向緒穩(wěn)，劉星宇，陶輝，崔紫寧，張煉輝

1 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642

2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642

3 廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642

環(huán)二鳥(niǎo)苷酸信號(hào)分子抑制劑的研究進(jìn)展

向緒穩(wěn)1,2,3，劉星宇1,2,3，陶輝1,2,3，崔紫寧1,2,3，張煉輝1,2,3

1 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642

2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642

3 廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642

環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(Bis-(3′-5′)cyclic diguanylic acid,c-di-GMP)是細(xì)菌所特有的一類核酸類第二信使，參與并調(diào)節(jié)細(xì)菌多種生理功能，包括細(xì)胞分化、生物被膜的形成以及致病因子的產(chǎn)生等。阻斷c-di-GMP信號(hào)的傳導(dǎo)對(duì)于發(fā)展新型抗菌藥物具有重要的意義?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，基于c-di-GMP調(diào)控的信號(hào)通路開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物具有3類潛在的靶點(diǎn)，分別是c-di-GMP合成酶(DGCs)、c-di-GMP降解酶(PDEs)以及c-di-GMP受體。文中根據(jù)上述3類關(guān)鍵靶點(diǎn)，介紹了相關(guān)小分子抑制劑的研究進(jìn)展，并展望了c-di-GMP信號(hào)分子抑制劑的發(fā)展方向。

環(huán)二鳥(niǎo)苷酸，二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，磷酸二酯酶，受體，抑制劑

環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(Bis-(3′-5′)cyclic diguanylic acid,c-di-GMP)是一類非常重要的核酸類第二信使，普遍存在于各種細(xì)菌中，參與并調(diào)節(jié)細(xì)菌多種生理功能，其對(duì)細(xì)胞分化、生物被膜的形成以及致病因子的產(chǎn)生等有著重要的調(diào)節(jié)作用。闡明c-di-GMP對(duì)細(xì)菌生理活動(dòng)的調(diào)控機(jī)理，對(duì)于尋找新的作用靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物和解決細(xì)菌耐藥問(wèn)題具有非常重要的意義。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明：c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)通路由4部分組成(圖1)：1)感應(yīng)外界信號(hào)而促進(jìn)c-di-GMP合成的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(Diguanylate cyclases, DGCs)；2)降解c-di-GMP的磷酸二酯酶(Phosphodiesterases, PDEs)；3)結(jié)合c-di-GMP的效應(yīng)分子(Effectors)；4)受效應(yīng)分子直接調(diào)控的下游靶標(biāo)(Targets)。細(xì)菌通過(guò)二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶GGDEF和磷酸二酯酶 EAL結(jié)構(gòu)域 N-末端相連的感受結(jié)構(gòu)域接收外來(lái)信號(hào)[1-2]，并通過(guò)兩種酶的拮抗作用調(diào)節(jié)細(xì)菌內(nèi)c-di-GMP的水平。二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶對(duì)c-di-GMP的合成和降解作用是整個(gè)信號(hào)通路的核心。

圖1 c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路及對(duì)應(yīng)的抑制劑Fig.1 Thec-di-GMP mediated signaling pathway and the corresponding inhibitors.DGCs and PDEs respond to different input signals through their amino-terminal sensory domains and balance thec-di-GMP level by their antagonistic activities.Multiple numbers of DGCs and PDEs are often found associated with sensor domains such as PAS for sensing gaseous ligands such as O2, CO2, NO etc.and BLUF for sensing light.

由于c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)通路與細(xì)菌的多種生理活動(dòng)有密切關(guān)系，因此，阻斷c-di-GMP信號(hào)的傳導(dǎo)對(duì)于發(fā)展新型抗菌藥物具有重要的意義。從c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)通路可以看出，基于c-di-GMP調(diào)控的信號(hào)通路開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物具有3類潛在的靶點(diǎn)，分別是c-di-GMP合成酶抑制劑、c-di-GMP降解酶抑制劑以及c-di-GMP受體抑制劑。本文將根據(jù)上述3類關(guān)鍵靶點(diǎn)，介紹相關(guān)小分子抑制劑的研究進(jìn)展。

