孫大壯，王蕊，宋春青，許勇民，董雪松

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽 110001）

· 論著 ·

百草枯通過激活線粒體凋亡通路誘導人肺Ⅱ型上皮樣A549細胞凋亡

孫大壯，王蕊，宋春青，許勇民，董雪松

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽 110001）

目的探討百草枯（PQ）誘導人肺Ⅱ型上皮樣A549細胞凋亡過程中線粒體凋亡通路的發(fā)生機制。方法體外培養(yǎng)A549細胞，對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的PQ（50、100、150和200 μ mol/L），2組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。MTT法檢測細胞活性；Hoechst 33258染色法觀察細胞核的形態(tài)；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率以及線粒體膜電位；分光光度法檢測caspase-3和caspase-9的活化程度；Western blotting檢測線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak的表達。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，PQ對A549細胞具有顯著的生長抑制作用。Hoechst染色顯示，不同濃度的PQ作用于A549細胞24和48 h后，可發(fā)現(xiàn)細胞凋亡的特征性改變，如細胞核固縮、核碎裂、凋亡小體形成，并且細胞的凋亡程度隨著PQ濃度的增大和作用時間的延長而加重。細胞凋亡率升高也證實了這一結(jié)果。線粒體膜電位出現(xiàn)不同程度的降低；caspase-3和caspase-9活性不同程度的增加；抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達量降低；促凋亡蛋白Bax、Bak的表達量升高。以上結(jié)果均呈時間與濃度依賴性。結(jié)論PQ通過激活線粒體凋亡通路誘導A549細胞凋亡。

百草枯；肺泡上皮細胞；線粒體；凋亡

百草枯（paraquat，PQ）化學名稱為1，1’-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶陽離子鹽，在過去幾十年中PQ是全世界使用非常廣泛的一種季胺類高效能除草劑。最近十余年里，服用PQ自殺或PQ意外中毒的發(fā)生率在亞洲特別是中國呈增加的趨勢，且死亡率居高不下［1-2］。PQ經(jīng)皮膚、呼吸道和消化道均可吸收。進入體內(nèi)的PQ可迅速分布至各個器官，從而引起機體多器官功能損害，其中肺組織是PQ中毒的主要靶器官［3］，急性PQ中毒導致患者出現(xiàn)肺水腫、肺泡出血、肺泡上皮間質(zhì)炎癥和損傷［4-5］。中毒患者早期往往死于急性呼吸窘迫綜合征，存活患者逐漸發(fā)展為肺纖維化，最終死于呼吸衰竭。盡管到目前為止，已有很多PQ導致肺損傷及肺間質(zhì)纖維化的研究，但發(fā)病機制仍不十分明確［6］。PQ的細胞毒性是通過損傷線粒體來實現(xiàn)的［7-8］，但是PQ導致線粒體功能障礙的確切機制并不清楚。已有研究表明，肺泡上皮細胞凋亡是肺纖維化的起始機制［9］。因此，本研究的目的是探討PQ誘導人肺Ⅱ型上皮樣A549細胞凋亡機制，檢測細胞線粒體凋亡通路的作用及意義，為臨床治療PQ中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌A549細胞株由中國醫(yī)科大學實驗中心提供。胎牛血清（美國Gemini公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司），PQ、胰蛋白酶、MTT、DMSO、羅丹明123（美國Sigma公司），Hoechst染色試劑盒、ECL發(fā)光液和細胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所），caspase活性檢測試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司），細胞凋亡檢測試劑盒（日本DOJINDO公司），Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak、β-actin、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體（美國Proteintech Group公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)條件為含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。實驗組加入不同濃度的PQ（分別為50、100、150和200 μ mol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。

1.2.2 細胞活性檢測：以1×105/mL的密度種植在96孔板內(nèi)，每孔100 μ L，培養(yǎng)24 h后，實驗組加入不同濃度的PQ，同時對照組加入等量的培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。孵育完成后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μ L混勻，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，吸干每孔內(nèi)的上清，每孔加入DMSO 150 μ L震蕩，使沉淀充分溶解。酶標儀570 nm測定吸光度值。

