任敏華，張靜燕，崔曉東，陳榮華，劉瓊光,3

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 贛州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江西 贛州 341000；3 廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum俗稱青枯菌，是危害嚴(yán)重的世界性植物病原細(xì)菌[1]，廣泛分布于熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)，寄主范圍極廣[2]。青枯菌侵染番茄引起的番茄青枯病，在我國(guó)南方番茄產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重[3-4]。

青枯菌具有高度變異性及適應(yīng)性，菌系分化明顯，不同菌株間基因組變異性較強(qiáng)。明確不同來源青枯菌的致病力分化，探索青枯菌的種內(nèi)遺傳多樣性，具有重要意義。關(guān)于青枯菌的種下分類，Hayward等[5]、華靜月等[6]根據(jù)3種雙糖和3種己醇的利用能力不同，劃分出5個(gè)生化變種或生化型。Prior等[7]根據(jù)地理起源的密切相關(guān)性，將青枯菌分為4個(gè)演化型，即亞洲分支演化型(Ⅰ)、美洲分支演化型(Ⅱ)、非洲分支演化型(Ⅲ)和印度尼西亞分支演化型(Ⅳ)，而在演化型內(nèi)根據(jù)內(nèi)切葡聚糖酶(Endoglucanase)基因egl序列的差異，又細(xì)分為多個(gè)序列變種(Sequevar)。目前，國(guó)際上已經(jīng)鑒定出51個(gè)序列變種，來自中國(guó)的青枯菌屬于演化型Ⅰ和Ⅱ，以及 1、12、13、14、15、16、17、18、34、44和48等11個(gè)序列變種[8]。盡管我國(guó)有些省份對(duì)番茄青枯病菌有研究報(bào)道[9]，但來自江西省的番茄青枯菌菌系研究較少。

近年來，在江西省贛南地區(qū)種植番茄、辣椒和茄子等茄科蔬菜面積擴(kuò)大，發(fā)展態(tài)勢(shì)迅猛，然而，由于青枯病的嚴(yán)重危害，給當(dāng)?shù)厥卟松a(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，番茄青枯病的防治尚無有效的防治藥劑，雖然有研究表明選擇合適的噬菌體或噬菌體組合對(duì)作物青枯病具有較好的防治作用[10-12]，但其應(yīng)用仍受到許多限制。選育抗病或耐病品種是青枯病防治最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但由于青枯菌菌系分化明顯，且與寄主、環(huán)境之間構(gòu)成復(fù)雜的互作關(guān)系，使得生產(chǎn)上推廣的抗病品種往往隨著種植年限的延長(zhǎng)、青枯菌菌系致病力的變化，導(dǎo)致品種的抗性喪失[13-15]，因此，抗病育種工作任務(wù)艱巨。分離贛南地區(qū)的番茄青枯菌菌株，建立該地區(qū)青枯菌資源庫，明確青枯菌的生化變種、致病力、序列變種以及對(duì)噬菌體的敏感性，將有助于解析青枯病的發(fā)生流行機(jī)理、指導(dǎo)番茄抗青枯病育種和制定相關(guān)的病害防治措施。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基及噬菌體

固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g·L-1，酵母膏 3 g·L-1，蛋白胨 3 g·L-1，硫酸鎂 0.25 g·L-1，磷酸氫二鉀 2 g·L-1，磷酸二氫鉀 0.5 g·L-1，蔗糖 15 g·L-1，瓊脂粉 18 g·L-1。

半固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g·L-1，酵母膏 3 g·L-1，蛋白胨 3 g·L-1，硫酸鎂 0.25 g·L-1，磷酸氫二鉀 2 g·L-1，磷酸二氫鉀 0.5 g·L-1，蔗糖 15 g·L-1，瓊脂粉 8 g·L-1。

LB 液體培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，胰蛋白胨 10 g·L-1。

生化變種鑒定基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨 1.0 g·L-1，磷酸二氫胺 1.0 g·L-1，氯化鉀 0.2 g·L-1，七水硫酸鎂0.2 g·L-1，溴百里酚藍(lán)指示劑 3.0 ml·L-1，pH 調(diào)至 7.0。

