王貽鴻，趙云峰，孔凡玉，王新偉，王振華，張曉陽，彭德元，王 靜*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109；4.湖南省煙草公司張家界市公司，湖南 張家界 427000)

不同pH下胞外多糖和脂多糖對煙草青枯菌根部定殖的影響

王貽鴻1,2，趙云峰3，孔凡玉1，王新偉1，王振華4，張曉陽4，彭德元4，王 靜1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109；4.湖南省煙草公司張家界市公司，湖南 張家界 427000)

通過設(shè)定不同pH梯度，研究煙草青枯菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）和脂多糖（Lipopolysaccride，LPS）分泌量的差異及其對煙草根部吸附青枯菌數(shù)量的影響。結(jié)果表明，pH為 6.5時 EPS單產(chǎn)量和總產(chǎn)量均最大，分別達(dá)到3.27×10-12和50.12×10-2g，pH 8.0時總產(chǎn)量和單產(chǎn)量最小。pH 7.0時，LPS的總產(chǎn)量最大，為9.41×10-3g，pH 7.5時單產(chǎn)量最大，為17.51×10-15g。同一pH梯度的EPS單產(chǎn)量遠(yuǎn)大于LPS單產(chǎn)量。EPS促進(jìn)煙株根部吸附和侵入青枯菌，而LPS起抑制作用，且相同濃度下EPS促進(jìn)作用占主導(dǎo)。當(dāng)pH為6.6時，添加EPS的菌液處理的煙株根表吸附和根內(nèi)侵入青枯菌數(shù)量最大，分別達(dá)到15.43×108和10.73×109cfu/g；堆積在根表的桿狀青枯菌菌體及導(dǎo)管橫切面堵塞的青枯菌及其分泌物的數(shù)量最多，根尖畸形嚴(yán)重。因此，偏酸性條件下，青枯病菌 EPS分泌量增多，促進(jìn)青枯菌與煙草根部的識別和吸附，進(jìn)一步提高病害發(fā)生程度，而中性和偏堿性條件有利于LPS分泌，降低病害發(fā)生。

pH；胞外多糖；脂多糖；煙草青枯菌；定殖

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種毀滅性維管束病害，一直是威脅煙草生產(chǎn)的主要根部病害之一[1]，尤其在我國南方煙區(qū)大面積發(fā)生。影響煙草青枯病發(fā)生的因素很多，其中土壤環(huán)境最為重要，包括如土壤類型、酸堿度、微量元素含量等[2]。近年來，煙草大面積連作、環(huán)境污染、酸性肥料施用等因素導(dǎo)致我國植煙土壤酸化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[3]，加重了土傳病害包括煙草青枯病的發(fā)生，制約煙草產(chǎn)量和質(zhì)量[4]。

青枯菌對寄主根表的吸附和根內(nèi)侵入是其成功侵染的必要條件，EPS和LPS在病原與寄主的識別中發(fā)揮重要作用[5]。青枯菌通?？蓮臒煵莞俊⑶o部或?qū)Ч苁軅课磺秩?，在?dǎo)管中生長時產(chǎn)生大量胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS），EPS阻礙植物體內(nèi)水分的運(yùn)輸，從而引起植物萎蔫[6]。研究表明，EPS能促進(jìn)細(xì)菌在寄主體內(nèi)的擴(kuò)散和定殖，EPSI缺陷突變型細(xì)菌在番茄莖桿內(nèi)移動速度大大降低[7-9]。脂多糖（Lipopolysaccride, LPS）是青枯菌外膜一種多糖，能占據(jù)植物細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，抑制了含EPS細(xì)菌在接種時的吸附識別過程[10]。

