趙曉誠，林 清，左自意，黃永震，黨瑞華，藍賢勇，陳 宏，雷初朝﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西意發(fā)生態(tài)農(nóng)牧發(fā)展有限公司，陜西 山陽 726499)

科學試驗

嶺南黃牛Y-SNP遺傳多樣性與父系起源研究

趙曉誠1，林 清1，左自意2，黃永震1，黨瑞華1，藍賢勇1，陳 宏1，雷初朝1﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西意發(fā)生態(tài)農(nóng)牧發(fā)展有限公司，陜西 山陽 726499)

[目的]通過對嶺南牛兩個Y-SNPs 標記進行研究，了解嶺南牛的父系起源及遺傳多樣性。 [方法]采用PCR擴增、測序及生物信息學方法。[結(jié)果]通過對30頭嶺南牛Y-SNPs 標記進行分析，發(fā)現(xiàn)有28個Y3單倍型組，占總個體數(shù)的93.33%，2個為Y2單倍型組，占6.67%。表明嶺南牛有普通牛和瘤牛2個父系起源。[結(jié)論]嶺南牛屬于南方牛類型，受瘤牛的影響很大，具有瘤牛和普通牛的種質(zhì)特征。

嶺南牛；Y-SNPs；遺傳多樣性；父系起源

牛是反芻動物，在我國，一般將水牛和牦牛之外的家牛統(tǒng)稱為黃牛。黃牛有普通牛和瘤牛兩個物種，其共同祖先為原牛。我國地域遼闊，各地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異很大，有適應不同生態(tài)環(huán)境的地方黃牛品種，具有豐富的遺傳多樣性，是世界牛品種資源寶庫的重要組成部分[1]。牛是最有經(jīng)濟價值的家畜之一，在人類文明的進步發(fā)展史上發(fā)揮著重要的作用。而關(guān)于牛的起源進化，一直是人們研究的重點?，F(xiàn)在普遍認同的“雙重馴化”觀點認為，新月形地區(qū)是普通牛的發(fā)源地，而具有肩峰的瘤牛則起源于干旱的印度次大陸[2]。

動物的Y染色體突變率低，有完整的單倍型，且不受重組和回復突變的影響，是研究動物父系起源與遷徙路線的重要工具。根據(jù)染色體的形態(tài)特點，可以將中國地方黃牛Y染色體分為3大類：(1)北方黃牛均為中部或亞中部著絲粒Y染色體，為普通牛起源；(2)南方黃牛均為端部著絲粒Y染色體，屬于瘤牛起源；(3)中原黃牛存在中部或亞中部著絲粒和端部著絲粒Y染色體，屬于普通牛與瘤牛的混合起源[3]。Y染色體SNPs(Y-SNPs)是指位于Y染色體上非重組區(qū)的單核苷酸多態(tài)性，其在減數(shù)分裂時不與X染色體配對，被廣泛用于家牛的起源進化分析。研究發(fā)現(xiàn)家牛具有3種Y染色體單倍型組Y1、Y2和Y3，其中Y1和Y2單倍型組均為普通牛起源，而Y3單倍型組則代表瘤牛起源[4-6]。

目前關(guān)于中國黃牛Y染色體分子遺傳多樣性與起源進化的研究不多，其中大部分采用Y-STR標記[7-9]。由于Y-STR難以精確區(qū)分黃牛的Y1、Y2和Y3單倍型組，因此本研究采用經(jīng)典的Y-SNPs標記來揭示嶺南黃牛的Y染色體單倍型類型、頻率及遺傳多樣性，為嶺南黃牛的分子遺傳多樣性數(shù)據(jù)庫、遺傳資源的保種策略提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

在嶺南牛主產(chǎn)區(qū)陜西商洛市山陽縣隨機選取嶺南公牛30頭，采集其組織樣帶回實驗室，在-80℃低溫保存。

1.2黃牛基因組DNA的提取與Y-SNPs位點的選擇

基因組DNA的提取采用標準的酚-氯仿法。本研究選用中國黃牛2個經(jīng)典Y-SNPs位點，即ZFY10、UTY19作為標記來研究嶺南牛的父系起源及遺傳多樣性[10]，各標記詳細信息如表1所示，所用2對引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

表1 嶺南牛2個Y-SNPs標記的PCR片段大小、退火溫度與引物序列

1.3黃牛Y-SNPs標記的PCR擴增體系與多態(tài)性分析

PCR擴增總體積為12.5 μL，其中，2×Taq MasterMix 6.25 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol·L-1)，嶺南牛模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。反應條件為：95℃預變性4 min；94℃變性30s，退火45 s(退火溫度見表1)，72℃延伸30 s，36個循環(huán)；72℃充分延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，將檢測合格的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1嶺南黃牛存在普通牛Y2和瘤牛Y3單倍型組

