梅源，唐佳穎，何惠容，敖曉琳

(四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安，625014)

霉豆瓣中優(yōu)勢微生物蛋白酶活性測定

梅源，唐佳穎，何惠容，敖曉琳*

(四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安，625014)

選擇市售的2種霉豆瓣為研究對象，分離出其中的微生物，通過回接發(fā)酵實驗，篩選出能發(fā)酵霉豆瓣的優(yōu)勢菌株M1、M2和M3。經(jīng)鑒定M1為黑曲霉(Aspergillusniger)、M2為米曲霉(Aspergillusoryzae)、M3為雅致放射毛霉(Actinomucorelegant)。對優(yōu)勢菌株進行蛋白酶活力及氨基酸態(tài)氮含量測定。結果表明，米曲霉的中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力最高，分別為632 U/g和416 U/g。黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力及氨基酸態(tài)氮能力遠高于米曲霉和毛霉，酸性蛋白酶高達872 U/g，氨基酸態(tài)氮含量高達0.997 5 g/100 g。而毛霉產(chǎn)的3種蛋白酶活力均在中間值，可起到一定的補充作用。

霉豆瓣；微生物；分離及篩選；蛋白酶活力

豆瓣醬是由各種微生物相互作用，產(chǎn)生復雜生化反應釀造出來的一種調(diào)味料，能助消化，開口味，深受消費者歡迎[1]。四川豆瓣更是具有二百余年悠久歷史，可直接佐餐，亦是川菜烹調(diào)中必不可少的調(diào)味品[2]。蠶豆的發(fā)酵是釀制豆瓣醬過程中的一道關鍵步驟，它的發(fā)酵產(chǎn)物霉豆瓣的品質(zhì)將直接影響豆瓣醬的質(zhì)量。然而霉豆瓣的品質(zhì)很大程度上受到其中微生物的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，豆瓣自然發(fā)酵過程中，從醬曲中分離所得到的霉菌是在制曲過程中起主要作用的功能菌種。霉菌經(jīng)鑒定最主要的是米曲霉，其次是醬油曲霉、高大毛霉及黑曲霉等[3]。

蛋白酶是各類霉菌尤其是米曲霉所產(chǎn)酶系中最重要的酶之一，直接影響原料的蛋白質(zhì)利用率和最終產(chǎn)品的風味[4]。其中，中性蛋白酶是一類在中性pH條件下作用于蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白酶，可將蛋白質(zhì)水解成多肽或游離氨基酸[5]。酸性蛋白酶有利于提高氨基酸生成率，增加風味。堿性蛋白酶對底物蛋白的水解程度、對水解物產(chǎn)生的獨特風味和脫苦味起著關鍵作用[6]。蛋白酶可將豆類中的蛋白質(zhì)降解成多肽、氨基酸等可溶性氮物，對產(chǎn)品的產(chǎn)率和風味起著重要的作用。提高蛋白酶活力，可以提高原料的利用率，降低生產(chǎn)周期，降低成本[7]。氨基酸態(tài)氮(amino acid nitrogen ,AN)是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，是評價調(diào)味食品的質(zhì)量及營養(yǎng)價值的一項主要指標，在發(fā)酵性食品的分析中有重要意義[8]。

本實驗通過對霉豆瓣中微生物的分離、篩選，得到品質(zhì)優(yōu)良的微生物菌株，對其進行形態(tài)和分子生物學鑒定，并對優(yōu)勢菌株進行蛋白酶活力及氨基酸態(tài)氮含量測定。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 主要材料

市售霉豆瓣(2種，5月份購買，取樣1 kg，-20 ℃保藏)、干蠶豆顆粒、干麩皮。

1.1.2 主要試劑

36%甲醛溶液；0.05、0.1 mol/L NaOH溶液；生理鹽水；福林-酚試劑；0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)溶液；0.4 mol/L Na2CO3溶液；pH 7.5的磷酸緩沖液；pH 3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液；pH 10.5的硼砂-氫氧化鈉緩沖液；2%酪蛋白底物緩沖液；100 μg/mL酪氨酸溶液。以上試劑均為實驗室自配，分析純。

