣離子結(jié)構(gòu)域EF-hand，這是CBL家族的共同特征之一[14]。氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，NtCBL1與林煙草CBL1、甜辣椒CBL1、番茄CBL1的同源性較高，此外在這些蛋白N端存在一個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)MGXXXS/T，該結(jié)構(gòu)的存在可能對(duì)其與下游蛋白激酶的結(jié)合或定位有關(guān)[15]。這對(duì)于下一步基因功能研究具有重要指導(dǎo)意義。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明NtCBL1可能定位在微體上，Batistic等的研究表明，AtCBL1亞細(xì)胞定位于質(zhì)膜上[16]，吳廣宇等發(fā)現(xiàn)，野大麥HbCBL1主要定位于質(zhì)膜和細(xì)胞核中[17]；Zhang等發(fā)現(xiàn)胡楊PeCBL1亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜上[18]。不同植物中的CBL基因在亞細(xì)胞定位、CIPK相互作用的偏好性以及下游靶蛋白的選擇性等特性上都可能存在差異，說明CBL家族功能的復(fù)雜性及豐富性。要明確NtCBL1的亞細(xì)胞定位和與下游靶蛋白NtCIPK的互作定位，還需要構(gòu)建GFP融合表達(dá)蛋白及雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)(BiFC)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究利用Real Time PCR分析NtCBL1在煙草K326不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，NtCBL1在煙草根中的表達(dá)量顯著高于葉、莖和花中的表達(dá)量，推測(cè)NtCBL1可能與根部離子的吸收有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在低鉀和高鹽處理下，NtCBL1的表達(dá)量明顯上升，分別在6和12 h達(dá)到最大值，與Li等研究結(jié)果一致，茄子SmCBL1在200 mmol·L-1NaCl和100 μmol·L-1低鉀處理下，表達(dá)量也在6和12 h達(dá)到最大值[19]。表明NtCBL1的表達(dá)受到低鉀和高鹽誘導(dǎo)。CBL1響應(yīng)低鉀脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在擬南芥和水稻有所報(bào)道：CBL1-CIPK23復(fù)合物能調(diào)控K+離子通道AKTI所介導(dǎo)的K+吸收途徑，維持鉀離子平衡[6,20]。NtCBL1基因是否參與這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可利用電生理實(shí)驗(yàn)研究NtCBL1-NtCIPK復(fù)合體調(diào)控的通道電流，進(jìn)一步明確NtCBL1在煙草鉀營養(yǎng)方面的功能。本研究發(fā)現(xiàn)NtCBL1在響應(yīng)鹽脅迫的應(yīng)答較為敏感，處理6 h后表達(dá)量達(dá)到峰值。Xu等研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)BoCBL10A在耐鹽型和鹽敏感兩個(gè)品種中表達(dá)量明顯不同，耐鹽型BoCBL10A-6較鹽敏感型BoCBL10A-3表達(dá)量明顯更高，對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答更為迅速[21]。在低鉀和高鹽脅迫下，胡楊PeCBL1能增強(qiáng)K+的內(nèi)流，負(fù)調(diào)控Na+的外排[18]，所以我們猜測(cè)NtCBL1與煙草耐鹽性相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)煙草NtCBL1在ABA、干旱和低溫脅迫下，表達(dá)量明顯上升，與Chen等研究結(jié)果相似，歐洲油菜BnCBL1在ABA、滲透脅迫處理后，表達(dá)量也顯著上升[22]；擬南芥AtCBL1的表達(dá)受冷脅迫誘導(dǎo)，并且AtCBL1在調(diào)節(jié)對(duì)冷脅迫應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用[23]；胡楊PeCBL1的表達(dá)也與干旱、冷脅迫相關(guān)，其表達(dá)量在逆境條件下上升，PeCBL1在逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[24]。本研究結(jié)果表明CBL1在逆境下的表達(dá)特性具有保守性，猜測(cè)NtCBL1與模式植物擬南芥AtCBL1類似，在響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著作用，要明確NtCBL1參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。已成功構(gòu)建NtCBL1基因的過量表達(dá)載體，后續(xù)工作可構(gòu)建NtCBL1基因的RNAi載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究。

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The Foundation of State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry,China(SKLPPBKF1505,SKLPPBKF1506)

introduction：ZHANG Xue-Wei(1993—),female,master,mainly engaged in the study of molecular biology of tobacco.

date:2016-12-08

Cloning,ConstructionofExpressionVectorandExpressionAnalysisofNtCBL1inNicotianatabacum

ZHANG Xue-Wei LIU Lun LU Li-Ming LI Li-Qin*

(College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130)

CBL is a kind of Ca2+sensor, which plays a pivotal role in adaptation or resistance to stress in plants. ACBL1 homologous gene was cloned from the tobacco cultivar K326, which contained a 642 bp ORF encoding 213 amino acid. The predictedmolecular weight was 24.5 kDa and the isoelectric point(pI) was 5.03. By the homology analysis, the gene had high homology with calcineurin B-like protein 1 of theNicotianasylvestris(NsCBL1) andArabidopsisthaliana(AtCBL1), so named asNtCBL1. By bioinformatics analysis, NtCBL1 had the conserved EF-hand calcium binding domain of the CBL family. Expression patterns showed that the gene was expressed in roots, stems, leaves and flowers in mature stage, and the highest expression level in roots.Expression patterns under adversity stress indicated that the gene expression was induced by low-potassium, high-salt,anddrought, ABA and low-temperature, and participated in the response to biological and abiotic stress inNicotianatabacum. The research constructedNtCBL1-pBI121 overexpression vector.The results will provide some basis for the function analysis of NtCBL1 in response to stress.

tobacco;NtCBL1;cloning;sequence analysis;expression

植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLPPBKF1505,SKLPPBKF1506)

張雪薇(1993—)，女，碩士研究生，主要從事煙草分子生物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail:liliqin88@163.com

2016-12-08

* Corresponding author：E-mail:liliqin88@163.com

S572

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.03.009