1.2.3 Hoechst 33258染色：按實驗分組處理細胞并繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，吸干培養(yǎng)液，加入固定液，固定10 min，吸出固定液PBS洗3次，然后加入Hoechst染液5 min，吸出染液后PBS洗3次，滴一滴抗熒光淬滅液，熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)。

1.2.4 細胞凋亡率檢測：細胞于6孔板內(nèi)貼壁后，按實驗分組處理細胞并繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。孵育完成后，使用不含EDTA的胰蛋白酶收集2組細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入5 μ L的Annexin V-FITC和5 μ L 碘化丙啶室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 線粒體膜電位檢測：細胞按處理因素孵育完成后，每孔加入含有1 μ mol/L羅丹明的培養(yǎng)液，避光室溫孵育30 min。使用不含EDTA的胰蛋白酶收集細胞，PBS洗滌，流式細胞儀檢測線粒體膜電位。

1.2.6 caspases活性檢測：各組細胞處理結(jié)束后，收集各組細胞，PBS洗滌，加入裂解緩沖液，待細胞裂解完全，10 000 r/min離心1 min收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白濃度定為3 μ g/μ L，吸取50 μ L細胞裂解產(chǎn)物加入50 μ L的2×緩沖液與5 μ L caspase反應(yīng)底物37 ℃避光孵育4 h。酶標儀405 nm測定吸光度值。

1.2.7 Western blotting 檢測Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白的表達：收集各組細胞并提取蛋白，通過BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，濕電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TBST稀釋的Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak和β-actin抗體，4 ℃過夜，洗膜后加入TBST稀釋的二抗，室溫2 h。用ECL顯色，最后進行顯影，定影。采用Image J圖像分析軟件進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均采用x-±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用Dunnett t檢驗，方差不齊時用Dunnett T3檢驗。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PQ對A549細胞活性的影響

不同濃度的PQ作用24 h后，與對照組相比，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實驗組A549細胞活性分別降至98.25%±0.52%、49.57%±2.74%、41.57%±2.21% 和36.68%±1.61%；相同處理條件48 h后，與對照組相比，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實驗 組A549細 胞 活性 分 別降 至95.89%±3.68%、38.23%±3.17%、18.33%±4.84%和10.30%±2.68%。PQ的半數(shù)抑制濃度在24和48 h時分別為131.92和 96.96 μ mol/L。見圖1。

圖1 不同濃度的PQ處理A549細胞24和48 h后對細胞活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of PQ on cell viability of A549 cells after 24 and 48 h

2.2 Hoechst染色檢測細胞凋亡形態(tài)

PQ作用于A549細胞后細胞形態(tài)發(fā)生改變。Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，隨著PQ濃度的增加和作用時間的延長，視野中凋亡的A549細胞數(shù)目越來越多。凋亡的A549細胞可清晰地看見核固縮、核碎裂和凋亡小體形成。見圖2。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

不同濃度的PQ作用A549細胞24 h后，對照組細胞的凋亡率為3.80%±0.50%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實驗組細胞的凋亡率分別為4.94%±1.20%、6.01%±0.78%、7.22%±1.50%和7.64%±1.23%。相同處理條件48 h后，對照組細胞的凋亡率為 3.85%±0.60%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實驗組細胞的凋亡率分別為5.40%±1.30%、10.48%±2.10%、56.64% ±3.20%和77.43%±4.00%。與對照組相比，PQ處理A549細胞后，細胞凋亡率隨著PQ濃度的增加和作用時間的延長逐漸升高。

圖2 不同濃度的PQ處理A549細胞24和48 h后對細胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of PQ on morphological changes in A549 cells after 24 and 48 h

圖3 不同濃度的PQ處理A549細胞24和48 h后對細胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of PQ on apoptosis of A549 cells after 24 and 48 h