1.2主要培養(yǎng)基

孟加拉紅(虎紅)培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。以上所涉及生化試劑均為分析純。

1.3儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；SNH-160生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；JM-B10002電子天平，諸暨市超澤衡器設備有限公司；BCD-216TXN電冰箱，青島海爾股份有限公司；TGL16M高速冷凍離心機，長沙湘南離心機；752型紫外分光光度計，上海分析儀器廠；DZKW-5-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；CX21FS1光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；85-2恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇市雙捷實驗儀器廠；pHS-4C+型酸度計，成都世紀方舟科技公司。

1.4試驗方法

1.4.1 菌株的分離、純化

取10 g預處理的霉豆瓣樣品，加入到90 mL已滅菌的生理鹽水中，制成1∶10的均勻稀釋液，再依次進行10倍遞增稀釋，稀釋至10-6后，取不同稀釋度的液體均勻涂布于虎紅培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基中，分離其中的真菌和細菌。放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待出現(xiàn)單菌落后，進行菌種擴大培養(yǎng)，反復2～3次，獲得單菌種的純培養(yǎng)基。

1.4.2 發(fā)酵劑的制備

從菌種的純化培養(yǎng)基中取2～3環(huán)霉菌孢子接種到滅菌的麩皮(10 g麩皮、10 mL蒸餾水)中，置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，米曲霉、黑曲霉于30 ℃培養(yǎng)48 h，毛霉于20 ℃培養(yǎng)60 h，期間扣瓶1次，待其長滿孢子后，用牛皮紙包好整塊麩皮置于45～50 ℃的烘箱中烘干24 h，即可制得霉菌發(fā)酵劑[9]。

在每次使用發(fā)酵劑前均需要使用血球計數(shù)板法計算霉菌孢子數(shù)。使用時采用稱重方式確定接種量。

1.4.3 優(yōu)勢菌株的篩選

回接實驗：干蠶豆→清洗→浸泡→滅菌→接種供試菌株→發(fā)酵→結果觀察和記錄。

工藝要點：浸泡時按照干蠶豆10 g，蒸餾水10 mL進行。

在30 ℃下恒溫培養(yǎng)，每隔6 h進行拍照，測定其感官指標，以未接種指示菌的樣品作為對照，取綜合評分高者為優(yōu)勢菌株。

感官指標的檢測包括色澤、氣味、組織形態(tài)。霉豆瓣的感官評價標準目前沒有行業(yè)通用標準，故本實驗采用市售品質(zhì)最優(yōu)的成熟霉豆瓣(米曲霉為主要發(fā)酵菌種)作為參照制定評分標準。

霉豆瓣的感官要求應符合表1標準。

表1 霉豆瓣感官評價標準

1.4.4 優(yōu)勢菌株的分子生物學鑒定

通過試劑盒法來提取微生物基因組DNA[10-12]，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳(180 V，20 min)檢測后，在PCR反應體系(如表2所示)擴增，空白對照不加入模板。

表2 PCR反應體系

細菌16S rDNA序列的擴增正向引物為27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物為1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；真菌18SrDNA序列的擴增正向引物為EF-3(5’-GGAAGGG(G/A)TGTATTTATTAG-3’)，反向引物為EF-4(5’-TCCT(A/C)TAAATGACCAAGTTTG-3’)。

PCR反應體系30 μL：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min；PCR產(chǎn)物4 ℃保存，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(180 V，20 min)后送檢測序。

將測定結果在GeneBank中通過Blast進行基因?qū)Ρ?，獲得相似度最高的序列進行序列相似性分析[13]，再將檢測送回的堿基序列轉(zhuǎn)化為文本格式文件后，用軟件MEGA7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.5 不同溫度下接種不同微生物對霉豆瓣蛋白酶活性的測定