目前，尚未見pH對煙株根表吸附和根內(nèi)侵入青枯菌影響的研究報道，因此，本文通過設(shè)定不同pH梯度，研究EPS和LPS對煙株根表吸附及根內(nèi)侵入青枯菌數(shù)量的影響，明確不同pH條件下EPS和LPS與青枯病發(fā)生的關(guān)系，為探明酸性土壤中煙草青枯病菌與根部的識別機(jī)制及改善農(nóng)業(yè)防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為K326（大十字期）。供試菌株：R. solanacearum，分離自湖南張家界市慈利縣江埡鎮(zhèn)煙草病株，經(jīng)鑒定為1號生理小種生物型Ⅲ。供試培養(yǎng)基和試劑：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）及 2,3,5-氯化三苯基四氮培養(yǎng)基（TTC）的制備參照文獻(xiàn)[11]。酸堿緩沖液制備參照文獻(xiàn)[12]。LPS提取試劑盒購自 iNtRON公司。戊二醛、95%乙醇、氯仿、正丁醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pH對青枯菌分泌EPS和LPS的影響 取100 μL濃度為108cfu/mL標(biāo)準(zhǔn)菌液加入到pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。32 h后，各取1 mL培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后涂布于TTC平板計(jì)數(shù)并計(jì)算菌液濃度，公式如下：

細(xì)菌濃度（cfu/mL）=菌落數(shù)(cfu)×稀釋倍數(shù)/涂板菌液量(mL)[13]

同時，各pH處理另取100 mL青枯菌培養(yǎng)液，5000 r/min離心5 min，取上清液用于EPS及LPS的提取。HUSAIN酒精沉淀法[14]結(jié)合SEVAG[15]脫蛋白法提取EPS；WESTERMAN熱酚水法[16]結(jié)合酶解法和醇沉法[17]提取LPS，分別稱量EPS和LPS干質(zhì)量，結(jié)合菌液的濃度計(jì)算各自的單產(chǎn)量和總產(chǎn)量[18]。

1.2.2 不同pH條件下，EPS和LPS對根部吸附識別和侵入青枯菌的影響 采用菌懸液浸根接種的方法進(jìn)行測定。試驗(yàn)共設(shè)5組處理，菌懸液濃度為3×108cfu/mL，處理 1 組為 pH 分別為 5.2、5.9、6.6、7.3的標(biāo)準(zhǔn)菌液中各加濃度為8 mg/mL的EPS；處理2組為上述各pH的標(biāo)準(zhǔn)菌液加入8 mg/mL的LPS；處理 3組為上述各 pH的標(biāo)準(zhǔn)菌液加入 8 mg/mL的EPS和LPS；CK組為上述各pH的標(biāo)準(zhǔn)菌液；CK0組為上述各pH的無菌酸性緩沖液。煙苗幼根經(jīng)表面消毒后，浸入上述各處理的菌液中，并置于晝夜溫度為 32 ℃/30 ℃、濕度 75%的人工氣候室內(nèi)接種培養(yǎng)，每處理15株，3次重復(fù)。分別于接種后1 h、24 h和48 h取樣，每次每處理取1株煙苗的完整須根，截取根尖處長度為2 cm的根于無菌水中充分滌蕩后，取適量含菌液于TTC平板涂板計(jì)數(shù)，即為青枯菌的根表吸附量；取出的根尖再經(jīng)70%酒精表面消毒30 s、無菌水沖洗3次并在無菌狀態(tài)下吹干水分、稱量后研磨，取適量研磨液于TTC平板涂板計(jì)數(shù)，即為青枯菌的根部侵入量。菌量計(jì)算公式如下：

細(xì)菌濃度(cfu/mL)=菌落數(shù)(cfu)×稀釋倍數(shù)/涂板菌液量(mL)

吸附或侵入菌量(cfu/g)=細(xì)菌濃度(cfu/mL)×分離用水量(mL)/根鮮質(zhì)量(g)

