劉攀龍 于魯冀，2 李廷梅 范錚 陳濤

（1. 鄭州大學(xué)環(huán)境政策規(guī)劃評(píng)價(jià)研究中心，鄭州 450002；2. 鄭州大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450001）

污染河流土著異養(yǎng)硝化菌的篩選及其鑒定

劉攀龍1于魯冀1，2李廷梅1范錚1陳濤1

（1. 鄭州大學(xué)環(huán)境政策規(guī)劃評(píng)價(jià)研究中心，鄭州 450002；2. 鄭州大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450001）

利用以琥珀酸鈉和硫酸銨為唯一碳源和氮源的選擇培養(yǎng)基從賈魯河污染水體中篩選異養(yǎng)硝化菌，采用富集、梯度稀釋涂布平板和平板劃線分離的方法對(duì)菌種進(jìn)行分離純化，結(jié)合16S rDNA分析、生理生化特性和氮轉(zhuǎn)化特點(diǎn)對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，從水體中共分離出的63株純菌株中，經(jīng)鑒定其中3株菌為異養(yǎng)硝化菌，包括1株硝化假單胞桿菌（Pseudomonas nitroreducens）和2株門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina），對(duì)氨氮去除率分別為91.8%、89.8%、81.4%。

異養(yǎng)硝化；土著菌；篩選；鑒定

本研究以鄭州市賈魯河受污染的河水為接種樣品，通過富集、分離、純化和脫氮性能比選從中篩選出高效脫氮的土著異養(yǎng)硝化菌，以分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)菌種的16S rDNA測(cè)序，結(jié)合菌種生理生化試驗(yàn)現(xiàn)象和對(duì)氨氮的轉(zhuǎn)化性能鑒定菌種，旨為菌種用于河流氨氮污染的治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 土著脫氮微生物篩選所采用的樣品為賈魯河受污染的河水，為增加樣品的生物多樣性，提高成功篩選土著脫氮微生物的概率，選擇沿程有支流匯入的點(diǎn)位以及典型污染區(qū)域的河水樣品，共采集9個(gè)水樣，編號(hào)#1-#9，采樣點(diǎn)位分布，見圖1。

圖1 采樣點(diǎn)位分布圖

1.1.2 培養(yǎng)基及成分 本研究采用的培養(yǎng)基種類、作用及具體成分如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 樣品富集方法 以銨鹽有機(jī)培養(yǎng)基（A）對(duì)采集的樣品富集培養(yǎng)：以孔徑為0.22 μm的濾膜對(duì)采集的水樣抽濾，水體中的微生物被截留在濾膜上，將濾膜剪碎轉(zhuǎn)移至裝有100 mL液體富集培養(yǎng)基（A）的錐形瓶?jī)?nèi)，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，每24 h以萘氏試劑、格里斯試劑、二苯胺試劑檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)銨鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽的轉(zhuǎn)化與生成情況，若銨鹽大量減少，以1%接種量轉(zhuǎn)接入新鮮富集培養(yǎng)基中繼續(xù)富集，循環(huán)3-4個(gè)周期后，富集液具有將銨鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和硝酸鹽的能力，得到異養(yǎng)硝化菌的富集液。

1.2.2 脫氮微生物篩選方法 從富集的樣品中挑選銨鹽轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)富集液開展脫氮微生物的篩選研究：采用稀釋涂布平板的方法將挑選的樣品接種于固體銨鹽有機(jī)培養(yǎng)基（C），恒溫培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，挑取典型菌落劃線分離，以純化菌種，重復(fù)2-3次，斜面保存?zhèn)溆谩⑻暨x的菌種分別接種于液體銨鹽有機(jī)培養(yǎng)基（C）中，考察經(jīng)純化的菌種對(duì)銨鹽的轉(zhuǎn)化效果，選出效果較好的菌種。

