郭萍 李紅娜 李峰 葉婧

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所 清潔流域團隊，北京 100081）

石油污染微生物修復(fù)技術(shù)研究進展

郭萍 李紅娜 李峰 葉婧

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所 清潔流域團隊，北京 100081）

石油污染是我國目前陸地和海洋面臨的主要污染問題之一，盡管以微生物為主體的原位修復(fù)技術(shù)在以往的實踐中取得了良好的效果，但隨著石油污染形式的嚴(yán)峻，微生物修復(fù)技術(shù)依然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。隨著石油降解微生物資源庫的不斷累積和研究手段的發(fā)展，人們對微生物石油降解機制有了更加深入的研究，為提高微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用范圍和應(yīng)用效果奠定了良好的基礎(chǔ)。從石油污染與技術(shù)應(yīng)用趨勢、石油降解微生物聚類分析、石油微生物降解的分子機制、石油污染的微生物修復(fù)技術(shù)幾方面總結(jié)和梳理了國內(nèi)外近期的研究進展，以其為迎接新的挑戰(zhàn)提供抓手。

石油污染；微生物修復(fù)；分子降解機制

本文總結(jié)和梳理了石油污染與技術(shù)應(yīng)用趨勢、石油降解微生物聚類分析、石油微生物降解分子機制和石油污染的微生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用等方面，梳理了石油污染微生物修復(fù)相關(guān)領(lǐng)域的研究進展。以期為微生物修復(fù)技術(shù)的高效和廣泛應(yīng)用提供支撐。

1 石油污染與技術(shù)應(yīng)用趨勢

石油已經(jīng)成為世界各國最主要的環(huán)境污染物之一［4-5］，早在20世紀(jì)90年代，研究者就發(fā)現(xiàn)石油污染危害的持久性，石油污染不僅引起了水土環(huán)境質(zhì)量的下降，而且導(dǎo)致了大批動植物死亡，甚至引發(fā)了物種基因的突變，對整個生態(tài)系統(tǒng)造成了難以彌補的危害［6］。據(jù)保守估計每年平均石油泄漏量在110萬t左右，其中海洋石油泄漏有60-80萬t之多［8-9］。以污染土壤的地下儲油罐泄漏為例，20世紀(jì)90年代，美國經(jīng)確認的地下滲漏儲油罐達10萬多個［10］，至2001 年短短10年間已上升至44萬個［11］。與陸地石油污染相比，水體較土壤的流動性更強，污染擴散范圍也更廣。海洋作為第一大水體，石油污染已成為破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)的第一大元兇。據(jù)統(tǒng)計，海洋石油污染發(fā)生的次數(shù)約占海洋總污染事件的80%［12］。自1969年發(fā)生第一次超級油船失事以來，世界上已有超過40處大的海洋泄漏。20世紀(jì) 80 年代初發(fā)生在英國北海的油田和油輪漏油事件，使斯堪的納維亞半島地區(qū)的海洋生物幾乎絕跡。同時期80年代末，在美國阿拉斯加威廉王子海峽觸礁的萬t級“瓦德茲”號油輪，造成4萬t原油傾瀉入海，致使20多萬海鳥和4千多頭海獺死亡，至今經(jīng)過近30年的生態(tài)恢復(fù)，威廉王子峽灣的海獺在掘食蛤蜊時，仍能刨到當(dāng)年滲漏的石油。另一次令人震驚的海洋石油污染事件是21世紀(jì)90 年代中東海灣戰(zhàn)爭導(dǎo)致的輸油管大泄露，原油以每天數(shù)百萬桶的速度從艾哈邁迪輸油管中漏入大海，在波斯灣形成一片長56 km、寬16 km水面油膜，在短短月余時間內(nèi)溢油總量達170萬t，成為人類歷史上最嚴(yán)重的原油泄漏事故。進入21世紀(jì)，隨著世界經(jīng)濟的高速發(fā)展，世界各國對石油的需求也與日俱增，全球石油總產(chǎn)量已由20世紀(jì)的20億t以上增加至2014年的42億t［12］。海洋石油污染也越來越嚴(yán)重和頻繁。據(jù)統(tǒng)計，新世紀(jì)前 12 年全世界共發(fā)生了 77 起大型海上溢油事件，以 2010 年發(fā)生 13 起、2011 年10 起最為頻繁，其持續(xù)時間之長、溢油之多和危害之大令海洋生態(tài)環(huán)境遭受了巨大破壞［13］。2010年最嚴(yán)重的墨西哥灣油井爆炸事件，致使上百萬加侖原油從墨西哥灣1 500 m海面下噴涌而出，所引發(fā)的海洋生態(tài)破壞程度堪比30多年前“瓦德茲”號事故。