1.2.3 根部吸附和侵入青枯菌的掃描電鏡觀察青枯菌根部的接種與取樣方法同1.2.2，取接種24 h的樣品觀察根冠和根冠后區(qū)域（伸長區(qū)和根毛區(qū)）根表吸附青枯菌的數(shù)量和致畸程度，取接種48 h的樣品觀察根尖橫切面導(dǎo)管中青枯菌分泌物量及致畸程度。電鏡樣品處理方法如下：取樣后，將樣品浸泡于 4%的戊二醛溶液中，4 ℃冰箱保存，參照文獻(xiàn)[19-20]的方法對根尖細(xì)胞及根尖橫切面細(xì)胞進(jìn)行掃描電鏡（XL-3, Philips company, Holland）觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，DPS 9.50統(tǒng)計(jì)軟件Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 pH對EPS與LPS產(chǎn)量的影響

由圖1可見，以不同pH條件培養(yǎng)的青枯菌分泌的 EPS單產(chǎn)量和總產(chǎn)量差異較大。振蕩培養(yǎng)至32 h時，pH 6.5的EPS單產(chǎn)量和總產(chǎn)量最大，pH 8.0的單產(chǎn)量和總產(chǎn)量最小，即pH 6.5時EPS單產(chǎn)量和總產(chǎn)量大于pH 7.0的中性條件及pH 7.5、8.0的堿性條件。LPS總產(chǎn)量在 pH 7.0時最大，其次是pH 6.5，再次是pH 7.5的堿性環(huán)境，LPS單產(chǎn)量在pH 7.5時最大，pH 8.0次之，中性和酸性條件下偏小。另外，在試驗(yàn)所設(shè)pH范圍內(nèi)，青枯菌每個菌落形成單位分泌的EPS質(zhì)量遠(yuǎn)大于LPS分泌量，二者之間相差103倍。

2.2 不同pH條件下EPS和LPS對根表吸附和根內(nèi)侵入青枯菌數(shù)量的影響

2.2.1 對煙株根表吸附青枯菌的影響 結(jié)果如表 1所示，接種后 1 h，各處理的根表吸附青枯菌量與CK組相當(dāng)；青枯菌液接種后24 h的根表吸附菌量，pH 6.6最大，其次為pH 7.3，pH 5.9和5.2最低；EPS和LPS對pH 5.9、6.6和7.3處理的根表吸附量分別表現(xiàn)為顯著促進(jìn)和抑制作用，與CK差異顯著，而pH 5.2條件下EPS的促進(jìn)作用和LPS的抑制作用與CK組差異不顯著。除此之外，上述3個pH處理同時加入等濃度的LPS和EPS時，根表吸附量與CK組差異顯著；因此，相對于LPS的抑制作用，EPS對根表吸附量的促進(jìn)作用占主導(dǎo)。無菌酸性緩沖液處理組（CK0）煙苗根表未檢測到青枯菌。

圖1 不同pH值條件下青枯菌EPS與LPS產(chǎn)量Fig. 1 The production of EPS and LPS of R.solanacearum at different pH values

表 1 不同pH條件下EPS與LPS對煙株根表吸附青枯菌量的影響Table 1 Effects of EPS and LPS on the amounts of R. solanacearum adsorbed onto surface of tobacco roots at different pH values 108 cfu/g

2.2.2 對煙株根內(nèi)侵入青枯菌量的影響 結(jié)果如表2所示，接種后第48小時，pH 6.6的青枯菌液CK處理的根內(nèi)侵入菌量最大，其次為pH 7.3，pH 5.9和5.2的侵入量最低，即pH 6.6的根內(nèi)侵入量大于pH 7.3；EPS和LPS對pH 5.9、6.6和7.3三個處理的根內(nèi)侵入量分別表現(xiàn)為顯著的促進(jìn)和抑制作用，與CK差異顯著，而pH 5.2條件下EPS的促進(jìn)作用和LPS的抑制作用與對照組差異不顯著。上述3個pH處理同時加入等濃度的LPS和EPS時，根表吸附量與CK差異顯著，因此，相對于LPS的抑制作用，EPS對根內(nèi)侵入量的促進(jìn)作用占主導(dǎo)。無菌酸性緩沖液處理組煙苗根內(nèi)未檢測到青枯菌。