1.2.3 菌種鑒定方法 菌種鑒定包括16S rDNA測(cè)序方法和生理生化試驗(yàn)方法。

表1 培養(yǎng)基及成分

1.2.3.1 菌種的16S rDNA測(cè)序方法 （1）基因組DNA提?。河没蚪M快速抽提試劑盒（生工SK8 255）提取基因組，提取方法參照配套說明書。（2）PCR擴(kuò)增：采用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27F-1 492R對(duì)提取的DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度約1 500 bp，經(jīng)94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃復(fù)性 45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃修復(fù)延伸10 min。（3）凝膠電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min電泳觀察。（4）純化回收：PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，以PCR引物直接測(cè)序，PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。（5）序列結(jié)果對(duì)比：將得到的序列輸入NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌種序列比對(duì)。

1.2.3.2 生理生化試驗(yàn)方法 生理生化試驗(yàn)包括：氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)等，具體操作方法見《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版）。

1.2.4 各形態(tài)氮含量檢測(cè)方法

1.2.4.1 定性分析 每個(gè)樣品取3滴，分別滴加萘氏試劑、格里斯試劑及二苯胺試劑，以顏色顯示氨氮、亞硝態(tài)氮及硝態(tài)氮的含量，如表2所示。

表2 各形態(tài)氮含量初步檢驗(yàn)方法

1.2.4.2 定量分析 用于初步檢測(cè)氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的顯色劑無(wú)法準(zhǔn)確表示氮的濃度，因此需對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。定量分析的方法如表3所示。其中測(cè)定菌液氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮時(shí)需對(duì)菌液進(jìn)行離心處理，以消除菌體對(duì)吸光度測(cè)定的干擾，離心條件為3 000 r/min、15 min。

表3 各形態(tài)氮定量分析方法

2 結(jié)果

2.1 河流土著異養(yǎng)硝化菌的篩選

2.1.1 脫氮微生物富集結(jié)果 將采集的樣品分別接種于銨鹽液體有機(jī)培養(yǎng)基（A）作富集培養(yǎng)，經(jīng)過大約4周的富集，成功得到異養(yǎng)硝化菌富集液，以萘氏試劑、格里斯試劑及二苯胺試劑檢驗(yàn)最終的富集情況：#1、#2富集液對(duì)銨鹽的轉(zhuǎn)化能力較弱，而#3-#9對(duì)銨鹽的轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，表明這些富集液能有效利用銨鹽的微生物數(shù)量較多。其中#7-#9富集液遇二苯胺藍(lán)色最深，表明該3個(gè)富集液樣品中-N含量最高，微生物硝化效果最好；#4富集液的NH3-N、-N和的濃度均不高，富集液中明顯可以觀察到大量菌體，表明該富集液中存在異養(yǎng)硝化菌或反硝化細(xì)菌。脫氮微生物的篩選重點(diǎn)選擇銨鹽轉(zhuǎn)化性能較好的#4、#7、#8和#9富集樣品。

2.1.2 菌種分離純化結(jié)果 采用梯度稀釋涂布瓊脂平板和平板劃線分離的方法對(duì)富集的菌液進(jìn)行分離和純化，共得到菌落形態(tài)有差異的純菌株63株，部分菌株在涂布和劃線分離的平板上的形態(tài)（圖2）。

圖2 部分涂布和劃線分離的平板

2.1.3 菌種脫氮性能的比選 從選擇培養(yǎng)基上篩選的63株菌依次編號(hào)，分別接種到液體選擇培養(yǎng)基（C），在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3 d，檢驗(yàn)菌種對(duì)氨氮的去除效果，結(jié)果如圖3所示。菌種對(duì)氨氮去除效果高低各異，C39的去除率最高為95.2%，其次為C38，去除率為91.2%；部分菌種對(duì)氨氮去除效果很低，如C20、C16、C13等，去除率在5%以下，結(jié)合菌種在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況可以判斷這幾株菌在液體培養(yǎng)基中未正常生長(zhǎng)，推測(cè)原因?yàn)榫旰醚?，而液體培養(yǎng)基供氧效率不如固體培養(yǎng)基表面，因此氨氮去除率低。挑選對(duì)氨氮去除率高的菌種進(jìn)行下步研究。