2，3，5 -三苯基氯化四氮唑(TTC)培養(yǎng)基：水解干酪素 1 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，甘油 5 mL·L-1，瓊脂粉 32 g·L-1，使用前，每 1 L 培養(yǎng)基加 5 mL 質(zhì)量濃度為 10 g·L-1的 TTC 溶液。

牛肉膏蛋白胨(NA)液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g·L-1，葡萄糖 10 g·L-1，蛋白胨 5 g·L-1，酵母粉 0.5 g·L-1，pH調(diào)至7.0。

供試噬菌體：編號(hào)分別為P1556-1、P1556-2、P7-1、P574、P1521、P1555-L、P1555-1 和 P1555-M，分離自江西、廣東等地作物青枯病土壤，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細(xì)菌研究室提供并保存。

1.2 青枯菌的分離純化與保存

2019—2020年，在番茄青枯病發(fā)病高峰期間，前往江西省贛南地區(qū)各市、縣區(qū)采集番茄青枯病標(biāo)本，用TTC選擇性培養(yǎng)基分離青枯菌，30 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，挑取青枯菌典型單菌落，在TTC平板上劃線純化，繼代3次，獲得純化菌株。用青枯菌特異性引物759(5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′)和 760(5′-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3′)[7]進(jìn)行PCR鑒定，將擴(kuò)增得到280 bp特異目的片段的青枯菌菌株，-80 ℃甘油保存。同時(shí)，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取各菌株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 青枯菌生化變種測(cè)定

參照Hayward等[5]、華靜月等[6]方法。分別將乳糖、甘露醇、山梨醇和甜醇加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，質(zhì)量濃度均為 10 g·L-1，分裝試管，每管 4～5 mL，110 ℃條件下滅菌20 min。纖維二糖和麥芽糖經(jīng)過濾滅菌后，分別加入滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，質(zhì)量濃度為10 g·L-1。每個(gè)菌株每種化合物接種3支試管，以不接種青枯菌為對(duì)照，28 ℃條件下培養(yǎng)21 d。

1.4 青枯菌致病性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

參照何自福等[16]的方法，選擇對(duì)青枯病表現(xiàn)不同抗性的5個(gè)番茄品種，分別為紅圣佳二號(hào)(抗病)、金艷 (中抗)、多寶 (中抗)、粉霸 (感病)和精棚T紅(高感)，作為致病性分化的鑒別品種。將健康番茄種子播于穴盤消毒基質(zhì)中，待4～5片葉苗齡時(shí)用于接種。采用浸根接種方法，將番茄根部浸于1×108CFU·mL-1青枯菌懸液中，15 min 后移栽到盆缽中，每盆種2株，以浸無菌水的植株為空白對(duì)照，每個(gè)菌株接種每個(gè)番茄品種20株，定期記錄發(fā)病情況，接種后第45天，各處理病情穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。采用離差平均和的系統(tǒng)聚類方法(即Ward聚類)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

1.5 egl基因擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

內(nèi)源葡聚糖酶基因(egl基因)擴(kuò)增引物：Endo-F(5′-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3′)和 Endo-R(5′-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3′)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：96 ℃ 預(yù)變性 9 min；95 ℃ 變性 1 min，70 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物交由睿博興科生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，并與相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)(參考序列信息見表1)。用Clustalx和MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Jukes and Cantor模型鄰接法 (Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次重復(fù)Bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)后構(gòu)建發(fā)育樹。

表1 參考序列信息Table 1 Referenced sequence information

續(xù)表1 Continued table 1

1.6 噬菌體敏感性測(cè)定

噬菌體培養(yǎng)：在15 mL的LB液體培養(yǎng)基中，將青枯菌與噬菌體按照體積比1∶1混勻，在30 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)過夜。