我國的石油污染狀況也不容樂觀，我國生產(chǎn)的石油80%來自陸地，以油田基地周圍的土壤污染最為嚴(yán)重。據(jù)初步統(tǒng)計，我國石化行業(yè)中，每年平均僅各種底泥的產(chǎn)量就有80萬t［14］。我國華北油田周圍的很多農(nóng)田由于原油污染而無法耕種，部分石油化工區(qū)可高達10 g/kg土壤，遠高于土壤污染臨界值200 mg/kg［15］。每年繼續(xù)新增污染土壤 10 萬 t［16］。嚴(yán)重的地方甚至污染到地下水資源，如山東淄博地區(qū)早在21世紀(jì)初地下水的最高含油就達到100 mg/L以上，超過國家標(biāo)準(zhǔn)（＜0.1 mg/L)1 000倍以上［17］。我國地下儲油罐泄漏情況雖然沒有系統(tǒng)的統(tǒng)計資料，但僅就已經(jīng)報道的加油站漏油事故已顯示我國的儲油罐問題不容忽視。石油污染也威脅到了我國的地表水資源，以黃河和遼河為例，黃河水系年平均含油最高可達4.82 mg/L，遼河水系年平均含油最高可達7.68 mg/L，遠遠超過了國家地面水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定的3類地表水標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002，＜0.1 mg/L）。我國海洋也是石油污染的重災(zāi)區(qū)。20世紀(jì)70年代末到80年代初，石油以10萬t/年的速度進入我國近海海域，到80年代末該數(shù)值增至近20萬t/年，之后呈逐年遞增趨勢［18］。如1983年巴拿馬籍“東方大使”號油輪在青島港出港行駛至中沙礁擱淺，導(dǎo)致3 343 t原油泄漏，污染海岸線230 km，同時對附近1000多 hm2的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)造成嚴(yán)重污染。本世紀(jì)2004年末，巴拿馬籍集裝箱船“現(xiàn)代促進”輪與德國籍集裝箱船“地中海伊倫娜”輪發(fā)生碰撞，導(dǎo)致1 200多t船舶燃料油溢出，在海上形成一條長約16.5 km的油帶，造成珠江口海域嚴(yán)重污染。2011年，大連新港一艘利比里亞籍30萬t油輪卸油，陸地輸油管線爆炸引發(fā)大火和原油入海，溢油的總量達到了1 500 t，導(dǎo)致50 km2海面受污染，同年渤海蓬萊發(fā)生的19-3油田溢油事故，共造成劣四類海水面積800 km2之多，使整個渤海生態(tài)系統(tǒng)受到嚴(yán)重危害［11，13，19］。

石油污染對生物和生態(tài)環(huán)境造成的極大危害顯而易見，未來的形勢也更加嚴(yán)峻，對之進行治理也成為生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展中最迫切的事情。利用微生物降解石油污染物的成功案例最早見于20世紀(jì)80年代末美國治理“瓦德茲”油輪石油泄露項目，該項目利用微生物短時間內(nèi)清除了石油污染，開創(chuàng)了生物修復(fù)治理石油海洋污染的先例。此后石油污染微生物修復(fù)相關(guān)領(lǐng)域的研究呈現(xiàn)了爆發(fā)式的蓬勃發(fā)展，在微生物菌種資源、降解機制、環(huán)境應(yīng)用等方面都取得了一定成果。

2 石油降解微生物歸類分析

油污降解功能微生物涉及了眾多的細菌種屬和部分真菌種屬，分離及鑒定烷烴降解微生物是微生物治理技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)［20］。據(jù)研究報道統(tǒng)計，石油烴降解菌涉及到細菌7個門之多，近70個屬，真菌13個屬，放線菌10個屬、藍藻9個屬、海藻14個屬，共200多種微生物。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹從門和亞門級對石油降解菌歸類分析，結(jié)果顯示細菌主要為變形菌門（proteobacteria）和厚壁菌門（Finnicutes）的種屬，放線菌集中于放線菌門（Actinomycesbovis），真菌歸屬真菌門（Eumycota），又以子囊菌亞門（Ascomycetes）、半知菌亞門（Deuteromycotina）和擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）的種屬為主［21］。結(jié)合國內(nèi)外的研究報道，將研究比較深入的石油烴降解菌按照門級歸類如表1。從表1可以看出石油降解菌歸屬有偏好，細菌以變形菌門和放線菌門種屬占比較高，尤其以變形菌門凸顯。