2.2 菌種鑒定

按照菌種對(duì)氨氮的去除效率高低排列，選擇去除率75%以上的菌種共22株作16S rDNA測(cè)序鑒定。細(xì)菌DNA擴(kuò)增引物采用通用引物27F-1 492R，擴(kuò)增長(zhǎng)度約1 500 bp，部分菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖片，如圖4所示。

圖3 篩選的菌種對(duì)氨氮的去效果對(duì)比

圖4 部分菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖片

經(jīng)測(cè)序，將所得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行相似度對(duì)比發(fā)現(xiàn)，挑選的22株菌包括了假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga sp.）、短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）等在內(nèi)的11個(gè)不同的屬，序列同源性最低為98.56%，最高為100%。假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）內(nèi)部分菌種具有異養(yǎng)硝化的效果。因此，從測(cè)序的22株菌將假單胞桿菌挑選出來(lái)，共5株，分別為C2、C25、C36、C38和C56。查詢《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，參考假單胞桿菌屬內(nèi)模式菌種的生理生化特性，設(shè)計(jì)9組生理生化試驗(yàn)輔助鑒定菌種，結(jié)果如表4所示。

根據(jù)生理生化試驗(yàn)進(jìn)一步判斷，5株菌分別為：硝化假單胞桿菌（Pseudomonas nitroredu-cens）、Pseudomonas chengduensis、石油假單胞桿菌（Pseudomonas oleovorans）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）。

表4 所篩選5株菌生理生化試驗(yàn)現(xiàn)象

2.3 菌種脫氮性能研究

2.3.1 菌種的硝化性能 將篩選的5株菌分別接種于銨鹽液體有機(jī)培養(yǎng)基（C）中，于30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)3 d，對(duì)液體培養(yǎng)基內(nèi)氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、總氮含量進(jìn)行測(cè)定，研究其硝化性能，結(jié)果如表5所示。5株菌對(duì)氨氮都有較高的去除效果，其中C2對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)氨氮去除率達(dá)91.8%為最高。5株菌對(duì)硝態(tài)氮基本無(wú)積累，但菌株C38、C56對(duì)亞硝態(tài)氮有少量積累，在1 mg/L左右，其余3株菌對(duì)硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮基本無(wú)積累。菌株C2、C38、C56對(duì)總氮約有20%-25%的去除效果。綜合這3株菌對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)氨氮的轉(zhuǎn)化效果，可以判斷培養(yǎng)基內(nèi)氨氮一部分以銨鹽形式被菌株同化吸收，用以合成自身菌體蛋白，維持生命活動(dòng)，另一部分氨氮（約20%-25%）通過氮循環(huán)的方式從環(huán)境中去除，由于異養(yǎng)型微生物在生長(zhǎng)過程中利用的碳源為有機(jī)碳源，生長(zhǎng)速度較一般自養(yǎng)型微生物快，被同化吸收部分氨氮占比高。其余2株菌對(duì)總氮基本無(wú)去除效果，可以判斷該2株菌對(duì)氨氮去除方式為菌株同化作用。2.3.2 菌種反硝化性能研究 將菌種接種于硝酸鹽液體有機(jī)培養(yǎng)基（D）中，于30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)3 d，對(duì)液體培養(yǎng)基內(nèi)硝態(tài)氮、總氮含量進(jìn)行測(cè)定，以檢驗(yàn)菌種反硝化性能，結(jié)果如表6所示。菌株C25、C36對(duì)硝態(tài)氮的去除率較低，其余三株菌對(duì)硝態(tài)氮的去除效果較好，其中菌株C2（Pseudomonas nitroreducens）對(duì)硝態(tài)氮的去除率最高，達(dá)96.4%；5株菌對(duì)亞硝態(tài)氮都有積累，其中C2且對(duì)亞硝態(tài)氮積累量最高，達(dá)到78.35 mg/L，反硝化性能最強(qiáng)。

