姚倩鈺，賀德春，龔道新，丁紫榮，趙 波，張漫雯，黎玉清

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410000 2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510000 3.原廣州軍區(qū)工程環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督站，廣東 廣州 510507

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定廢水中5種喹諾酮類抗生素

姚倩鈺1,2,3，賀德春2，龔道新1，丁紫榮2，趙 波2，張漫雯2，黎玉清2

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410000 2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510000 3.原廣州軍區(qū)工程環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督站，廣東 廣州 510507

建立高濃度有機廢水中5種喹諾酮類抗生素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。水樣經(jīng)HLB固相萃取小柱富集凈化，12 ml甲醇洗脫、濃縮并加入內(nèi)標(biāo)溶液后，定容至1 mL待測。以C18柱為分離柱，含0.01%甲酸的甲醇-含0.01%甲酸的水溶液為流動相，目標(biāo)物質(zhì)在10 min內(nèi)分離。在0.25～1 250 ng/mL范圍內(nèi)，目標(biāo)物質(zhì)線性關(guān)系良好(R2>0.99)?；|(zhì)加標(biāo)試驗結(jié)果表明，純水中的回收率為61.40%～91.92%，廢水中的回收率為54.92%～101.87%，檢出限為0.25～2.5 ng/L，方法定量限為0.36～3.99 ng/L。應(yīng)用該方法對21家豬場的64份廢水樣品進行分析，5種喹諾酮類抗生素的檢出頻率為47%～95%，平均檢出濃度為980～5 734 ng/L。該方法快速、準(zhǔn)確，適用于高濃度有機廢水中喹諾酮類抗生素的同時測定。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃取；廢水；喹諾酮類抗生素

Abstract:A method was established for determination of 5 fluoroquinolone antibiotics in high concentration of organic wastewater using solid phase extraction (SPE) followed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in this paper. Aqueous samples were developed with Oasis HLB solid-phase extraction (SPE) cartridges and the targeted antibiotics were subsequently eluted by 12 mL methanol. After concentration, the elutes were added internal standards and determined by HPLC-MS/MS equipped with a reverse-phase C18column. The results of method development showed that the 5 kinds of fluoroquinolone could be efficiently separated within 10 minutes by HPLC-MSMS; the calibration curve ranged 0.25-1 250 ng/mL and showed high relationship (R2>0.99). The recoveries for all analytes in pure water matrices were above 60%, and the recoveries of target compounds in real wastewater samples ranged 54.92%-101.87%; detection limits varied between 0.25-2.5 ng/L and quantization limits were 0.36-3.99 ng/L. The presented method was successfully applied to quantify the five fluoroquinolones in 64 wastewater samples from 21 pig farms. The detection frequency of five quinolones in real samples was 47%-95% and the average detection concentration was found to be 980 to 5 734 ng/L. All the results indicate that this method is suitable for rapid determination of fluoroquinolone antibiotics in high concentration of organic wastewater.

Keywords:high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;solid phase extraction;wastewater;fluoroquinolone antibiotics

1946年，首次報道在飼料中添加抗生素能提高畜禽的日增重，之后抗生素的使用越來越廣泛，濫用現(xiàn)象也日益嚴(yán)重[1-2]?？股卦谑褂眠^程中，只有極少部分被動物或人吸收，并通過代謝反應(yīng)生成無活性產(chǎn)物，大部分是以原藥的形式隨動物糞尿排出體外，進入環(huán)境中[3-6]?？股氐臐撛陲L(fēng)險主要表現(xiàn)在它的生物毒性效應(yīng)上，在環(huán)境中大量殘留會對土壤、水體生態(tài)環(huán)境、植物生長，以及人類健康具有潛在危害，例如，抗生素抗性基因污染，出現(xiàn)耐藥性微生物，抑制動植物生長，對動物、人體產(chǎn)生直接毒性反應(yīng)、過敏反應(yīng)等毒副作用[7-9]。喹諾酮類抗生素因其廣譜、高效、低毒等特點，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，各種畜禽廢棄物和環(huán)境介質(zhì)中也廣泛檢測到喹諾酮類抗生素的殘留[10-12]。喹諾酮類抗生素在養(yǎng)殖行業(yè)的使用及其風(fēng)險引起了廣大科研工作者的高度關(guān)注。同時，洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物也在人類醫(yī)療中廣泛使用，其在養(yǎng)殖行業(yè)的大量使用將給人類健康帶來巨大危險。2015年9月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告規(guī)定自2016年1月1日起，養(yǎng)殖業(yè)停止經(jīng)營、使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、脂及其制劑[13]。開展廢水中喹諾酮類抗生素的檢測方法及殘留現(xiàn)狀研究，對于評估其環(huán)境與健康風(fēng)險，加強監(jiān)督管理具有重要意義。