表2 不同pH條件下EPS與LPS對煙株根內(nèi)青枯菌侵入量的影響Table 2 Effects of EPS and LPS on the amounts of R. solanacearum invading into tobacco roots at different pH 108 cfu/g

2.3 根尖表面吸附青枯菌的掃描電鏡觀察

浸根接種后第 24小時，無菌酸性緩沖液處理的根尖細(xì)胞排列緊密整齊，根冠生長正常（圖2-A1），且根冠后區(qū)域細(xì)胞表面干凈，未見青枯菌分布（圖2-A4）；pH 5.2和6.6的青枯菌液處理的根尖外皮層細(xì)胞被破壞，腫脹、變形、排列混亂，根冠整體膨大畸形（圖2-A2、A3）。青枯菌液處理根冠后區(qū)域表面吸附的青枯菌量，pH 6.6時最大（圖2-B3），其次是pH 7.3的堿性條件（圖2-B4），再次為pH 5.9（圖2-B2），pH 5.2時最?。▓D2-B1）。與CK處理比較，外加EPS的各處理根尖表皮細(xì)胞分布的青枯菌數(shù)量更多，且表皮細(xì)胞排列混亂、根組織被破壞程度加重。同樣是外加EPS的處理，pH 6.6條件下的根冠后區(qū)域吸附菌量（圖2-C3）明顯高于其他3個pH處理，其次為pH 7.3（圖2-C4)，略大于pH 5.9（圖2-C2）及pH5.2（圖2-C1）；而外加LPS的各pH菌懸液處理的根表吸附菌量及表皮細(xì)胞的破壞程度（圖2-D1、D2、D3、D4）低于CK處理。

2.4 根尖橫切面的掃描電鏡觀察

浸根接種后48 h，無菌酸性緩沖液處理的根尖橫切面維管束細(xì)胞（包括木質(zhì)部細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞）間脈絡(luò)清晰、形狀規(guī)則，排列整齊（圖 3-A1），然而不同pH青枯菌液各處理的根組織均有細(xì)菌定殖，細(xì)菌主要堆積于維管束，且維管束細(xì)胞遭到不同程度的破壞（圖3-B1，2，3，4)，其中，pH 6.6處理橫切面有大量青枯菌和其分泌的白色胞外混和物堆積在維管束內(nèi)并破壞組織細(xì)胞，導(dǎo)致該部位畸形嚴(yán)重（圖3-B3），且pH 6.6處理的維管束分布的白色物質(zhì)數(shù)量多于其他幾個pH的菌液處理。

圖2 煙株根表吸附青枯菌的掃描電鏡觀察Fig. 2 Observation on the adsorption of R.solanacearum onto tobacco roots surface by scanning electron microscopy

與不同pH菌懸液處理比較，加EPS處理的各根尖橫切面，有更多的菌體及其分泌混和物堆積于維管束內(nèi)，其堵塞程度及對細(xì)胞的破壞程度更強(qiáng)（圖3-C1、C2、C3、C4），且pH 6.6處理的細(xì)胞間散布的菌體混和物及其對組織的畸形程度最大（圖3-C3）；而加LPS的各pH處理的根尖橫切面白色物質(zhì)數(shù)量及對細(xì)胞的破壞程度（圖3-D1、D2、D3、D4）明顯低于青枯菌液處理。