1 c-di-GMP合成酶(二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶)抑制劑的研究進(jìn)展

c-di-GMP作為細(xì)菌的第二信使，其在細(xì)菌內(nèi)是級(jí)聯(lián)式傳導(dǎo)。因此，相比于直接作用于c-di-GMP的下游靶點(diǎn)，控制其內(nèi)源合成顯得更加高效。二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶是合成c-di-GMP的關(guān)鍵酶，該酶催化2分子的鳥(niǎo)苷三磷酸(Guanosinetriphosphate，GTP)生成1分子的c-di-GMP并釋放2分子的焦磷酸鹽?，F(xiàn)有的研究表明，大部分的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶具有GGDEF或 GGEEF結(jié)構(gòu)域[3-5]，該結(jié)構(gòu)域是其催化的活性位點(diǎn)(A-site)；除該活性位點(diǎn)外，一些二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶還具有抑制位點(diǎn)(I-site)，c-di-GMP 能夠以二聚體的形式與I位點(diǎn)或A位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的活性[6-7]，這種反饋抑制不僅能夠有效地避免GTP的過(guò)度消耗，而且還能維持胞內(nèi)c-di-GMP水平的穩(wěn)定[8]。迄今為止，研究人員已經(jīng)合成并篩選出一批能夠抑制二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的小分子化合物，按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以分為3類：環(huán)狀二核苷酸衍生物、電中性核苷酸衍生物和非核苷酸類化合物。

1.1 環(huán)狀二核苷酸衍生物

酶的催化活性受其所催化反應(yīng)的產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)，二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶同樣如此。因此，環(huán)二鳥(niǎo)苷酸及其衍生物是一種潛在的DGCs抑制劑，通過(guò)對(duì)c-di-GMP的衍生不僅有利于發(fā)現(xiàn)新的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑，而且還有利于弄清楚c-di-GMP與二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶作用的分子機(jī)制。近年來(lái)，研究人員已經(jīng)設(shè)計(jì)合成出許多環(huán)狀二核苷酸類化合物，包括堿基的替換、磷酯鍵和糖基的修飾等。

早在2010年，Ching等[9]就已經(jīng)合成了一系列不同堿基的環(huán)狀二核苷酸，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)二肌苷酸(c-di-IMP，圖2)能夠抑制集胞藻Synechocystissp.的環(huán)二鳥(niǎo)苷酸合成酶Slr1143，并且抑制作用明顯高于c-di-GMP，從而導(dǎo)致對(duì)生物被膜的形成具有較好的抑制作用。

圖2 環(huán)狀二核苷酸類抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)[9-10]Fig.2 The chemical structures of cyclic dinucleotide inhibitors[9-10].

2013年，Sintim 課題組[10]通過(guò)分析c-di-GMP與DGC、PDE和PilZ蛋白的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)c-di-GMP糖基的2′-OH對(duì)于結(jié)合代謝酶和受體蛋白PilZ具有非常重要的作用。在此基礎(chǔ)上，他們?cè)O(shè)計(jì)并合成了3種2′位取代基不同的化合物，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2′位被氟原子取代的衍生物2′-F-c-di-GMP(圖2)對(duì)銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶WspR具有很好的抑制作用，其對(duì)二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的抑制作用是c-di-GMP的4倍。但是，該衍生物缺乏很好的選擇性，實(shí)驗(yàn)表明該化合物對(duì)磷酸二酯酶RocR也具有很強(qiáng)的抑制作用(IC50=0.7μmol/L)。

彌散序列核磁共振譜(DOSY)表明c-di-GMP五元糖環(huán)2號(hào)位羥基的改變并不影響其聚合狀態(tài)。因此，他們認(rèn)為2′-F-c-di-GMP可能是以二聚體的狀態(tài)結(jié)合二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的抑制位點(diǎn)而產(chǎn)生抑制作用。

1.2 電中性核苷酸類似物

由于環(huán)二鳥(niǎo)苷酸類似物具有負(fù)電性，相比于中性分子來(lái)說(shuō)，帶電的化合物更不易通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的形式進(jìn)入細(xì)胞[11-12]。在這種情況下，電中性的核苷酸衍生物顯得尤為重要。