近年來，高效液相色譜法[14]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[15-20]廣泛應(yīng)用于各種介質(zhì)中抗生素的檢測。但高效液相色譜法無法克服基質(zhì)干擾效應(yīng)，尤其難以克服高濃度有機廢水的基質(zhì)干擾。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有更高的靈敏性和選擇性，能夠有效克服基質(zhì)干擾[21]。本文通過對高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定條件進行優(yōu)化，完善了廢水中抗生素的富集與凈化等前處理條件，建立一種同時測定廢水中5種喹諾酮類抗生素的檢測方法，為快速、準(zhǔn)確測定廢水中抗生素含量提供技術(shù)支撐。應(yīng)用建立的檢測方法，對多個省市豬場廢水中5種喹諾酮類抗生素的殘留現(xiàn)狀進行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1試劑與材料

諾氟沙星(NOR)、恩氟沙星(ENR)、培佛沙星(PEF)、氧氟沙星(OFL)、環(huán)丙沙星(CIP)，均購于德國，純度大于99.0%。分別稱取10.0 mg上述抗生素，用甲醇定溶于10 mL的容量瓶中，配置成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，轉(zhuǎn)移至棕色瓶內(nèi)，存放于-18 ℃的冰箱中。

溶劑耗材：甲醇(色譜純)；甲酸(色譜純)；鹽酸(分析純)；一次性注射器；0.22 μm的尼龍濾膜，0.45 μm，200 mm玻璃纖維濾膜。

1.2儀器與設(shè)備

快速液相色譜(Agilent 1260 Infinity，Agilent，美國)-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(ABsciex 4000 Qtrap，AB SCIEX，美國)聯(lián)用儀；24位固相萃取儀(美國)；氮吹濃縮儀(MGS-2200，日本)、超聲波清洗儀(SCQ-1000C)。

1.3液相色譜和質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Cortecstm C18(2.7 μm，4.6 ×100 mm)；流動相：A相為0.01%甲酸的水溶液，B相為0.01%甲酸的甲醇溶液；流速為0.5 mL/min，進樣體積：10 μL，柱溫為45 ℃；梯度洗脫程序為0～6 min, B相從10%增至75%，6～9 min, B相從75%增至95%，9～12 min,B相保持95%，12～12.1 min, B相從95%降至10%，平衡3.0 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI+)；離子源電壓：5 500 V，源溫度:450 ℃，霧化氣：0.045 MPa，干燥氣：0.05 MPa，氣簾氣：0.03 MPa，檢測方式：多反應(yīng)離子掃描模式(MRM)。

1.4樣品采集與前處理

1.4.1 樣品采集與保存

用棕色玻璃瓶采集養(yǎng)殖場的原水和各污水處理工藝段的出水，共64份樣品，水樣用硫酸調(diào)節(jié)pH至2左右，速運回實驗室于4 ℃冷庫避光保存，48 h內(nèi)進行萃取。采樣養(yǎng)殖場情況見表1。

1.4.2 樣品前處理

準(zhǔn)確量取500 mL經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾后的水樣，用鹽酸將pH調(diào)成2.0，加入0.5 g Na2EDTA，混勻靜置0.5 h。以5～10 mL/min的流速將水樣勻速通過依次用10 mL去離子水、10 mL甲醇、10 mL去離子水活化的Oasis HLB固相萃取小柱。水樣富集完成后，用10 mL去離子水淋洗，棄去全部流出液后抽真空干燥10 min，再用12 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管中，氮吹至近干，加入900 μL甲醇復(fù)溶，加入100 μL進樣內(nèi)標(biāo)，渦旋0.5 min，用0.22 μm針頭過濾器過濾后轉(zhuǎn)至2 mL進樣瓶中，待測。

表1 采樣養(yǎng)殖場基本情況Table 1 The general information of pig farms wherewastewater sample were collected from

注：養(yǎng)殖規(guī)模以生豬出欄量計，頭/a。

2 結(jié)果與討論

2.1儀器分析條件的選擇與優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化

[21-22]報道，以 Waters C18色譜柱為分離柱，比較了3組不同流動相對目標(biāo)化合物的分離效果與靈敏度的影響。第一組A相為含0.01%甲酸的水溶液，第二組A相為含0.1%甲酸的水溶液，第三組A相為含5 mmol/L乙酸銨的水溶液，3組流動相的B相均為含0.01%甲酸的甲醇溶液。實驗結(jié)果表明，第一組流動相的分離效果和靈敏度均較好。通過優(yōu)化流動相組分比例，調(diào)整洗脫梯度，達(dá)到較好的分離效果。5種抗生素的總離子流色譜圖和MRM色譜圖見圖1。

