謝佳 馬曉航 代嫣然 吳娟 向東方 成水平

（同濟大學長江水環(huán)境教育部重點實驗室，上海 200092）

有機質(zhì)對城市濕地微生物豐度的影響

謝佳 馬曉航 代嫣然 吳娟 向東方 成水平

（同濟大學長江水環(huán)境教育部重點實驗室，上海 200092）

城市濕地不僅面臨著外源有機質(zhì)負荷不斷增加的問題，而且濕地表層土壤的有機質(zhì)在城市建設過程中會被破壞。通過外加樟樹樹葉浸出液，利用實時熒光定量PCR技術，模擬研究了外源有機質(zhì)增加對濕地土壤表層微生物豐度影響。結(jié)果表明，土壤結(jié)構(gòu)的改變顯著影響細菌、古菌及氮循環(huán)各環(huán)節(jié)功能基因的豐度。土壤有機質(zhì)含量下降，細菌及氮循環(huán)相關功能基因的豐度都顯著降低（P＜0.05）。同時提高上覆水中的外源氮和DOM含量會顯著促進濕地微生物以及氮功能基因豐度的增加。外加DOM會顯著影響NO2--N向N2O、NO的轉(zhuǎn)化過程的兩個基因。

城市濕地；有機質(zhì)；實時熒光定量PCR；微生物豐度

城市濕地有機質(zhì)的研究多分為兩個方面：沉積物有機質(zhì)和水體中溶解性有機質(zhì)（DOM）。土壤/沉積物中的有機質(zhì)和水中的有機質(zhì)是濕地中有機質(zhì)的聯(lián)合體，二者相互轉(zhuǎn)化，共同作用于濕地環(huán)境，影響濕地生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能。因此，有必要將土壤有機質(zhì)和水體有機質(zhì)共同考慮。濕地中土壤和水體界面是氮循環(huán)的重要場所，氮循環(huán)也受到各種理化環(huán)境的影響，因此通過探究表層土壤中氮循環(huán)相關功能基因?qū)τ袡C質(zhì)的響應及分布特征，可以幫助我們了解氮元素在濕地中遷移轉(zhuǎn)化的微生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 模擬濕地裝置示意圖

實驗設計 構(gòu)建了小型模擬系統(tǒng)— —PVC板制成的頂部開口的水箱（長×寬×高=400 mm×400 mm×600 mm）。水箱底部填25 cm厚的濕地土壤，加25 cm深的上覆水，每個系統(tǒng)中種植10株挺水植物蘆葦（Phragmites australis）。裝置圖見圖1。

實驗設置6個處理組，每組3個平行，各實驗處理組控制條件，見表1。

表1 實驗處理組設置

A和B兩種土壤，均采自上海市江灣濕地，土壤A是濕地內(nèi)部河道的水岸交錯帶土壤，土壤B是在周邊開發(fā)建設過程中受到破壞（表層土壤有被鏟車清表）的濕地土壤。土壤A中總磷（TP）、總氮（TN）、有機質(zhì)（OM）初始濃度分別為4.17±0.05、1.19±0.01、24.3±0.02 g/kg干重，土壤 B 中總磷（TP）、總氮（TN）、有機質(zhì)（OM）初始濃度分別為1.13±0.02、0.57±0.01、13.7±0.04 g/kg干重。

系統(tǒng)中的上覆水取自流經(jīng)同濟大學校園景觀河道，上覆水中TP、可溶性活性磷（SRP）、TN、氨氮（）、硝氮（N）、亞硝氮（）、溶解性有機碳（DOC）初始濃度分別為0.055±0.001、0.035±0.001、1.11±0.11、0.54±0.01、0.36±0.06、0.069±0.001、7.09±0.51 mg/L，即為低濃度處理組。高濃度處理組即在采集的景觀河道水中添加氯化銨、磷酸二氫鉀及制備的樟樹樹葉浸出液控制上覆水中TN、TP、DOC濃度為10 mg/L、0.5 mg/L和30 mg/L左右。

蘆葦采自江灣濕地，預培養(yǎng)4周后，選取大小一致的健壯植株種植在各實驗裝置中，每個實驗裝置種植10棵（密度62.5株/m2）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及保存 實驗末期上覆水放空后，按照梅花布點法采集5個點位的0-5 cm表層土壤，剔除植物根系后將每個裝置的樣品混合均勻后放于密封袋中，置于-25℃下冷凍保存待測。