2015年，F(xiàn)ernicola等[13]對(duì)環(huán)二鳥(niǎo)苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一次大膽的改造，將整個(gè)磷酸酯鍵用非經(jīng)典的生物電子等排體1,2,3-三氮唑替換，并且從中篩選出了2個(gè)電中性的磷酸二酯酶抑制劑DCI061和DCI058(圖3)。實(shí)驗(yàn)顯示，這兩個(gè)化合物不僅能夠抑制新月柄桿菌Caulobacter crescentus的環(huán)二鳥(niǎo)苷酸合成酶(PleD)的活性，而且對(duì)銅綠假單胞菌的磷酸二酯酶(RocR)也具有抑制作用。其中，DCI058對(duì)新月柄桿菌環(huán)二鳥(niǎo)苷酸合成酶(PleD)的抑制作用遠(yuǎn)強(qiáng)于其對(duì)磷酸二酯酶RocR的抑制作用。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DCI061對(duì)I位點(diǎn)退化的環(huán)二鳥(niǎo)苷酸合成酶基本沒(méi)有抑制作用。由此，他們推斷該化合物通過(guò)結(jié)合二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的I位點(diǎn)而抑制酶的活性。

圖3 電中性核苷酸類抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)[13]Fig.3 The chemical structures of the neutral nucleotide inhibitors[13].

1.3 非核苷酸類

早在1998年，Ohana等[14]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，豌豆的粗提物能夠抑制木醋桿菌Acetobacter xylinum環(huán)二鳥(niǎo)苷酸酶的活性。他們通過(guò)分離純化該粗提物得到了幾種五環(huán)三萜類化合物，并通過(guò)活性測(cè)試確定其中的三萜皂苷類化合物(GTS，圖5)對(duì)木醋桿菌環(huán)二鳥(niǎo)苷酸酶具有抑制作用。同一年，Ohana等又發(fā)現(xiàn)球孢阜孢霉Papularia sphaerosperma的次生代謝產(chǎn)物阜孢霉素B(Papulacandin B)(圖5)也能夠抑制木醋桿菌DGCs的活性[15]。

最近幾年，隨著基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選、高通量篩選以及基于片段的藥物設(shè)計(jì)等手段的廣泛應(yīng)用，一批全新的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶小分子抑制劑被發(fā)現(xiàn)。篩選得到的一些小分子化合物不僅能夠抑制二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的活性，同時(shí)能夠?qū)?xì)菌的表型產(chǎn)生影響。

2014年，Sambanthamoorthy等[16]通過(guò)一種基于藥效團(tuán)的高通量篩選發(fā)現(xiàn)了4個(gè)能夠抑制鮑氏不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumannii和銅綠假單胞菌二鳥(niǎo)核苷酸環(huán)化酶(DGCs)的化合物(LP1062、LP3134、LP3145、LP4010，圖5)。研究顯示，4個(gè)化合物都能夠分散銅綠假單胞菌已經(jīng)形成的生物被膜。其中，LP-3134還能夠影響銅綠假單胞菌的黏附作用以及生物被膜的形成。

2016年，F(xiàn)ernicola等[17]以新月柄桿菌二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶PleD的3D結(jié)構(gòu)(PDB:2V0N[18]和4H54[19])為基礎(chǔ)，運(yùn)用虛擬篩選的方法，對(duì)ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中的2.3×107個(gè)化合物進(jìn)行了篩選，最終得到7個(gè)具有潛在抑制活性的磺酰肼Schiff堿類化合物。但是，最終的活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)顯示僅有化合物2(IC50=(11.1±1.2)μmol/L)和化合物7(IC50=(11.1±1.1)μmol/L)(圖4)對(duì) PleD 具有很好的抑制作用。隨后，他們利用分子對(duì)接模擬了化合物2和7與PleD蛋白活性腔的互作模式。結(jié)果顯示，苯磺?；江h(huán)上的硝基與磺酸基團(tuán)上的氧原子分別與關(guān)鍵氨基酸活性位點(diǎn) R366和N335形成氫鍵，對(duì)該化合物結(jié)合酶的活性位點(diǎn)是必不可少的。同時(shí)，芐基苯環(huán)上3、4號(hào)位的2個(gè)羥基則與Mg2+發(fā)生螯合作用，從而抑制了該位點(diǎn)結(jié)合三磷酸腺苷(GTP)并催化形成磷酸酯鍵的能力(圖4)。

圖4 化合物2和PleD的晶體互作結(jié)構(gòu)[17]Fig.4 Molecular simulation of compound2 with PleD[17].