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

采用直接注射的進樣方法，根據(jù)目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)，選取ESI作為電離源，優(yōu)化母離子/子離子對。根據(jù)母離子與豐度高、干擾小的兩個子離子形成的離子對分別進行定性、定量分析。5種目標(biāo)抗生素的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表2。

圖1 5種抗生素的總離子流色譜圖和MRM譜圖Fig.1 Total ion chromatogram and MRM chromatogram of the 5 antibiotics

化合物母離子/(m/z)定量離子Q3/(m/z)定性離子q3/(m/z)保留時間/min碰撞電壓/(CE/eV)錐孔電壓/(DP/V)CIP332.2288.0245.05.126/3481/81PEF334.1233.2216.25.126/2470/70ENR360.1316.2245.25.427/4065/65OFL362.1318.3261.34.928/3875/75NOR320.1302.2233.24.926/3270/70

2.2樣品前處理條件的選擇與優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

在抗生素的分析中，Oasis HLB固相萃取柱應(yīng)用最為廣泛[23-24]。近年來，國內(nèi)有關(guān)廠商推出可替代Oasis HLB固相萃取柱使用的PEP固相萃取柱，其價格遠(yuǎn)低于Oasis HLB柱。通過試驗比較了Oasis HLB和PEP柱對目標(biāo)化合物的富集效率。在1 000 mL超純水中分別加入50 ng(以O(shè)FL為例)的5種抗生素，依照1.4.2小節(jié)進行樣品前處理后上機測定。2種固相萃取小柱對目標(biāo)化合物的富集效率如圖2所示。PEP柱對PEF的吸附能力較弱，HLB柱對5種抗生素的回收率為90.4%～111.7%，本實驗選用HLB柱作為富集、凈化柱。若研究對象為不包括PEF在內(nèi)的其余4種抗生素時，可用PEP柱代替Oasis HLB用作水樣的富集、凈化柱，在保證測試準(zhǔn)確性同時，可極大降低實驗成本。

圖2 萃取柱對目標(biāo)物質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of the SPE cartridge on the recovery of antibiotics

2.2.2 洗脫溶劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報道，甲醇[25-26]、乙腈[27]等常用作抗生素分析的洗脫溶劑。本實驗比較了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合液(體積比為8∶2)作為洗脫溶劑的洗脫效果。實驗共3組，每組3個平行樣品。向1 000 mL水樣中添加50 ng(以O(shè)FL為例)5種抗生素，調(diào)節(jié)溶液pH為2.0，加入0.5 g的Na2EDTA，按上述的前處理方法處理樣品，對樣品進行測定。3種洗脫溶劑的回收率如圖3所示。由于乙腈、甲醇乙腈混合液對CIP的回收率較低，甲醇對5種抗生素的回收率為83.8%～119.7%，故本實驗選取甲醇作為洗脫溶劑。

圖3 洗脫溶劑對目標(biāo)物質(zhì)回收率的影響Fig.3 Effect of the elution solvent on the recovery of antibiotics

2.2.3 洗脫溶劑用量選擇

取500 mL水樣6份，分別添加50 ng(以O(shè)FL為例)5種抗生素，調(diào)節(jié)pH為2.0，加入0.5 g的Na2EDTA，將水樣以5～10 mL/min的速度通過活化過的固相萃取柱，用去離子水清洗小柱，分別用2、4、6、8、10、12 mL的甲醇進行洗脫，洗脫液氮吹近干后用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至進樣瓶中測定。每段洗脫液目標(biāo)化合物的回收率如圖4所示。洗脫溶劑用量為8 mL時，大多數(shù)抗生素的回收率已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定，其中ENR在洗脫體積為10 mL時，回收率基本達(dá)到穩(wěn)定，為了能夠獲得較好的回收率，實驗最終確定洗脫溶液用量為12 mL。

圖4 洗脫溶劑用量對目標(biāo)物質(zhì)回收率的影響Fig.4 Effect of the elution solvent volume on the recovery of antibiotics

2.3方法性能評價

2.3.1 精密度與準(zhǔn)確度

以超純水和某養(yǎng)豬場原水水樣分別作為基質(zhì)進行基質(zhì)加標(biāo)回收率實驗，每個添加水平分別做6個平行樣，試驗結(jié)果見表3。當(dāng)分別添加低、中、

高3種濃度時，5種抗生素在超純水中回收率為 61.4%～91.92%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 6.10%～12.63%，在原水中回收率為56.72%～101.87%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.67%～9.63%。該方法可以滿足環(huán)境中抗生素物質(zhì)的分析要求。