2.4 羅丹明123染色檢測線粒體膜電位變化

不同濃度的PQ作用24 h后，對照組A549細胞熒光強度降低的比例為4.90%±0.80%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實驗組A549細胞熒光強度降低的比例分別為6.20%±1.29%、7.30%±1.52%、9.00%±1.00%和13.10%±1.50%。相同處理條件48 h后，對照組A549細胞熒光強度降低的比例為4.90%±1.00%，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實驗組A549細胞熒光強度降低的比例分別為7.30%±1.05%、30.10%±2.15%、57.00%±2.95%和69.00%±4.00%。與對照組相比，實驗組A549細胞隨著PQ濃度的增加和作用時間的延長熒光強度逐漸降低，表明線粒體膜電位逐漸降低。見圖4。

2.5 分光光度法測定caspase-3和caspase-9活性

不同濃度的PQ作用24 h后，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的 實 驗 組A549細 胞caspase-3活性與對照組相比分別增加2.30%±2.11%、18.40%±5.05%、22.50%±3.61%和35.60%±6.12%，caspase-9活性與對照組相比分別增加1.00%±2.01%、16.20%±1.60%、20.20%±3.59%和 30.30%±7.11%；相同處理條件48 h后，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的 實 驗 組A549細 胞caspase-3活 性 與 對照組相比分別增加4.50%±2.50%、55.60%±4.52%、65.30%±7.60%和 80.10%±5.30%，caspase-9活性與對照組相比分別增加 3.50%±2.51%、 50.20%±4.62%、68.50%±7.59%和 75.20%±5.63%。結(jié)果表明， caspase-3和caspase-9的活性隨著PQ濃度的增加和作用時間的延長逐漸升高。見圖5。

2.6 Western blotting檢測Bcl-2家族蛋白的表達

圖4 不同濃度的PQ處理A549細胞24和48 h后對線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of different concentrations of PQ on mitochondrial transmembrane potential in A549 cells after 24 and 48 h

Western blotting結(jié)果顯示，不同濃度的PQ作用24和48 h后，與對照組相比，PQ濃度分別為50、100、150和200 μ mol/L的實驗組A549細胞隨著PQ濃度的增加和作用時間的延長促凋亡蛋白Bax、Bak的表達明顯增加，同時抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達明顯減少。見圖6。

圖5 不同濃度的PQ處理A549細胞24和48 h后對caspase-3和caspase-9活性的影響Fig.5 Effect of different concentrations of PQ on activities of caspase-3 and caspase-9 in A549 cells after 24 and 48 h

3 討論

肺臟是PQ作用的主要靶器官。攝入體內(nèi)的PQ在肺組織中的濃度是血漿中濃度的6～10倍，并且在血漿中PQ濃度下降時，仍可在肺內(nèi)維持［3］。由于PQ可與胺類物質(zhì)競爭多胺轉(zhuǎn)運/攝取系統(tǒng)，經(jīng)Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細胞和Clara細胞攝取，造成廣泛的肺損傷，最終發(fā)展為不可逆的肺纖維化。肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變，也就是正常的肺泡組織被損壞后經(jīng)過異常修復導致結(jié)構(gòu)異常（疤痕形成）。研究［10］表明凋亡在肺纖維化的進程中起重要的作用，而且線粒體功能損傷在調(diào)控肺泡上皮細胞凋亡的過程中非常重要［11］。因此，研究線粒體在PQ誘導的肺泡上皮細胞損傷中的作用機制具有重要意義，有助于闡明PQ導致肺損傷的發(fā)病機制，為臨床診治提供理論基礎(chǔ)和指導。

圖6 不同濃度的PQ處理A549細胞24和48 h后對Bcl-2家族蛋白表達的影響Fig.6 Effect of different concentrations of PQ on expression of Bcl-2 family proteins in A549 cells after 24 and 48 h

近期有國外文獻［12-13］報道，PQ在肺泡上皮細胞積累并對其造成損傷，進而干擾抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生的活性氧導致氧化應(yīng)激對肺泡上皮細胞造成損傷，在PQ誘導的肺泡上皮細胞損傷中起關(guān)鍵作用。國內(nèi)有文獻報道，PQ引起大鼠肺組織Bcl-2/Bax基因的不均衡表達［14］，上調(diào)大鼠肺組織線粒體VDAC及caspase-3、caspase-8、caspase-9的表達［15］。以上研究結(jié)果提示，PQ誘導的肺泡上皮細胞損傷可能通過線粒體凋亡通路。因此，本研究通過MTT、凋亡檢測、線粒體膜電位檢測、caspases活性檢測和Western blotting一系列方法，研究PQ誘導肺上皮細胞損傷的潛在機制。