3 討 論

目前研究表明，土壤酸化與煙草青枯病的發(fā)生密切相關(guān)。EPS和LPS作為主要識別子在青枯菌與寄主吸附識別中發(fā)揮重要作用[21]。LPS作為一種膜外多糖，容易被寄主植物識別，從而引起較強(qiáng)的防衛(wèi)反應(yīng)[22]。EPS能保護(hù)青枯菌免受寄主植物的抗病防御[23]，保護(hù)鞭毛和LPS免受寄主的識別與攻擊[24]，從而促進(jìn)了青枯菌與煙株根表細(xì)胞的吸附識別。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，pH 6.0、6.5時單個青枯菌分泌的EPS量高于pH 7.0的中性和pH 7.5、8.0的堿性條件，從而促進(jìn)病原與寄主的吸附識別，加重青枯病的發(fā)生；pH 7.0的中性和pH 7.5堿性條件下，LPS單產(chǎn)量與總產(chǎn)量高于酸性條件，其對吸附識別過程的抑制作用較強(qiáng)，而pH 8.0時青枯菌的數(shù)量最少，LPS總產(chǎn)量最低，單產(chǎn)量僅次于pH 7.5；因此，土壤環(huán)境的酸堿度可以通過作用于EPS和LPS識別子的分泌量來影響吸附識別過程進(jìn)而控制青枯病的發(fā)生程度。

圖3 煙株根尖橫切面維管束細(xì)胞的掃描電鏡觀察Fig. 3 Observation on the transverse section of vascular cells in tobacco root tips with scanning electron microscopy

通過試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，EPS促進(jìn)青枯菌在煙株根部的吸附和侵入，而LPS則表現(xiàn)為一定程度的抑制作用，與王勝坤等[25]研究結(jié)果基本一致，說明EPS和LPS對青枯菌在桉樹和煙草根部定殖過程的作用是相同的。本研究同時還測定了不同pH條件EPS和LPS對煙株根表吸附和根內(nèi)侵入青枯菌數(shù)量的影響，掃描電鏡觀察顯示，接種24 h時，根表吸附的青枯菌對根組織已經(jīng)造成嚴(yán)重的破壞，根冠后區(qū)域腫脹變形；接種48 h時，根內(nèi)侵入的青枯菌迅速繁殖并堆積于維管束，維管束壁細(xì)胞破裂，堵塞導(dǎo)管，從而堵塞發(fā)達(dá)的疏導(dǎo)系統(tǒng)，影響水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸，造成煙株萎蔫。等濃度的EPS和LPS菌液處理中，EPS的促進(jìn)作用占主導(dǎo)，再加上同條件下EPS單產(chǎn)量遠(yuǎn)大于LPS單產(chǎn)量，EPS對煙株根表吸附及根內(nèi)侵入的促進(jìn)作用在吸附識別中發(fā)揮主要作用。因此，不同pH條件EPS及LPS分泌量及其在吸附識別中的作用是影響煙草青枯病發(fā)生的重要原因之一，為揭示酸性土壤中煙草青枯菌與根部的識別機(jī)制以及改善農(nóng)業(yè)防控措施提供理論依據(jù)。

研究表明[26]，pH 6.5的酸性土壤適宜煙草生長。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 6.6的酸性條件下，煙草青枯菌分泌的EPS單產(chǎn)量和總產(chǎn)量均最大，煙株根表識別吸附青枯菌量最大，根尖及根冠后區(qū)域細(xì)胞破損程度和對煙株維管束的阻塞程度最嚴(yán)重，最有利于青枯病發(fā)病。適宜青枯病發(fā)病的pH條件恰與煙草宜生長的土壤pH條件接近，使得通過調(diào)節(jié)土壤pH的方法降低青枯病發(fā)病率的可行性降低。而土壤中微生物群落對煙株根表識別吸附青枯菌量存在一定影響，因此在生產(chǎn)中有可能通過增施耐酸性有益菌來提高土壤微生物活性、篩選耐酸拮抗菌等防治酸性土壤中煙草青枯病的發(fā)生[27]。