設置15、20、25、30、35、40 ℃等間隔溫度梯度，每隔6 h對加入優(yōu)勢菌株發(fā)酵劑的霉豆瓣進行感官測評并拍照記錄(培養(yǎng)至216 h)。培養(yǎng)完畢后，對不同霉豆瓣樣品進行蛋白酶活力及氨基酸態(tài)氮含量測定。以確定不同微生物蛋白酶活性最佳的溫度條件。

1.4.6 30 ℃恒溫條件下接種不同微生物對霉豆瓣蛋白酶活性的測定

經(jīng)查找文獻，本實驗采用30 ℃作為培養(yǎng)溫度。大部分資料顯示，該溫度為豆瓣的工業(yè)制曲的常用溫度。對30 ℃下培養(yǎng)30、36、42、48、54、60 h的優(yōu)勢菌株進行蛋白酶活力及氨基酸態(tài)氮含量測定。

1.5分析檢測方法

1.5.1 蛋白酶活力測定

粗酶液制備：取1 g霉豆瓣樣品，加入20 mL緩沖液，于40 ℃水浴浸提1 h，后于4 000 r/min，25 ℃條件下離心10 min，取上清液待用。

其中，酸性蛋白酶應采用pH 3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液；中性蛋白酶采用pH 7.5的磷酸緩沖液；堿性蛋白酶則采用pH 10.5的硼砂-氫氧化鈉緩沖液。緩沖液用于浸提蛋白酶和后續(xù)蛋白酶活力的測定。

酶活測定法：采用福林酚法測定樣品霉豆瓣中的中性、酸性及堿性蛋白酶活力[14]，在40 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位(U/g)。

1.5.2 氨基酸態(tài)氮含量測定

樣品制備：取5 g霉豆瓣樣品，加入30 mL蒸餾水，煮沸2～3 min，后定容至100 mL，放置待用。

檢測方法：采用甲醛滴定法測定樣品霉豆瓣中的氨基酸態(tài)氮含量[15]。

1.5.3 孢子數(shù)含量測定

血球計數(shù)板法[16]。稱取發(fā)酵劑0.04 g，加入5 mL 95%乙醇溶液，再加入10 mL 1∶10稀硫酸，最后加入20 mL蒸餾水，搖勻。用磁力攪拌器攪拌30 min以上，直至樣品溶于水，定容至250 mL。后調(diào)試顯微鏡，將蓋玻片蓋在計數(shù)板上，向蓋玻片上側(cè)(即計數(shù)板磨砂處)滴加試樣液體。待試樣潤濕整個計數(shù)板，將計數(shù)板放置于顯微鏡下，從低倍至高倍調(diào)節(jié)清晰程度，至能看清計數(shù)板每個線條。記錄5個中格即左上、左下、右上、右下和中間的孢子數(shù)。重復2次取平均值，即得到發(fā)酵劑的孢子數(shù)含量。孢子數(shù)計算公式(1)如下：

(1)

式中：N表示5個中格內(nèi)的孢子數(shù)總和，個；n表示稀釋倍數(shù)。

2 結果與討論

2.1優(yōu)勢菌株的分離

從霉豆瓣樣品中分離出5種微生物，編號為M1～M5。分離情況見圖1。

圖1 霉豆瓣樣品中微生物的分離情況Fig.1 Separation of the microorganisms from moldy bean samples

2.2優(yōu)勢菌株的篩選

將M1～M5分別回接至豆瓣上發(fā)酵，進行感官評定。感官評分結果如表3。

表3 感官評分結果

續(xù)表3

編號色澤氣味組織形態(tài)感官評分M38262660M458518M544412

本實驗所采用的感官評分表主要參考市場上普遍采用的感官評價標準。該標準是以米曲霉作為主要發(fā)酵菌種而設計的。通過感官評分結果可以得出，M1、M2、M3為霉豆瓣中的優(yōu)勢菌株。M1呈黑色，回接到蠶豆上經(jīng)發(fā)酵后所得霉豆瓣為黑褐色，色澤均勻，有一定發(fā)酵香味，組織均勻。M2呈黃綠色，回接到蠶豆上經(jīng)發(fā)酵后所得霉豆瓣也呈黃綠色，色澤均勻，有特定香味，組織均勻較硬。M3呈白色，回接到蠶豆上經(jīng)發(fā)酵后所得霉豆瓣呈白色略帶灰色，色澤均勻無雜色，有一定香味，組織均勻較硬，蠶豆粒不太松散。圖2為霉豆瓣中優(yōu)勢菌株的回接情況。