過(guò)去的研究表明，傳統(tǒng)的高通量篩選和基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選不僅需要分離純化相應(yīng)蛋白，而且經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，因此，開(kāi)發(fā)合適的篩選方法顯得尤為重要。

在2012年，Sambanthamoorthy 等[20]利用霍亂弧菌Vibrio cholerae中高濃度的c-di-GMP抑制熒光素酶 VC1673-lux[21]的表達(dá)這一特性篩選得到了7個(gè)能夠抑制霍亂弧菌二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的小分子拮抗劑，進(jìn)而對(duì)霍亂弧菌生物被膜的形成產(chǎn)生抑制作用。該篩選方法不需要分離純化DGCs蛋白，大大提高了篩選效率。在這7個(gè)小分子化合物中，有2個(gè)(DI-3和DI-10，圖5)能夠通過(guò)抑制二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶顯著降低霍亂弧菌細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的含量。

實(shí)驗(yàn)表明，化合物 DI-3不僅對(duì)霍亂弧菌生物被膜的形成有抑制作用，而且對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的形成表現(xiàn)出同樣的抑制作用，表現(xiàn)出廣譜的抗生物被膜活性。

2014年，Lieberman等[22]通過(guò)基于微分徑向毛細(xì)管作用的配體分析方法(Differential radial capillary action of ligand assay, DRaCALA)[23-24]，篩選得到了依布硒啉(Eb)和依布硒啉氧化物(EbO)兩個(gè)二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的抑制劑(圖5)，依布硒啉和布硒啉氧化物對(duì)銅綠假單胞菌的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶WspR和新月柄桿菌的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶 PleD都具有很好的抑制活性。通過(guò)進(jìn)一步的研究，他們推測(cè)依布硒啉(Eb)和依布硒啉氧化物(EbO)可能是通過(guò)共價(jià)結(jié)合位于 DGC酶的活性位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基而抑制二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的活性。雖然實(shí)驗(yàn)證明依布硒啉和布硒啉氧化物能夠抑制新月柄桿菌和銅綠假單胞菌中二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的活性，但是表型實(shí)驗(yàn)顯示：Eb和EbO僅能夠改變銅綠假單胞菌PA14菌株的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和生物被膜的形成，而對(duì)新月桿菌生物被膜的形成并沒(méi)有影響。

圖5 非核苷酸類抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)[14-17,20,22]Fig.5 The chemical structures of non-nucleoside inhibitors[14-17,20,22].

2 c-di-GMP降解酶(磷酸二酯酶)抑制劑的研究進(jìn)展

磷酸二酯酶(PDEs)具有水解第二信使的功能，存在多種亞型。細(xì)菌內(nèi)負(fù)責(zé)降解c-di-GMP的磷酸二酯酶(PDEs)一般含有 EAL結(jié)構(gòu)域或者 HD-GYP結(jié)構(gòu)域，其中 EAL結(jié)構(gòu)域水解c-di-GMP為2分子GMP[25-26]；HD-GYP則水解其為鏈狀二核苷酸5′-pGpG[27]；磷酸二酯酶(PDEs)是控制c-di-GMP代謝的關(guān)鍵酶。因此，該酶也是開(kāi)發(fā)c-di-GMP信號(hào)分子抑制劑的重要作用靶點(diǎn)之一。