表1 石油烴降解菌分類表

微生物利用石油烴底物的活性存在不同程度的差異，細菌是石油烴降解菌團中研究最早和最廣泛的微生物種類［22-23］。僅以石油烴為唯一碳源的細菌就達到7個屬之多，包括食烷烴菌屬（Alcanivorax）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、解環(huán)菌屬（Cycloclasticus）、嗜油菌屬（Oleiphilus）、油螺旋菌屬（Oleispira）、深海彎菌屬（Thalassolituus）和海桿菌屬（Marinobacter）。其中的食烷烴菌屬、嗜油菌屬、油螺旋菌屬、深海彎菌屬可以利用各種各樣的直鏈和/或支鏈飽和烴。不動桿菌屬（Acinetobacter）可以利用C10-40的大分子直鏈烷烴，而解環(huán)菌屬則以多環(huán)芳烴為底物，其他屬細菌可利用的底物具有多樣性［24-28］。

油污土壤和油污海水中富集的微生物種群類別和數(shù)量也存在差異。石油污染土壤中主要累積的細菌有紅桿菌（Rhodobacter）、紅球菌（Rhodococcus）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）和短桿菌（Brevibacterium），尤其是光合紅細菌數(shù)量較未污染土壤高出很多［29-30］。有兩類重要的光合細菌類莢膜紅桿菌（Rhodobacter capsulata）和膠質(zhì)紅環(huán)菌屬（Rhodocyclus gelatinosa）可代謝土壤石油污染物［31］。油污海洋中不僅會富集大量的石油降解細菌，也會富集大量的石油降解真菌。富集的石油降解細菌有：食烷烴菌（Alcanivorax）、海桿菌（Marinobacter）、無色桿菌（Achromobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）、不動桿菌（Acinetobacter）、芽孢桿菌（Bacillus）、微球菌（Micrococcus）和產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）等；富集的真菌包括金色擔(dān)子菌（Aureobasidium）、紅酵母菌（Rhodotorula）、假絲酵母菌（Candida）等［20，32-33］。有些研究結(jié)果表明擬桿菌也是海洋石油降解菌群中的重要菌類，尤其在污染海洋的底泥樣本中［34-36］。其中以對降解芳香烴的新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）研究得最為深入［37-39］。

以上的研究報道說明不同種屬的微生物對底物和環(huán)境條件具有一定的選擇性和傾向性，這些屬性是由微生物代謝石油烴的分子代謝機制決定的。

3 微生物降解石油的分子機制

研究微生物石油降解機制是提升微生物治理效率的內(nèi)在動力。微生物降解石油類化合物的難易程度不同，依次為直鏈烷烴＞支鏈烷烴＞小分子芳烴＞環(huán)烷烴［2］。鏈烷烴主要通過好氧的單末端氧化、次末端氧化、雙末端氧化和厭氧的直接脫氫方式降解［40-41］。各途徑生成的脂肪酸再進行β氧化最終形成二碳脂肪酸和乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)放出CO2。相比于直/支鏈烷烴，環(huán)烷烴的結(jié)構(gòu)決定了其更難于被微生物降解。環(huán)烷烴的好氧降解一般是在多功能氧化酶的催化下形成環(huán)醇，繼而脫氫成環(huán)酮，再進一步氧化成環(huán)酯，也可開環(huán)成為脂肪二酸。芳香烴類因其結(jié)構(gòu)中均含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，所以其好氧降解的共同點是苯環(huán)結(jié)構(gòu)在加氧酶催化下先加氧成苯醇，進而脫氫為苯酚、開環(huán)等一系列后續(xù)酶促反應(yīng)，最后進入三羧酸循環(huán)［42-43］。對于好氧條件下難降解的芳香烴，在厭氧條件下降解的共同點是苯環(huán)結(jié)構(gòu)在羧酸氧化酶的催化下生成苯甲酸，然后生成苯甲酰輔酶 A［43-44］。