另外值得注意的是，對湖南張家界市慈利縣煙區(qū)100份病株根際土樣pH進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，pH 6.0～6.6范圍內(nèi)的土樣數(shù)量的百分比為52%，而pH＜6.0的土樣的百分比為38%，此pH范圍并不適宜青枯菌的生長，分析其導(dǎo)致青枯病發(fā)生的原因，其一可能是pH較低的土壤的煙株自身抗病能力減弱[28]，其二可能是根際微生物菌群結(jié)構(gòu)與豐度變差，有益微生物減少，微生物群落間相互抑制的作用小[29]，使得青枯菌能長期生存并在較小的濃度下持續(xù)侵染，因此應(yīng)進(jìn)一步圍繞酸性土壤中煙株的抗病能力及其微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性開展相關(guān)研究。

4 結(jié) 論

pH與煙草根部吸附和侵入青枯菌過程密切相關(guān)。青枯菌的EPS在酸性條件下分泌旺盛，LPS在中性和堿性條件下分泌旺盛，但EPS分泌量遠(yuǎn)大于LPS分泌量。EPS促進(jìn)青枯菌在煙草根部吸附和侵入，促進(jìn)青枯菌對根表皮細(xì)胞及導(dǎo)管細(xì)胞的致畸程度，LPS抑制青枯菌在根部的吸附和侵入。與LPS的抑制作用相比，EPS的促進(jìn)作用占主導(dǎo)，且在pH 6.6時促進(jìn)作用最明顯。pH 7.0的中性和pH 7.5的堿性條件下，不利于青枯病發(fā)生。

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Effect of Exopolysaccharides and Lipopolysaccride on Colonization of Tobacco Roots by Ralstonia solanacearum at Different pH Values

WANG Yihong1,2, ZHAO Yunfeng3, KONG Fanyu1,WANG Xinwei1, WANG Zhenhua4, ZHANG Xiaoyang4,PENG Deyuan4, WANG Jing1*
(1. Tobacco Research Institute, CAAS, Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring Controlling & Integrated Management, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;4. Zhangjiajie Company of Hunan Tobacco Company, Zhangjiajie, Hunan 427000, China)

In this study, the difference of the secretion of exopolysaccharides and lipopolysaccharide of R.solanacearum and their effects on the number of R. solanacearum adsorbed in tobacco roots were studied at different pH values. The results showed that the maximum single and total yield of EPS were 3.27×10-12and 50.12×10-2g at pH 6.5, respectively. While the minimum single and total yield of EPS were at pH 8.0. The maximum total yield of LPS was 9.41×10-3g at pH 7.0, and the maximum single yield was 17.51×10-15g at pH 7.5; In addition, the single yield of EPS was much higher than LPS at the same pH value. EPS had a promotive effect on the adsorption and invasion of R.solanacearum in tobacco roots, while LPS had a suppressive effect, and the promotive effect of EPS played a major role at the same concentration. When added EPS under the pH6.6, the number of R.solanacearum adsorbed and invaded in the root surface were the maximum, reaching 15.43×108and 10.73×109cfu/g mf (fresh matter) respectively,and the bacterial number of R.solanacearum deposited on the root surface and clogged in the cross section with its secretion were the most, and root tip deformitied seriously. Therefore, EPS secretion was increased under acidic conditions, which promoted the identification and adsorption of R.solanacearum on tobacco roots, and the degree of disease occurrence was further improved. LPS secretion was increased under neutral and alkaline conditions, which reduced disease occurrence.

pH; EPS; LPS; Ralstonia solanacearum; colonization

S435.72

1007-5119（2017）05-0024-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.005

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC04）；湖南省煙草公司張家界市公司科技項(xiàng)目“張家界煙區(qū)重要土傳病害發(fā)生的微生態(tài)基礎(chǔ)與調(diào)控技術(shù)研究”（201503）；四川省煙草公司科技項(xiàng)目“煙草主要病蟲害綠色防控技術(shù)研究與應(yīng)用”（SCYC201604）

王貽鴻（1990-），男，在讀碩士，研究方向?yàn)闊煵莶『Ψ乐巍-mail：wyhbeyond666@163.com。*通信作者，E-mail：wjing323@163.com

2016-12-13

2017-05-10