1.2.2 土壤有機質(zhì)的分析 使用光度法［14］測定土壤有機質(zhì)含量，分析儀器為UV-2800紫外分光光度計。

1.2.3 微生物的提取及分析 采用 OMEGA泥樣基因組提取試劑盒（D5625-01 Soil DNA Kit）進行基因組DNA提取與純化。通過1%瓊脂凝膠電泳檢測提取基因組DNA，并儲存置于-25℃下冷凍保存。

后續(xù)引物設計及實時熒光定量PCR的工作交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。本次檢測所使用的目的基因引物信息見表2，并稀釋到10 μmol/L的濃度。對細菌的16S rRNA 基因、古菌的16S rRNA 基因、厭氧氨氧化菌的16S rRNA 基因，和以下功能基因的靶片段氨單氧化酶基因（amoA）、亞硝酸鹽氧化還原酶基因（nxrA）、與膜結(jié)合的硝酸還原酶基因（narG）、含銅亞硝酸鹽還原酶基因（nirK）、含細胞色素cd1亞硝酸鹽還原酶基因（nirS）、一氧化二氮還原酶基因（nosZ）進行定量分析［15］。

表2 目的基因引物［16-21］

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2013，數(shù)據(jù)取3組平行數(shù)據(jù)的平均值。各數(shù)據(jù)圖的繪制采用Origin Pro 8.0，數(shù)據(jù)協(xié)方差分析采用SPSS 19.0，運用單因素方差分析，選取不同處理組為因素，考察6個實驗處理組植物各項指標在0.05水平上是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 濕地土壤理化參數(shù)

表3為實驗末期不同實驗組土壤ORP隨深度變化的數(shù)據(jù)，各處理組土壤ORP值都隨著深度增加而降低。土壤A（W1、W2）ORP顯著低于土壤B（W3-W6）（P＜0.05）。W1、W2兩個處理組在垂向上的差異則沒有顯著性（P＞0.05），W3-W6四個處理組土壤ORP垂向上的差異具有顯著性（P＜0.05）。

圖2是各處理組土壤有機質(zhì)的含量，由圖2可知實驗末期各處理組土壤表層有機質(zhì)含量相較于原土壤都有所升高。土壤A處理組有機質(zhì)含量顯著高于土壤B處理組（P＜0.05）；添加外源DOM的W1和W3兩個處理組土壤表層有機質(zhì)含量有顯著的升高（P＜0.05）。

2.2 微生物豐度

2.2.1 細菌、古菌的基因豐度 圖3是各處理組表層土壤中細菌和古菌16S rRNA 基因的豐度。土壤A處理組（W1、W2）細菌豐度顯著高于土壤B處理組（W5、W6）（P＜0.05），添加外源氮、磷的 W3、W4與W5、W6并未發(fā)現(xiàn)顯著性的變化（P＞0.05），外源DOM的添加使得W1、W3、W5三個處理組細菌豐度要分別高于W2、W4、W6，上覆水中有機質(zhì)的增加提高了表層土壤中供微生物生長的碳源。古菌的豐度要低于細菌，但同細菌類似，土壤A處理組中豐度更高。添加外源DOM的W3古菌豐度顯著高于 W4（P＜0.05）。

表3 各處理組土壤不同深度處ORP及顯著性分析結(jié)果*

圖2 各處理組土壤表層有機質(zhì)含量的變化

圖3 各處理組表層土壤細菌（A）、古菌（B）基因豐度

2.2.2 硝化過程相關基因豐度 圖4所示為各處理組表層土壤中參與硝化過程的nxrA基因的豐度。nxrA基因是將NO2-N好氧轉(zhuǎn)化為NO3

--N的標志物［22］。W1、W2兩個處理組基因豐度要顯著高于其他4個處理組（P＜0.05），W1與W2之間以及W3、W4、W5、W6相互間沒有顯著性差異（P＞0.05），nxrA基因和反硝化相關的幾個基因相比，豐度要低很多。amoA基因由于引物設計出現(xiàn)問題，在擴增過程中一直得不到穩(wěn)定的結(jié)果。

圖4 各系統(tǒng)表層土壤硝化過程相關基因絕對豐度

2.2.3 反硝化過程相關基因豐度 圖5是參與反硝化過程的4個重要基因narG、nirK、nirS和nosZ的豐度，對比各反硝化相關基因的豐度與細菌的豐度發(fā)現(xiàn)，反硝化細菌在總的細菌群落里所占的比例并不高，與Henry［23］的結(jié)果一致。

圖5 各處理組表層土壤反硝化過程相關基因豐度

nosZ是編碼N2O還原酶的基因，作用是完成N的徹底反硝化［26］。N2O還原為N2是反硝化作用的最后一步反應，受制于前反應，該基因在W1-W6處理組表層土壤中的豐度和narG基因、nirK基因一致。