雙層平板制備：取青枯菌菌液100 μL加入15 mL、50 ℃的半固體培養(yǎng)基，迅速混勻倒入固體培養(yǎng)基平板上，制成雙層平板，點(diǎn)接 3 μL 噬菌體液，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察噬菌斑產(chǎn)生情況。根據(jù)青枯菌被侵染的噬菌體數(shù)量(n/個(gè))判別青枯菌對(duì)噬菌體的敏感性，標(biāo)準(zhǔn)：n≤2，敏感性弱；3≤n≤5，敏感性中等；6≤n≤7，敏感性強(qiáng)；n≥8，敏感性特強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯菌的分離純化

2019—2020年，在江西省贛南地區(qū)各市、縣番茄種植地均有青枯病發(fā)生，采集自于都、上猶、石城、瑞金等9個(gè)縣(市)的番茄青枯病病株中，共分離和鑒定出44個(gè)青枯菌株，其中于都縣9個(gè)，上猶縣7個(gè)，石城縣4個(gè)，瑞金市2個(gè)，大余縣3個(gè)，安遠(yuǎn)縣3個(gè)，會(huì)昌縣6個(gè)，興國(guó)縣2個(gè)，全南縣8個(gè)。

2.2 青枯菌的生化變種鑒定

根據(jù)對(duì)6種碳水化合物的利用情況(表2)，44個(gè)番茄青枯菌可劃分為生化變種Ⅲ和Ⅳ，其中，來自大余縣的3個(gè)青枯菌菌株為生化變種Ⅳ，其余的41個(gè)青枯菌均為生化變種Ⅲ，表明贛南地區(qū)番茄青枯菌以生化變種Ⅲ為主。

表2 青枯菌生化變種鑒定1)Table 2 Biovar identification of Ralstonia solanacearum

2.3 青枯菌的致病力測(cè)定

青枯菌接種紅圣佳二號(hào)(抗病)、金艷(中抗)、多寶(中抗)、粉霸(感病)、精棚T紅(高感)5個(gè)抗性程度不同的番茄品種，結(jié)果表明，44個(gè)菌株在不同的番茄品種上的致病力存在明顯差異(表3)。

表3 44個(gè)青枯菌接種5個(gè)番茄品種的發(fā)病率及聚類分組Table 3 Incidence of 44 Ralstonia solanacearum strains inoculated to five tomato cultivars and their clustering results

采用系統(tǒng)聚類中的離差平均和的聚類方法(即Ward聚類)，對(duì)44個(gè)菌株接種5個(gè)番茄品種的青枯病發(fā)病率結(jié)果進(jìn)行聚類分析，明確青枯菌之間的致病力差異。采用離差平均和方法，樣本間的距離采用歐氏距離，該距離數(shù)值的大小反映樣本之間的相似度，數(shù)值越小，2個(gè)樣本之間的相似度越高，數(shù)值越大，則相似度越低。本研究以歐氏距離1.2為參考標(biāo)準(zhǔn)，將44個(gè)青枯菌聚為3個(gè)組(圖1)。第Ⅰ組共有29個(gè)菌株，分別來自除大余縣外的8個(gè)縣(市)；第Ⅱ組的7個(gè)菌株分離自于都、上猶、石城、會(huì)昌4個(gè)縣，該組致病力為中等強(qiáng)度；第Ⅲ組的8個(gè)菌株分離自于都、上猶、石城、大余、安遠(yuǎn)5個(gè)縣，致病力弱，其中來自上猶縣的Tm1919致病力最弱。上述結(jié)果表明，贛南地區(qū)番茄青枯菌致病力分化現(xiàn)象明顯，在于都、上猶和石城縣均存在致病力強(qiáng)、中、弱3種類型的菌株，但總體來看，贛南地區(qū)番茄青枯菌以致病較強(qiáng)的菌株占優(yōu)勢(shì)。

圖1 基于44個(gè)青枯菌接種5個(gè)番茄品種發(fā)病率的聚類分析結(jié)果Fig. 1 Clustering results based on the incidence of 44 Ralstonia solanacearum strains inoculated to five tomato cultivars