a-M1; b-M2; c-M3圖2 優(yōu)勢菌株的回接情況Fig.2 Tieback of the dominant strains

2.3優(yōu)勢菌株的分子生物學鑒定

在液體PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)待提取總DNA的菌株24 h，將試劑盒提取好的總DNA進行凝膠電泳，進行PCR擴增(注：M1、M2和M3三種優(yōu)勢菌株總DNA進行18rDNA擴增，擴增正向引物為EF-3，反向引物為EF-4)，擴增后的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，在凝膠成像儀中進行觀察。

得到M1、M2和M3的18rDNA序列后，通過clustalx2.1軟件與標準菌株進行比對分析，比對結果應用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖3清晰的展示了M1、M2和M3的分子鑒定結果，M2、M3和M1

分別與米曲霉(Aspergillusoryzae)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegant)和黑曲霉(Aspergillusniger)聚成在同一個分支上，由此確定M1、M2和M3分別為黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和雅致放射毛霉(Actinomucorelegant)。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree

2.4優(yōu)勢菌株的理化指標測定

2.4.1 不同溫度下霉豆瓣蛋白酶活力及氨基酸態(tài)氮含量變化

2.4.1.1 蛋白酶活力

在霉豆瓣的制作過程中，菌株的各類蛋白酶產(chǎn)生能力是影響霉豆瓣生產(chǎn)的重要條件之一。本實驗考察了15、20、25、30、35、40 ℃ 6個溫度梯度下接種不同微生物的霉豆瓣成熟時間及成熟霉豆瓣酸性、中性及堿性蛋白酶的活力。結果見表4、表5、表6。

表4 不同溫度梯度下接種不同霉菌霉豆瓣成熟時間及其酸性蛋白酶活力

從表4可看出，黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力最高，為671 U/g，最高時可達毛霉的2倍和米曲霉的4倍左右，其達到成熟的時間較短，僅有48 h。毛霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力位居第2，為394 U/g，發(fā)酵時間達到66 h；米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力最低，在發(fā)酵108 h后才達到其最高值173 U/g。

從表5可看出，3種曲霉發(fā)酵過程中，產(chǎn)中性蛋白酶活力最高為米曲霉，最高在15 ℃時可達987 U/g，但其達到成熟的時間較長，足有180 h。其次產(chǎn)中性蛋白酶活較高的是毛霉，最高為325 U/g，最后是黑曲霉，93 U/g。毛霉和黑曲霉達到最大值所需要的發(fā)酵時間也分別達到了66 h與102 h。

表5 不同溫度梯度下接種不同霉菌霉豆瓣成熟時間及其中性蛋白酶活力

從表6可看出，米曲霉最高產(chǎn)堿性蛋白酶活力為626 U/g，發(fā)酵時間長達180 h。黑曲霉和毛霉幾乎不產(chǎn)或產(chǎn)量偏低。

表6 不同溫度梯度下接種不同霉菌霉豆瓣成熟時間及其堿性蛋白酶活力

綜上，上述所得霉豆瓣成熟時間可作為工業(yè)生產(chǎn)達到發(fā)酵終點時的參考時間。同樣，從數(shù)據(jù)中看出，米曲霉主要產(chǎn)生中性蛋白酶和堿性蛋白酶，酸性蛋白酶活力較低。而黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力很高，毛霉產(chǎn)生的各類蛋白酶活力均處于中間值，可有很好的補充作用。由于產(chǎn)生各類酶活最高值所需要的發(fā)酵溫度大多都偏低，發(fā)酵時間較長，不太符合工業(yè)快速生產(chǎn)的需要；而發(fā)酵溫度過高則會使發(fā)酵好的霉豆瓣在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生品質(zhì)劣變，不利于生產(chǎn)控制，故綜合起來選擇在30 ℃對不同發(fā)酵時間的霉豆瓣進行蛋白酶活力和氨基酸態(tài)氮含量測定。