2.3.2 線性范圍與檢測限

因各種抗生素的檢出限不同，配置成7個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，子離子定量，橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為目標(biāo)抗生素與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，做回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。顯示5種抗生素的線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99。對標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點進行稀釋，上機測定，以10倍左右信噪比的濃度作為儀器定量限。以儀器定量限結(jié)合目標(biāo)化合物的回收率和取樣體積，計算方法的定量限。線性關(guān)系和儀器檢出限見表3。5種抗生素的檢出限為0.25～2.5 ng/L,定量限為0.36～3.99 ng/L。

表3 5種化合物的檢測限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率(n=6)及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Detection limit、standard curve、recovery rate (n=6) and RSD of antibiotics

2.4廢水中喹諾酮類抗生素檢測

運用建立的分析方法對8個省的21家養(yǎng)豬場的廢水進行測定，結(jié)果如表4所示。5種喹諾酮類抗生素在64份養(yǎng)殖廢水樣品中均有不同濃度的檢出，除培氟沙星的檢出率相對較低(47%)外，其余4種喹諾酮類抗生素檢出率均在80%以上。表明，喹諾酮類抗生素廣泛殘留于養(yǎng)殖廢水中。5種抗生素的平均檢出濃度為980.2～5 734.5ng/L，最大濃度為11 320.0～62 400.0 ng/L。丁佳麗等[28]報道，長三角地區(qū)養(yǎng)豬廢水中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星檢出濃度為3 110～7 760 ng/L。陳軍平、姜凌霄[29-30]在江西省開展的采樣檢測表明，養(yǎng)豬場廢水中諾氟沙星、氧氟沙星檢出率均為100%，最高檢出濃度分別為34、 911 ng/L。閭幸[31]在浙江嘉興地區(qū)的研究表明，秋冬兩季養(yǎng)豬廢水恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星的檢出濃度為30～5 920 ng/L。本試驗測得的養(yǎng)殖廢水中喹諾酮類抗生素平均及最大檢出濃度均遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報道，可能與養(yǎng)殖場抗生素的使用不盡規(guī)范有關(guān)，不同養(yǎng)殖場抗生素的使用量、使用次數(shù)等不同，導(dǎo)致廢水中抗生素的殘留濃度變化幅度較大。

表4 廢水中喹諾酮類抗生素的檢出情況Table 4 Concentrations of antibiotics in wastewater

農(nóng)業(yè)部已明確規(guī)定2016年1月1日起，禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星在養(yǎng)殖業(yè)中使用，但培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星在豬場廢水中仍被廣泛檢出，表明實際生產(chǎn)中對該禁令的執(zhí)行并不理想，大量養(yǎng)殖場仍存在違法使用喹諾酮類抗生素的現(xiàn)象，需加強對畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗生素使用的監(jiān)管。

3 結(jié)論

建立了廢水中5種喹諾酮類抗生素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。5種抗生素在廢水中的回收率為56.72%～101.87%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.67%～9.63%，方法定量限為0.36～3.99 ng/L。方法的準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到抗生素物質(zhì)殘留分析的要求。

對21家豬場廢水的監(jiān)測結(jié)果表明，5種喹諾酮類抗生素在豬場廢水中的檢出率分別為47%(PEF)、91%(CIP)、97%(ENR)，95%(NOR)、84%(OFL)，平均檢出濃度分別為1 392.5(CIP)、1 391.4(PEF)、980.2(ENR)、5 734.5(NOR)、1 390.3(OFL)ng/L。養(yǎng)殖業(yè)禁止使用的培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星均具有較高的檢出頻率和檢出濃度。表明，養(yǎng)豬場在抗生素的規(guī)范使用方面仍存在諸多問題，急需加強監(jiān)管。

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DeterminationofFiveFluoroquinoloneAntibioticsinWastewaterbyHighPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

YAO Qianyu1，2，3, HE Dechun2, GONG Daoxin1, DING Zirong2, ZHAO Bo2, ZHANG Manwen2, LI Yuqing2

1.College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410000, China 2.South China Institute of Environmental Science, MEP, Guangzhou 510000, China 3.The Constructional and Environmental Quality Supervising Station of Original Guangzhou Military Region, Guangzhou 510507, China

X830.2

A

1002-6002(2017)03- 0139- 08

10.19316/j.issn.1002-6002.2017.03.21

2017-01-09;

2017-03-06

環(huán)保公益性行業(yè)科研專項項目(201509038)

姚倩鈺(1993-)，女，山西運城人，學(xué)士，助理工程師。

賀德春