嶺南黃牛2個Y-SNPs標記的PCR擴增情況表明，母牛沒有擴增產(chǎn)物，公牛均有相應的擴增產(chǎn)物，表明2個Y-SNPs標記是黃牛Y染色體所特有的，可以用來研究嶺南黃牛的Y染色體單倍型和父系起源。 30頭嶺南黃牛UTY19測序分型結(jié)果(如圖1)，未發(fā)現(xiàn)嶺南黃牛存在Y1單倍型組，而在ZFY10測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有2種基因型(如圖2)，由表2可見嶺南黃牛存在Y2和Y3兩種單倍型組[4]。

圖1 嶺南黃牛UTY19沒有多態(tài)性

圖2 嶺南黃牛ZFY10表現(xiàn)多態(tài)性

單倍型起源ZFY10UTY19Y2普通牛CAY3瘤牛TA

2.2嶺南黃牛Y染色體SNP單倍型頻率

在所分析的30頭嶺南黃牛中，有28頭黃牛為Y3單倍型組(占所測個體數(shù)的93.33%)，2頭黃牛為Y2單倍型組(6.67%)，表明嶺南黃牛的父系起源以瘤牛為主，普通牛為輔。根據(jù)地域分析，嶺南黃牛屬于南方黃牛類型，這與中國南方黃牛的起源進化是一致的。

討論

作為母系遺傳mtDNA多態(tài)性研究的補充，父系遺傳的Y-SNPs 標記分析為闡明我國地方黃牛群體間的關(guān)系以及中國黃牛的起源提供了新的分子遺傳學證據(jù)，尤其是Y染色體特異SNP的發(fā)展更是很大程度上改變了Y染色體缺乏多態(tài)性的觀點，為研究中國地方黃牛品種之間的父系遺傳多樣性，揭示中國與歐美肉牛品種之間的異同點提供了科學依據(jù)[10-12]，為我國肉牛新品種培育提供了分子遺傳學數(shù)據(jù)。

常振華等[10]對中國16個地方黃牛品種的4個Y-SNPs標記(DDX3Y-7、UTY19、ZFY9和ZFY10)進行了研究，證實中國地方黃牛品種具有Y染色體單倍型多態(tài)性，證明普通牛(Y2單倍型)和瘤牛(Y3單倍型)為中國黃牛的兩個父系起源。程明等[12]研究了大別山黃牛、鄖巴黃牛、恩施黃牛和秦川牛共計96個個體的5個Y-SNPs標記(ZFY9、ZFY10、DDX3Y7、 DDX3Y1和UTY19)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個黃牛品種中，ZFY9、ZFY10、DDX3Y7、DDX3Y1表現(xiàn)多態(tài)，UTY19表現(xiàn)單態(tài)，結(jié)果表明4個黃牛的父系起源均為普通牛(Y2單倍型組)和瘤牛(Y3單倍型組)。

嶺南牛具有適應性強、挽力大、耐粗放、善爬坡、產(chǎn)肉性能好、繁殖力高等優(yōu)良品質(zhì)[13]。本研究對嶺南黃牛2個SNPs標記進行研究，發(fā)現(xiàn)嶺南黃牛有普通牛(Y2單倍型組)和瘤牛(Y3單倍型組)2個父系起源，其中，Y3單倍型組的頻率為93.33%，而Y2單倍型組僅占6.67%，表明嶺南黃牛在遺傳血統(tǒng)上更偏向于瘤牛，且具有普通牛與瘤牛的種質(zhì)特征。本研究的結(jié)果與Y染色體核型的研究結(jié)果是基本一致的[3]。

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GeneticDiversityandPaternalOriginBasedonY-SNPsMarkersinLingnanCattle

ZHAO Xiao-cheng1,LIN Qing1,ZUO Zi-yi2,HUANG Yong-zhen1,DANG Rui-hua1,LAN Xian-yong1,CHEN Hong1,LEI Chu-zhao1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China; 2.ShaanxiYifaEcologicalAnimalHusbandryDevelopmentCo.ltd,Shanyang,Shaanxi, 726499,China)

[Objective]The aim of this paper was to analyze the paternal origin and genetic diversity of Lingnan cattle based on study of two single nucleotide polymorphism in Y chromosome.[Method]Two Y-SNPs loci of 30 Lingnan cattle bulls were analyzed using PCR, sequencing and bioinformatics methods.[Result]Based on the analysis about these two SNP loci in 30 samples, the results showed that 28 Y3 haplotype were identified, and the frequencies of Y3 haplotype were 93.33% as well as the frequencies of Y2 haplotypes were 6.67%, which indicated that Lingnan cattle have two distinct paternal origins from Bos tuarus and Bos indicus. [Conclusion] Lingnan cattle, the southern cattle type in China, had two types of paternal origins from Bos taurus and Bos indicus, which was mainly affected by Bos indicus.

Lingnan cattle；Y-SNPs；genetic diversity；paternal origin

2017-04-20接收日期2017-05-03

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)資助。

趙曉誠(1992-)，男，山西永濟人，碩士研究生，主要從事動物遺傳資源研究。

*通訊作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常寧人，教授，博導，主要從事牛遺傳資源研究。

S823

A

1001-9111(2017)04-0004-03