近年來，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，石油微生物功能基因和蛋白的研究成為新的熱點。早在2003年，Acinetobacter sp. ADPl 和Pseudomonas aeruginosa PAOl 兩株石油降解菌的全基因組序列己經(jīng)由耶魯大學(xué)和華盛頓大學(xué)公布并進行功能基因組學(xué)分析，石油降解菌Alcanivorax borkumensis SK2的全基因組序列也由德國的GBF中心（GBF-German Research centre for Biotechnology）完成了破譯［45］。隨著基因測序技術(shù)的革命性發(fā)展，測序成本大幅度降低，眾多的石油降解菌完成了基因組的測序工作，包括節(jié)桿菌、分支桿菌、芽孢桿菌、紅球菌、鞘氨醇單胞菌和多個假單胞菌［46-49］。與此同時，對石油烴降解蛋白的研究也逐漸聚焦一些關(guān)鍵的烷烴降解酶，依據(jù)烷烴降解酶催化底物烷烴鏈的長度不同，可把烷烴降解酶分為3類：（1）負責(zé)氧化短鏈烷烴的可溶性甲烷單加氧酶（sMMO）及與其類似酶［50-51］；（2）氧化中等鏈長烷烴的膜結(jié)合相關(guān)烷烴羥化酶 Alk 和細胞色素 P450 單氧酶［52-54］；（3）氧化長鏈烷烴的酶系統(tǒng) AlmA［41，55-56，58］。研究結(jié)果顯示烷烴羥化酶是由跨膜羥化酶AlkB、胞質(zhì)紅素氧還蛋白AlkFG和紅素氧還蛋白還原酶AlkT所組成，形成完整的3組分酶復(fù)合體，其中跨膜烷烴羥化酶AlkB以及細胞色素 P450和黃素結(jié)合蛋白AlmA是目前研究較為廣泛的石油降解酶，能夠催化烷烴降解的起始反應(yīng)。在所有已鑒定的烷烴羥化酶中都顯示共有一個7個氨基酸組成的保守區(qū) NYXEHYG（L/M），該區(qū)域可被用來識別跨膜烷烴羥化酶［57］。不同降解菌中的P450蛋白依據(jù)基因差異可分別歸屬于267個不同家族［58］。對應(yīng)于石油組分的復(fù)雜性，烷烴降解菌的酶系統(tǒng)也呈現(xiàn)出多樣性，不同的烷烴降解酶可同時存在于同一菌種，同時這些降解酶系統(tǒng)的底物范圍又可交叉或重疊［59-60］。

石油烴降解菌在長期適應(yīng)環(huán)境中不僅發(fā)展出了以石油為底物的代謝系統(tǒng)，而且形成了有利于底物接近與獲取的輔助系統(tǒng)。例如微生物細胞壁外的特殊吸收系統(tǒng)，該系統(tǒng)可產(chǎn)生表面活性劑使石油烴類化合物充分乳化，以利于細菌的吸收和利用［61］。據(jù)報道，有百種以上的微生物能產(chǎn)生表面活性劑。微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑就其化學(xué)組成來分，主要分為糖脂類和脂肽類，這些表面活性劑通過增強烴類水溶性來提高微生物細胞的底物獲取能力［62-63］。另外一些微生物則通過自身的趨化性運動與底物接觸，如一些假單胞類污染物降解菌（Pseudorhonas pzctida G7、Pseudomonas pvtida RKdI和Psetidomonas sp. strain NCIB）對底物有一定的趨化行為［64-66］。

4 石油污染的微生物修復(fù)技術(shù)

微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用是微生物菌種資源獲取和污染降解機制研究的最終目的。目前利用微生物對石油降解效果和影響因子的研究多集中在實驗室條件下，野外和露天自然條件下的應(yīng)用研究相對較少［67-71］。20世紀(jì)80年代末期，美國應(yīng)用微生物技術(shù)成功清理了“瓦德茲”油輪石油泄漏造成的污染，開創(chuàng)了微生物修復(fù)技術(shù)治理石油污染的先例［72-74］。

隨后的研究證明，石油微生物降解的程度和效率依賴于微生物的種類數(shù)量以及生物降解的環(huán)境條件［2，75］。微生物作為石油污染修復(fù)主體，是微生物修復(fù)技術(shù)建立的核心。由于不同種屬微生物作用的底物有差異，沒有一種微生物能夠單獨降解所有的石油烴組分，必須通過多種微生物的聯(lián)合氧化和偏利共生的協(xié)同作用才能取得滿意效果［22］。因此依據(jù)環(huán)境中污染物的成分，利用不同微生物作用對象和作用機制的互利性，形成針對多組分底物的多樣性微生物菌團，才能達到更好的微生物石油降解或環(huán)境修復(fù)效果。