2.4.1.2 氨基酸態(tài)氮含量

本實驗考察了3種曲霉在15、20、25、30、35、40 ℃這6個溫度梯度下進行培養(yǎng)，霉豆瓣成熟時的氨基酸態(tài)氮含量(圖4)。

3種曲霉在發(fā)酵過程中，黑曲霉產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮的量最大，在35 ℃時可達1.078 g/100g；米曲霉與毛霉產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮的量相對黑曲霉低些，兩者產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮的量相近，米曲霉在20 ℃時最高，為0.507 5 g/100 g，毛霉在35 ℃時最高，為0.511 7 g/100 g；黑曲霉在產(chǎn)量最高時，可達米曲霉與毛霉產(chǎn)量的2倍左右。

圖4 不同溫度梯度下的氨基酸態(tài)氮含量Fig.4 Amino acid nitrogen content under different temperature gradient

2.4.2 30 ℃恒溫條件下霉豆瓣蛋白酶活力及氨基酸態(tài)氮含量變化

2.4.2.1 蛋白酶活力

本實驗考察了3種曲霉在30 ℃恒溫培養(yǎng)下，因培養(yǎng)時間的延長而產(chǎn)生的酸性、中性和堿性蛋白酶活力變化情況。結果見圖5、圖6和圖7。

圖5 酸性蛋白酶活力變化Fig.5 Change of acidic protease activity

從圖5看出，黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力較高，產(chǎn)酶高峰在36～48 h，在42 h出現(xiàn)最高值，酶活量高達872 U/g。其次產(chǎn)酸性蛋白酶活力較高的為毛霉，產(chǎn)酶高峰在36～48 h，于36 h出現(xiàn)高峰值，其酶活量約為黑曲霉的一半，而米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶酶活最低，并在54 h才達到峰值。

圖6 中性蛋白酶活力變化Fig.6 Change of neutral protease activity

從圖6可看出，米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶活力最高，并在54 h時出現(xiàn)最高值，產(chǎn)酶高峰在48～54 h，中性蛋白酶最高達632 U/g。毛霉產(chǎn)中性蛋白酶活力相比米曲霉較低，產(chǎn)酶高峰在50～60 h，同樣在54 h時出現(xiàn)最高值，蛋白酶活達到304 U/g，其活力為米曲霉的一半。黑曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的酶活最少，產(chǎn)酶高峰在42～54 h，在48 h出現(xiàn)最高值。

圖7 堿性蛋白酶活力變化Fig.7 Change of alkaline protease activity

由圖7的堿性蛋白酶的酶活曲線可看出，米曲霉的酶活最高(416 U/g)，且其產(chǎn)酶高峰在36～48 h，后隨時間的增加產(chǎn)堿性蛋白酶活力逐漸降低，產(chǎn)酸性蛋白酶活力逐漸升高。黑曲霉產(chǎn)堿性蛋白酶活力在30～54 h的發(fā)酵時間內(nèi)極低，超過54 h后隨著時間的增加，堿性蛋白酶活力增加，此時黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力下降。所測得黑曲霉堿性蛋白酶活力為負值可能是由于樣品中堿性蛋白酶活力過低，沒有進行適當?shù)臐饪s，而雜質(zhì)氨基酸較高，酶水解的酪蛋白可以忽略，導致測定值為負值。毛霉產(chǎn)生的3種蛋白酶活力均在中間值，其產(chǎn)酸性和中性蛋白酶活力曲線與米曲霉類似，產(chǎn)堿性蛋白酶活力曲線與黑曲霉類似。