表5 菌種接種于銨鹽液體有機(jī)培養(yǎng)基后的培養(yǎng)結(jié)果

表6 菌種接種于硝酸鹽液體有機(jī)培養(yǎng)基后的培養(yǎng)結(jié)果

綜合菌種對(duì)氨氮和硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化情況，可以判斷菌株 C2（Pseudomonas nitroreducens）、C38（Pseudomonas mendocina）、C56（Pseudomonas mendocina）為異養(yǎng)硝化菌，而其余2株菌是以微生物的同化方式去除氨氮的，非脫氮菌。

3 討論

由于具有生長(zhǎng)速度快、溶解氧要求低、氨氮轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)，越來(lái)越多的異養(yǎng)硝化菌被篩選和研究。姚秀清等［12］采用模擬廢水和活性污泥在SBR反應(yīng)器中富集培養(yǎng)異養(yǎng)硝化菌，投加的模擬廢水氨氮濃度從100 mg/L逐步提升至1 396 mg/L，歷經(jīng)5個(gè)月，篩選出的兩株異養(yǎng)硝化菌，對(duì)氨氮去除率分別為71.2%和85.8%；陳威等［13］利用亞硝化細(xì)菌分離培養(yǎng)基從淺層底泥中分離到一株具有硝化反硝化能力的異養(yǎng)硝化細(xì)菌，經(jīng)8 d的培養(yǎng)，氨氮的去除率為49.2%。這些研究中異養(yǎng)硝化菌是從活性強(qiáng)、微生物種類多的環(huán)境中篩選得到的，這類細(xì)菌與長(zhǎng)期棲息于河水中的土著菌相比，對(duì)河水環(huán)境的適應(yīng)能力較差，因而難以在河水中發(fā)揮高效脫氮作用。

王珺等［14］從城市納污河流中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化功能的假單胞桿菌，該菌株7 d內(nèi)對(duì)-N和的去除率分別達(dá)56.26%和53.99%；蘇俊峰等［15］從水庫(kù)底泥中富集分離出一株貧營(yíng)養(yǎng)型異養(yǎng)硝化菌，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，對(duì)氨氮去除效果明顯，氨氮濃度從9.02 mg/L、7.49 mg/L下降到1.83 mg/L、1.07 mg/L，最高去除率達(dá)91.42%；芮傳芳等［11］從巢湖底泥中分離出一株具有氨氮轉(zhuǎn)化活性的枯草芽孢桿菌，氨氮轉(zhuǎn)化效率為39.4%。這些研究將菌種判定為異養(yǎng)硝化菌的依據(jù)僅是菌種能利用有機(jī)碳源、對(duì)氨氮去除效果高，然而水體中微生物種類相當(dāng)復(fù)雜，有相當(dāng)一部分微生物能將氨氮作為氮源用于自身生命活動(dòng)，這給利用選擇培養(yǎng)基篩選異養(yǎng)硝化菌的方法增添誤導(dǎo)信號(hào)，在該類選擇培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)的細(xì)菌并非都是異養(yǎng)硝化菌。本研究從受污染的賈魯河水體中篩選異養(yǎng)硝化菌，所得菌種為賈魯河土著菌種，在河流污染治理上比外來(lái)菌種能更快適應(yīng)環(huán)境；在菌種的鑒定上，結(jié)合了分子生物學(xué)方法以及對(duì)菌種的生理生化特性研究初步挑選了5株可能為異養(yǎng)硝化菌的假單胞桿菌，通過該5株菌對(duì)氨氮和硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化途徑，從中篩選了3株異養(yǎng)硝化菌，在有效利用銨鹽、硝酸鹽的同時(shí)，還通過異養(yǎng)硝化途徑對(duì)氨氮去除，該過程是一個(gè)連續(xù)過程，不生成，與Richardson等［16］對(duì)異養(yǎng)硝化途徑的解釋NH3-N→NH2OH→N2O→N2相符。

4 結(jié)論

利用銨鹽選擇培養(yǎng)基從賈魯河污染水體中篩選出能高效去除氨氮的5株假單胞桿菌，經(jīng)菌種鑒定分別為硝化假單胞桿菌（Pseudomonas nitroreducens）、Pseudomonas chengduensis、 石 油 假單胞桿菌（Pseudomonas oleovorans）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）。