2.4 青枯菌序列變種及系統(tǒng)發(fā)育分析

44個(gè)青枯菌的egl基因片段序列與標(biāo)準(zhǔn)參考菌株進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，江西省贛南地區(qū)的番茄青枯菌屬于亞洲分支、演化型I(PhylotypeⅠ)的8個(gè)序列變種(Sequevar)。其中Tm1929、Tm1935和Tm1937與馬鈴薯青枯菌JT523(留尼汪島)屬于 Sequevar 13；Tm1908、Tm1920、Tm1923、Tm1924、Tm1930、Tm1931、Tm1933、Tm1934、Tm1940～Tm1943、Tm2046、Tm2054共14個(gè)菌株與來自中國(guó)的番茄青枯菌PSS8 屬于 Sequevar 14；Tm1925、Tm1928、Tm1932、Tm2055和Tm2058與來自中國(guó)的番茄青枯菌PSS358 屬于 Sequevar 15；Tm1913～Tm1919、Tm2047共8個(gè)菌株與來自中國(guó)的花生青枯菌P11 屬于 Sequevar 17；Tm1901～Tm1904、Tm1907、Tm1926、Tm1938、Tm1939共8個(gè)菌株與來自法國(guó)的番茄青枯菌GMI1000均為Sequevar 18；Tm1944與來自中國(guó)臺(tái)灣的番茄青枯菌PSS219為Sequevar 34；Tm1936與來自中國(guó)的煙草青枯菌Tb28為Sequevar 44；Tm1945、Tm2048～Tm2050 共 4 個(gè)菌株與來自中國(guó)的桑青枯菌M2同為Sequevar 48。

2.5 青枯菌序列變種(Sequevar)的地理分布

在所分離的44個(gè)番茄青枯菌中，Sequevar 14共有14個(gè)菌株，分布于于都、瑞金、大余、會(huì)昌、興國(guó)、全南 6 個(gè)縣 (市)；Sequevar 18 有 8 個(gè)菌株，分布于會(huì)昌、石城、于都3個(gè)縣；Sequevar 17有8個(gè)菌株，其中7個(gè)分布于上猶縣，1個(gè)來自興國(guó)縣；Sequevar 15有5個(gè)菌株，來自于石城、大余、全南3個(gè)縣；Sequevar 48的4個(gè)菌株，全部來自全南縣；Sequevar 13有3個(gè)菌株，分布于石城和安遠(yuǎn)縣；Sequevar 34 和 Sequevar 44 各有 1 個(gè)菌株，分別來自全南和安遠(yuǎn)縣。上述結(jié)果表明，贛南地區(qū)番茄青枯菌序列變種存在豐富的多樣性。

2.6 青枯菌對(duì)噬菌體的敏感性測(cè)定

雙層平板法檢測(cè)8個(gè)噬菌體裂解青枯菌的試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，44個(gè)番茄青枯菌中，只有菌株Tm2047對(duì)噬菌體的敏感性弱，有12個(gè)菌株對(duì)噬菌體的敏感性表現(xiàn)為中等，有4個(gè)菌株對(duì)噬菌體的敏感性較強(qiáng)，另有27個(gè)菌株都能被8個(gè)噬菌體裂解，其敏感性表現(xiàn)為特強(qiáng)。上述結(jié)果表明，贛南地區(qū)番茄青枯菌對(duì)噬菌體普遍表現(xiàn)敏感。