2.4.2.2 氨基酸態(tài)氮含量

本實驗考察了3種曲霉在30 ℃恒溫培養(yǎng)下，因培養(yǎng)時間的延長而產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量變化情況。

從圖8可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，3種曲霉產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮的量逐漸增大，黑曲霉、米曲霉、毛霉3者達到峰值的時間(氨基酸態(tài)氮含量)分別為48 h(0.997 5 g/100 g)、54 h(0.458 5 g/100 g)、54 h(0.322 0 g/100 g)；繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，氨基酸態(tài)氮含量逐漸降低；氨基酸態(tài)氮含量最高的是黑曲霉，其次為米曲霉和毛霉，在48 h時，黑曲霉的氨基酸態(tài)氮含量(0.997 5 g/100 g)最高，是米曲霉(0.331 1 g/100 g)和毛霉(0.311 5 g/100 g)的3倍左右。

圖8 氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.8 Change of amino acid nitrogen content

一般來講，霉豆瓣中蛋白質(zhì)含量越高，蛋白酶的活性越高，蛋白質(zhì)利用率就越高，產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮的含量也越高。其中黑曲霉酸性蛋白酶活力整體高于米曲霉和毛霉，在42 h有最大值，因此產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮的含量也高于其余二者，且在48 h有最大值。

3 結論

將市售霉豆瓣中的微生物進行分離篩選所得的米曲霉、黑曲霉和毛霉進行單菌種回接，在不同溫度和同溫度不同時間下進行恒溫發(fā)酵，對霉豆瓣蛋白酶活力和氨基酸態(tài)氮含量進行分析。其中蛋白酶活力方面，黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力遠高于米曲霉和毛霉，酸性蛋白酶高達872 U/g。而米曲霉的中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力最高，分別為632、416 U/g。而毛霉產(chǎn)的3種蛋白酶活力均在中間值。氨基酸態(tài)氮含量方面，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)的氨基酸態(tài)氮含量最高，最高可達0.997 5 g/100g，而米曲霉和毛霉產(chǎn)氨基酸態(tài)氮曲線相近，量差不大。

綜上，米曲霉作為主要發(fā)酵菌種，產(chǎn)中性及堿性蛋白酶能力強；黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶和氨基酸態(tài)氮含量遠高于其余二者，有補足酶系不全及風味不足的作用。毛霉產(chǎn)蛋白酶活力均衡，酸性、中性及堿性蛋白酶活力處于中間值，產(chǎn)氨基酸態(tài)氮能力雖沒有黑曲霉強，但勝在穩(wěn)定，可起到一定的補充作用。3種菌對豆瓣的發(fā)酵均有增益作用，通過對理化指標的檢測，結合感官評價，可為下一步復合菌發(fā)酵、克服單菌株發(fā)酵酶系不均衡問題提供一定的基礎，可進一步進行實驗。

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Determinationofproteaseactivityofdominantmicroorganismfrommoldybean

MEI Yuan,TANG Jia-ying,HE Hui-rong,AO Xiao-lin*

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Selecting 2 kinds of moldy bean commercially available as the research objects to isolate the microorganisms, according to the tieback fermentation experiment, the dominant strains M1(Aspergillusniger), M2(Aspergillusoryzae), and M3(Actinomucorelegant) were screened out. Then protease activity and amino acid nitrogen content of excellent strains were determined. Results showed thatAspergillusoryzaehad the highest activity of neutral and alkaline protease, which was 632 and 416 U/g respectively. Acidic protease activity and amino acid nitrogen content inAspergillusnigerwere much higher than those inAspergillusoryzaeandActinomucorelegant, which were 872 U/g and 0.997 5g/100g, respectively. AndActinomucoreleganthad balanced ability to produce these 3 proteases, which could play a supplementary role.

moldy bean; microorganism; isolation and screening; protease activity

大學本科(敖曉琳副教授為通訊作者,E-mail：huavslin@163.com)。

國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510626032)

2017-04-12，改回日期：2017-05-16

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014512