微生物的降解效果不僅與自身代謝機制相關(guān)，同時也受到環(huán)境因子的影響。影響微生物降解效果的環(huán)境因子包括營養(yǎng)元素、氧氣、溫度和表面活性劑等。環(huán)境中的N、P營養(yǎng)元素是微生物成功降解石油的重要原料，只有滿足一定的養(yǎng)分條件，微生物才能有效代謝石油污染物。有研究結(jié)果認為環(huán)境中 C∶N∶P的最適比例為100∶10∶1［76］。為滿足營養(yǎng)鹽的濃度需求，不同修復(fù)環(huán)境所適宜的營養(yǎng)鹽形態(tài)也不同。土壤環(huán)境施加水溶性的氮磷營養(yǎng)鹽可有效促進烴類的生物降解，但海洋環(huán)境由于受到水流擴散等的影響，水溶性營養(yǎng)鹽更容易稀釋和流失，而水不溶或脂溶性營養(yǎng)鹽于油相中能更好地保障微生物的利用［2，77］。雖然營養(yǎng)元素的缺乏可限制微生物的生長，但過高的濃度也會對石油降解起抑制作用。表面活性劑的作用與營養(yǎng)鹽相似，適量的表面活性劑會降低微生物利用石油的表面張力，促進石油烴降解菌的生長，但隨著表面活性劑的持續(xù)增加菌量反而會減少［1，78］。由于石油烴的好氧降解效率相對較高，氧作為電子受體可提高石油烴的降解效率［79-80］。厭氧條件下雖然部分微生物能降解石油，但降解速率相對較低［42］，但在有氧條件下較難降解的姥鮫烷和植烷可在厭氧條件下發(fā)生降解［81］。溫度也是影響石油降解效率的重要因子之一。雖然降解石油的微生物有嗜冷菌、嗜熱菌和嗜中溫菌，但大多數(shù)石油降解菌屬嗜中溫菌，最適溫度在30℃左右，溫度過高過低都會對降解效率產(chǎn)生抑制。另外，環(huán)境的酸堿條件也是影響微生物降解效果的關(guān)鍵因子，大部分的微生物最適PH在中性左右，酸性和堿性條件均不利于微生物的生長。

綜上所述，微生物修復(fù)石油污染的效果，不僅與微生物自身的降解能力有關(guān)，而且與菌種之間的協(xié)同性、環(huán)境因子的適宜度等都有關(guān)系，所以要綜合考慮各種因素，除了依據(jù)類別和降解機制選擇合適的高效降解菌協(xié)作菌團外，還要為這些降解菌創(chuàng)造必要的生存、繁殖和降解條件，才能達到更好的環(huán)境污染修復(fù)效果。

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Review of Petroleum Hydrocarbon Pollution and Microorganism Remediation

GUO Ping LI Hong-na LI Feng YE Jing
（Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture，Agricultural Clean Watershed Research Group，Beijing 100081）

petroleum hydrocarbon pollution is one of the most severe environmental pollution in abroad and china，the restoration of environment ecology and remediation of petroleum hydrocarbon pollution by microorganism technology have revealed advantage in past practice.With the economic development rapidly，the quickly increased requirement for petroleum hydrocarbon highlights the pollution problem.The challenge is regarding to this technology under more severe pollution and environmental deterioration. This paper address the trend of petroleum pollution and technology application，the analysis of petroleum hydrocarbon degradation microorganism classification，the molecular mechanism of petroleum hydrocarbon degradation by microorganism and the application of microorganism remediation technology，and cater for understanding the challenge more further.

petroleum hydrocarbon pollution；microorganism remediation；molecular degradation mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0799

隨著全球工業(yè)化發(fā)展和現(xiàn)代化進程的加快，人們對石油及其制品的需求快速增加。為了滿足人們?nèi)找嬖黾拥男枨螅偷拈_采量和開采范圍不斷擴大，交易量逐年攀升，導(dǎo)致受污染的土壤和海域范圍也在不斷擴展。據(jù)估計每年造成環(huán)境污染泄露的石油在百萬t以上。石油污染由于其高毒性和難降解性已對生物和生態(tài)環(huán)境造成了極大的危害，如何治理并恢復(fù)健康的生態(tài)環(huán)境已成為人類生存和社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。微生物治理技術(shù)以其環(huán)境友好和費用低（僅為理化治理技術(shù)30%-50%）的優(yōu)勢，引起了相關(guān)領(lǐng)域的極大關(guān)注［1-2］。由于不同微生物的作用底物和作用機制不同，而石油組分相對較復(fù)雜，所處的環(huán)境條件也不盡相同，單一微生物很難達到理想的修復(fù)效果，因此高效石油降解菌的選擇和協(xié)同作用很重要，掌握菌種資源分類特征和作用機制是面對微生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用挑戰(zhàn)和取得理想修復(fù)效果的關(guān)鍵［3］。

2017-08-10

國家科技重大專項（2015ZX07402003）

郭萍，女，博士，研究員，研究方向：研究方向：環(huán)境退化與生物修復(fù)；E-mail：guoping@caas.cn

（責(zé)任編輯 李楠）