分析菌株對(duì)氨氮和硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化情況，發(fā)現(xiàn)菌株C2、C38、C56具有較強(qiáng)的硝化和反硝化性能，對(duì)氨氮的去除率最高達(dá)91.8%，且在對(duì)氨氮的轉(zhuǎn)化過程中無(wú)NO3-生成，符合異養(yǎng)硝化菌對(duì)氨氮的轉(zhuǎn)化途徑，結(jié)合16S rDNA測(cè)序結(jié)果以及生理生化特性最終鑒定其為異養(yǎng)硝化菌。

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Isolation and Identification of Indigenous Heterotrophic Denitrifying Bacteria from Polluted River

LIU Pan-long1YU Lu-ji1，2LI Ting-mei1FAN Zheng1CHEN Tao1
（1. Research Center of Environmental Policy Planning & Assessment of Zhengzhou University，Zhengzhou 450002；2. School of Water Conservancy and Environmental Engineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001）

Heterotrophic denitrifying bacteria from the polluted water of Jialu River were screened on the selective medium，with sodium succinate as sole carbon source and ammonium sulfate as sole nitrogen source. Then，the separation and purification were performed by enrichment，gradient dilution and streaking on the plates. Finally，the strain was identified according to 16S rDNA sequence alignment results，physiological and biochemical experiments and the ammonia nitrogen transformation. The results showed that，63 strains were isolated from the polluted water，and 3 of them were identified as heterotrophic denitrifying bacterium，including a strain of Pseudomonas nirtoreducens and two strains of Pseudomonas mendocina，by which the ammonia nitrogen removal rate were 91.8%，89.8%，and 81.4%，respectively.

heterotrophic nitrification；indigenous bacteria；isolation；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0252

河流、湖泊水體中氨氮含量超標(biāo)是我國(guó)水體污染的主要原因之一［1-2］，因而受到人類的高度關(guān)注。多年來(lái)，世界各國(guó)在氨氮污染治理上投入大量精力，但是河流氨氮污染的現(xiàn)狀仍舊存在。河流水體氨氮治理的方法分為物理法、化學(xué)法和生物法，物理法如底泥疏浚、環(huán)境調(diào)水，化學(xué)法如混凝沉淀、加氯處理等都有動(dòng)力消耗大，需要投入大量人力、物力的特點(diǎn)，適于工程量大、氨氮污染更為嚴(yán)重的水體應(yīng)急性治理［3-4］；而生物法則主要依靠河流微生物的代謝活動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)水中氨氮去除的目的，因其具有經(jīng)濟(jì)高效、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛應(yīng)用［5］。

傳統(tǒng)生物脫氮理論中，氨氮經(jīng)硝化途徑被自養(yǎng)型亞硝化、硝化細(xì)菌逐步轉(zhuǎn)化成亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮，再經(jīng)反硝化途徑被異養(yǎng)型的反硝化細(xì)菌轉(zhuǎn)化成氮?dú)鈴沫h(huán)境中去除［6］。20世紀(jì)80年代，Robertson等［7］篩選出Thiosphaera pantotropha，首次提出了異養(yǎng)硝化的概念。不同于自養(yǎng)硝化，異養(yǎng)硝化是微生物在利用有機(jī)底物的同時(shí)將氨氮轉(zhuǎn)化為羥胺和亞硝酸鹽，并還原成氣體從環(huán)境中去除的過程，該過程是一個(gè)連續(xù)的過程，很少生成硝酸鹽［8］。由于異養(yǎng)硝化菌具有生長(zhǎng)速度快、溶解氧濃度要求低、氨氮去除率較高等諸多優(yōu)點(diǎn)［9-11］，異養(yǎng)硝化菌的篩選成為近年來(lái)污水脫氮的一個(gè)熱點(diǎn)。

2017-03-31

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)（2012ZX07204-001-004）

劉攀龍，男，碩士，研究方向：水污染控制理論與技術(shù)，環(huán)境微生物；E-mail：lpl6955@126.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）