3 討論與結(jié)論

不同地理來源的青枯菌在與寄主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過程中，演化出明顯的生理分化型或菌系多樣性。國(guó)外報(bào)道，番茄青枯菌屬于1號(hào)生理小種，分為演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[17-18]，生化變種Ⅰ、II、III和IV[19-20]，存在 Sequevar 1、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、18、20、29、31、35、41、38、39、46、52 等 22 個(gè)序列變種[21-23]。在我國(guó)，已報(bào)道的番茄青枯菌屬于1號(hào)生理小種、演化型Ⅰ，分為生化變種II、III和IV，存在 Sequevar13、14、15、16、17、18、34、44、48和54等10個(gè)序列變種[24-25]。曾憲銘等[26]曾測(cè)定廣東省13種農(nóng)作物上的129個(gè)青枯菌，其生化變種鑒定為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及其亞型，其中番茄青枯菌為生化變種Ⅲ和Ⅳ，鄭向華等[27]也獲得類似的研究結(jié)果，將番茄青枯菌鑒定為生化變種Ⅲ。2009年，Xu等[28]基于演化型分類框架，對(duì)來自我國(guó)13個(gè)省、17種不同寄主植物上的286株青枯菌進(jìn)行多樣性分析，明確了我國(guó)青枯病菌具有豐富的遺傳多樣性，其中番茄青枯菌屬于演化型Ⅰ，并有Sequevar 13、14、15、16、17、18、44等 7個(gè)序列變種。2011年，Xue等[24]分析了我國(guó)15個(gè)省、14種寄主植物上的319株青枯菌，基于PCR指紋圖譜及演化型框架，將其中的番茄青枯菌鑒定為演化型Ⅰ，存在 Sequevar 13、14、15、17、18、34、44、48 等 8 個(gè)序列變種。

本研究對(duì)江西省贛南地區(qū)的番茄青枯菌進(jìn)行了分離和菌系分析，結(jié)果顯示，在分離鑒定出的44個(gè)青枯菌中，有41個(gè)菌株為生化變種Ⅲ(占93.2%)，另有3個(gè)菌株屬于生化變種IV，不存在生化變種I和II，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的番茄青枯菌生化變種結(jié)果基本相似。盡管我國(guó)的番茄青枯菌均屬于1號(hào)生理小種，但菌株之間致病力存在差異。本研究通過接種試驗(yàn)，根據(jù)在5個(gè)不同青枯病抗性的番茄品種上的發(fā)病情況，將來自贛南地區(qū)的番茄青枯菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3個(gè)致病類型，而且致病力較強(qiáng)的菌株占65.91%，15.91%的菌株致病力中等，18.18%的菌株致病力較弱，可見，贛南地區(qū)番茄青枯菌的致病力存在明顯差異，而且致病力較強(qiáng)的菌株是本地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌群，這將為贛南地區(qū)的番茄抗青枯病育種工作提供指導(dǎo)。演化型和egl基因序列分析結(jié)果表明，44個(gè)番茄青枯菌株均屬于演化型I，符合亞洲起源的演化型Ⅰ分類框架[7]，進(jìn)一步研究顯示，贛南地區(qū)番茄青枯菌存在8個(gè)序列變種，分別為 Sequevar 13、14、15、17、18、34、44 和 48，未發(fā)現(xiàn) Sequevar 16，其中 Sequevar 14(占 31.8%)在本地區(qū)的番茄主要種植地區(qū)均有分布，表明贛南地區(qū)番茄青枯菌存在豐富的遺傳多樣性。

噬菌體是侵染細(xì)菌的病毒，具有高度的特異性及快速裂解宿主(寄主)的能力，可用于植物細(xì)菌病害的防治[29-31]。有研究表明，通過使用噬菌體組合的方法，能夠顯著降低青枯菌數(shù)量，對(duì)番茄青枯病具有較好的防治效果[32]。而測(cè)定青枯菌對(duì)噬菌體的敏感性，可為利用噬菌體防治植物青枯病提供參考。本研究結(jié)果表明，在44個(gè)青枯菌中，有61.36%的青枯菌對(duì)供試的8個(gè)噬菌體敏感，即都能被8個(gè)噬菌體裂解，表明贛南地區(qū)番茄青枯菌對(duì)噬菌體普遍表現(xiàn)敏感。然而，仍有12個(gè)菌株對(duì)8個(gè)噬菌體的綜合敏感性表現(xiàn)為中等，而Tm2047菌株對(duì)噬菌體不敏感。由此可見，生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)本地區(qū)青枯菌菌系的多樣性及對(duì)噬菌體的敏感性，有選擇性地進(jìn)行噬菌體組合，以減輕番茄青枯病的發(fā)生危害。