2.2.4 厭氧氨氧化細菌基因豐度 圖6是各處理組表層土壤厭氧氨氧化細菌的豐度，W1-W6表層土壤anammox豐度較高，實驗中土壤一直處于淹水的狀態(tài)，造成的厭氧的環(huán)境有利于anammox的增殖。W1、W2、W3三個處理組該細菌豐度要顯著高于其他幾個處理組（P＜0.05），與表層間隙水ORP結(jié)果相一致。

圖6 各處理組表層土壤厭氧氨氧化細菌豐度

3 討論

上覆水中的外源DOM會通過直接沉降或被生物體吸收利用后再經(jīng)過一系列的地球化學過程將其轉(zhuǎn)移到土壤中［27］，增加濕地表層土壤有機質(zhì)含量［28］。本研究中，外源DOM添加條件下表層土壤有機質(zhì)含量的增幅較小。外源溶解性的營養(yǎng)物質(zhì)對土壤有機質(zhì)的貢獻需要通過生物的吸收、轉(zhuǎn)化及死亡后的沉降等是一個長期的過程［27］，表層土壤有機質(zhì)主要來自濕地植物凋落物的生物降解［28-29］。本研究實驗周期為5月21日到9月4日，是蘆葦?shù)纳L期，凋落物較少，因此DOM增幅較小。基于以上，濕地表層土壤一旦被破壞，通過自然過程恢復其有機質(zhì)含量很難，需要漫長的時間。

濕地表層土壤被破壞后可生物利用的有機質(zhì)含量下降，造成微生物數(shù)量銳減［13，30］。而可生物利用有機質(zhì)的增加不僅增加微生物的多樣性，還可增加微生物的基因豐度［31］，濕地表層土壤中充足碳源也有助于古菌的生長［32］。本研究上覆水中DOM的添加提高了表層土壤中供微生物生長的碳提高微生物豐度，與Blanchet等［33］的研究一致。DOM的長期輸入會使?jié)竦赝寥澜Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使微生物群落發(fā)生變化［2］。

硝化過程相關基因豐度也受到土壤有機質(zhì)含量的影響，有機質(zhì)的增加可顯著提高其基因豐度［34］。本研究中可能是土壤處于淹水狀態(tài)，硝化作用受到抑制［35］，硝化細菌nxrA基因的豐度在總的細菌群落里所占的比例并不高。

上覆水添加DOM增加了反硝化的碳源，并提供了厭氧的條件，提高濕地表層土壤narG基因豐度［12，36］。Chen 等［37］的研究也表明加入植物濾液的反硝化細菌豐度明顯高于不加植物濾液的處理組，外加DOM有助于反硝化細菌的生長。本研究中narG基因豐度較高，能夠減少NO3--N 的積累［15］。在氮源、碳源以及氧化還原條件更有利于反硝化作用的W1、W2、W3處理組系統(tǒng)中nirS基因豐度顯著要高于其他處理組（P＜0.05），nirK基因的結(jié)果正相反，也可能是因為相比于nirK基因，nirS基因受碳源的影響更大［38］。

對于nosZ基因來講，N2O的還原受制于前反應，因此nosZ基因豐度變化規(guī)律表現(xiàn)出了和narG基因、nirK基因的一致性［15］。本研究中反硝化過程各個環(huán)節(jié)的narG、nirK、nosZ三個基因的豐度變化規(guī)律表現(xiàn)出了一致性：有機質(zhì)較高的土壤A中各基因豐度顯著高于土壤B（P＜0.05），因為反應底物高且厭氧環(huán)境更適合反硝化的進行；另外，上覆水添加氮和DOM的處理組中基因豐度顯著高于無添加的W5、W6（P＜0.05），而只添加氮的W4則沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。表明碳源在反硝化過程中起到了重要的作用［15］。各處理組nirK和nirS的基因豐度顯著高于nxrA基因的豐度，與Fu等［36］的研究一致，實驗過程中可能存在短程硝化反硝化途徑。

Anammox細菌基因豐度與表層間隙水ORP結(jié)果相一致，還原性的環(huán)境是影響厭氧氨氧化過程的關鍵因素。Trimmer等［39］研究指出土壤有機碳的含量和厭氧氨氧化的活性顯著正相關，有機質(zhì)有助于厭氧氨氧化的進行。Zhi等［15］研究結(jié)果表明當有機質(zhì)含量高時，濕地完全沒有亞硝氮和硝氮的積累，而厭氧氨氧化菌顯著增加。anammox細菌為自養(yǎng)型細菌，以CO2為碳源，有機碳的存在可能會厭氧氨氧化細菌利用有機碳取代基質(zhì)作為新的代謝途徑，展現(xiàn)多樣的代謝途徑［40］。有研究表明低濃度有機物存在時可促進厭氧氨氧化菌的活性，但有機物濃度高時，厭氧氨氧化菌活性大大降低［41-43］。厭氧氨氧化細菌在總的細菌群落里所占的比例較高，厭氧氨氧化成為濕地氮循環(huán)另一種途徑［15］。