MTT是一種常用的實驗方法，用來研究藥物對細胞增殖的影響。本研究中MTT結(jié)果表明，PQ對A549細胞具有顯著的生長抑制作用，并呈明顯的劑量和時間依賴性。Hoechst染色后熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)以及Annexin V/碘化丙啶染色后流式細胞儀檢測，是證明藥物是否誘導細胞發(fā)生凋亡的常用手段。結(jié)果表明，實驗組的A549細胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂和凋亡小體形成，并且凋亡率與對照組相比顯著升高，表明PQ抑制細胞增殖與凋亡相關(guān)。

凋亡是細胞程序性死亡過程，對維持細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要的監(jiān)管作用。細胞的凋亡受許多內(nèi)在和外在因素的影響，特別是caspase［16］和Bcl-2蛋白家族［17］。本研究結(jié)果表明，實驗組caspases-3和caspases-9的活性明顯高于對照組并呈明顯的劑量和時間依賴性。同時隨著PQ濃度的增加和作用時間的延長，Bax和Bak蛋白的表達逐漸增加，而Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表達逐漸減少。線粒體是能量代謝的中心，其功能障礙可直接誘導細胞凋亡，因此線粒體介導的凋亡被視為主要的凋亡通路［18］。其中線粒體跨膜電位的破壞，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體膜電位去極化誘導一些促凋亡因子包括細胞色素C從線粒體中釋放出來，激活caspase-9和caspase-3，最終導致細胞凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示，實驗組線粒體膜電位與對照組相比明顯降低，并呈時間和濃度依賴性，表明PQ誘導肺上皮樣A549細胞凋亡可能通過線粒體凋亡途徑。

綜上所述，本研究以A549細胞作為人肺泡Ⅱ型上皮細胞模型來評估PQ誘導的細胞凋亡，證明PQ誘導A549細胞凋亡通過線粒體凋亡通路，為新藥的研發(fā)提供了實驗和理論依據(jù)。

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（編輯 陳 姜）

Mitochondria-mediated Apoptosis in Human Lung Type Ⅱ Alveolar Epithelial-like A549 Cells by Paraquat

SUN Dazhuang，WANG Rui，SONG Chunqing，XU Yongmin，DONG Xuesong
（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the apoptosis mechanism induced by paraquat （PQ） in human typeⅡalveolar epithelial-like A549 cells.MethodsA549 cells were cultured in vitro. The cells in the experimental group were exposed to various concentrations of PQ （50，100，150，and 200 μ mol/L），while those in the control group were cultured in RPMI 1640 medium. After treatment for 24 and 48 h，the cell survival rate was assessed by MTT assay. Morphological changes in the nuclei were observed by Hoechst 33258 fluorescence staining.Cellular apoptosis and mitochondrial transmembrane potential were assayed by flow cytometry. The activities of caspase-3 and caspase-9 were assayed by spectrophotometry. Western blotting was used to analyze the expression of proteins in the Bcl-2 family，such as Bcl-2，Bcl-xL，Bax，and Bak.ResultsPQ exhibited significant anti-proliferative activity in A549 cells. PQ-treated A549 cells were subjected to Hoechst 33258 staining. The hallmarks of apoptosis were detected，and the degree of apoptosis increased. Mitochondrial membrane potential was decreased，the levels of active caspase-3 and caspase-9 increased，the expression of Bcl-2 and Bcl-xL was decreased，and the expression of Bax and Bak was increased. These effects occurred in concentration- and time-dependent manners.ConclusionPQ efficiently induced intracellular apoptosis through the mitochondrial pathway in A549 cells.

paraquat； alveolar epithelial cells； mitochondria； apoptosis

R595.4

A

0258-4646（2017）11-0961-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.001

國家自然科學基金（81471851）；遼寧省博士啟動基金（20141033）

孫大壯（1991 -），男，碩士研究生.

董雪松，E-mail：dongxues@163.com

2017-04-14

網(wǎng)絡(luò)出版時間：