4 結(jié)論

上覆水添加外源有機質(zhì)，表層土壤有機質(zhì)含量增幅較小，沒有顯著性的變化（P＞0.05），土壤特性的改變需經(jīng)歷動植物殘體的沉降累積、元素的地球化學循環(huán)等，濕地表層土壤被破壞后的自然恢復是一個漫長的過程。

土壤有機質(zhì)含量顯著影響細菌、古菌及氮循環(huán)各環(huán)節(jié)相關基因的豐度。表層土壤被破壞，土壤中有機質(zhì)含量降低使得微生物及參與氮循環(huán)的基因豐度顯著下降（P＜0.05）。同時提高上覆水中的外源氮和DOM含量會顯著促進濕地微生物以及氮功能基因豐度的增加（P＜0.05）。

土壤有機質(zhì)含量增加顯著促進反硝化過程相關的narG、nirS、nosZ三個基因的豐度，且nirS基因受外加碳源的影響更大。

濕地土壤一直處于淹水狀態(tài)，表層土壤中厭氧氨氧化基因豐度較高，具有較大厭氧氨氧化去除氮素的潛能。

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Effects of Organic Matters on the Abundance of Microorganisms in the Urban Wetland

XIE Jia MA Xiao-hang DAI Yan-ran WU Juan XIANG Dong-fang CHENG Shui-ping
（Key Laboratory of Yangtze River Water Environment for Ministry of Education，Tongji University，Shanghai 200092）

Urban wetland suffers from not only the constant increase of organic matter load，but also the issue of organic matter in the topsoil is damaged in the process of urban development and construction. By adding the dissolved organic matter（DOM）solution of Cinnamomum camphora leaves，together with real-time fluorescence quantitative PCR，the effects of exogenous organic matter on the abundance of microorganisms in the topsoil（0-5 cm）was studied in simulative way. The results showed that changes in soil structure significantly affected the abundances of bacteria，archaea and functional genes associated with nitrogen cycles. The abundances of bacteria and functional genes associated with nitrogen cycles decreased significantly while soil organic matter content decreased（P ＜0.05）. The addition of nitrogen and DOM in the overlying water remarkably increased the abundances of microorganism and nitrogen functional genes in wetland. The exogenous DOM significantly affected the two genes in the transformation process of NO2--N to N2O and NO.

urban wetland；organic matter；qPCR；abundance of microorganism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0528

城市化建設過程中，人類活動會破壞濕地表層土壤結(jié)構(gòu)，造成濕地土壤有機質(zhì)含量等理化性質(zhì)發(fā)生改變；另一方面，生產(chǎn)生活污廢水未經(jīng)處理排入濕地，帶來濕地有機質(zhì)含量增加［1］。城市濕地有機質(zhì)的改變對濕地的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響［2］。微生物是濕地生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的成員，這些微生物存在于濕地的土壤和植物的根系表面，通過參與營養(yǎng)物的循環(huán)和改善填料氧化還原條件，以實現(xiàn)處理污水的功能［3］。研究表明人工濕地中的微生物豐度及其與污染物去除有一定相關性［4-7］，濕地微生物豐度與TN去除率顯著正相關［8］。反硝化及厭氧氨氧化是最終去除污水中TN的途徑，有機質(zhì)及不同形態(tài)的氮是反硝化過程和厭氧氨氧化過程的電子供體或受體［9-10］。有機質(zhì)缺乏往往是反硝化微生物脫氮的限制性步驟［11］，研究表明高濃度有機質(zhì)有利于反硝化微生物的生長［12］。國內(nèi)外學者對濕地微生物的研究多集中于人工濕地微生物功能的研究，對城市濕地微生物基因豐度研究的報道相對較少［13］，因此了解有機質(zhì)濃度對城市濕地微生物基因豐度的影響，將有助于對城市濕地的深入研究。

2017-06-27

國家自然科學基金項目（51578395），上海市創(chuàng)新行動計劃（16DZ1204803）

謝佳，女，碩士研究生，研究方向：水體生態(tài)修復；E-mail：15801755628@163.com

成水平，男，博士，教授，研究方向：生態(tài)修復；E-mail：shpcheng@#edu.cn

（責任編輯 狄艷紅）