第一個(gè)能夠選擇性抑制磷酸二酯酶(PDEs)活性的化合物是 Sintim 課題組[28]設(shè)計(jì)合成的endo-S-c-di-GMP(圖6)，其僅對(duì)銅綠假單胞菌的磷酸二酯酶RocR具有很明顯的抑制作用，而對(duì)DGC蛋白WspR和PilZ蛋白Alg44沒(méi)有任何影響；根據(jù)c-di-GMP與DGC、PilZ以及PDE活性腔結(jié)合的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB：3I5A[4]、3KYF[29-30]、3HV8[31-32]、3N3T[33])，他們認(rèn)為：相比于c-di-GMP，endo-S-c-di-GMP在一價(jià)金屬存在的溶液中大多以單體的形式存在，這種單體的“開(kāi)放”狀態(tài)對(duì)于結(jié)合DGCs的GGDEF結(jié)構(gòu)域和PilZ是不利的，而對(duì)于結(jié)合磷酸二酯酶RocR的EAL結(jié)構(gòu)域是有利的。因此，該化合物表現(xiàn)出很好的選擇性。在隨后的研究中Sintim課題組也發(fā)現(xiàn)c-di-GMP衍生物2′-H-c-di-GMP和2′-OMe-c-di-GMP(圖6)對(duì)磷酸二酯酶 RocR具有一定的抑制作用[10]。

2013年，Strobel課題組[34]在研究環(huán)二鳥(niǎo)苷酸衍生物對(duì)磷酸二酯酶 EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的耐受性時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙取代的硫代磷酸酯衍生物c-(RPRP)-di-Gps/c-(RPSP)-di-Gps(圖6)能夠抵抗磷酸二酯酶的水解作用，并且仍然可以結(jié)合c-di-GMP核糖開(kāi)關(guān)。緊接著他們?cè)诖嘶A(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了電中性的2′-H的甲基磷酸酯類化合物c-di-dGp(Me)-Ⅰ/c-di-dGp(Me)-Ⅱ(圖6)，該衍生物同樣能夠抵抗磷酸二酯酶的水解作用和結(jié)合核糖開(kāi)關(guān)的能力。

雖然Sintim課題組[28]和Strobel課題組[34]分別在2011年和2013年就已經(jīng)成功合成并篩選出了能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷酸二酯酶活性的環(huán)狀二鳥(niǎo)苷酸衍生物，但是他們并沒(méi)有測(cè)試這些化合物對(duì)不同細(xì)菌種類c-di-GMP降解酶的抑制作用，以及對(duì)細(xì)菌表型的影響。直到2016年，Sintim課題組[35]利用分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)高通量地從250000種化合物中篩選得到了1個(gè)具有高度選擇性的磷酸二酯酶抑制劑——苯并異噻唑啉酮衍生物(BZ-1，圖6)。

實(shí)驗(yàn)表明，該化合物僅對(duì)磷酸二酯酶蛋白R(shí)ocR具有抑制作用，而對(duì)其他 PDEs蛋白無(wú)影響。表型實(shí)驗(yàn)顯示，該化合物對(duì)銅綠假單胞菌的涌動(dòng)(Swarming)具有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)其泳動(dòng)(Swimming)和生物被膜的形成并沒(méi)有影響。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磷酸二酯酶蛋白R(shí)ocR的抑制并不會(huì)影響銅綠假單胞菌c-di-GMP的整體水平。

這些發(fā)現(xiàn)暗示c-di-GMP代謝酶對(duì)c-di-GMP濃度的調(diào)控既有全局水平又有局部水平。同時(shí)，苯并異噻唑啉酮BZ-1也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能夠通過(guò)抑制磷酸二酯酶的活性進(jìn)而影響細(xì)菌表型的小分子抑制劑。

圖6 c-di-GMP降解酶(磷酸二酯酶)抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)[10,28,34-35]Fig.6 Chemical structures ofc-di-GMP degrading enzyme inhibitors[10,28,34-35].

3 c-di-GMP受體抑制劑的研究進(jìn)展

c-di-GMP結(jié)合下游的受體分子是其發(fā)揮信使功能的關(guān)鍵，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了c-di-GMP的4種受體分子：1)PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白；2)具有Ⅰ位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域蛋白；3)轉(zhuǎn)錄因子；4)核糖體開(kāi)關(guān)GEMM。這些受體分子通過(guò)結(jié)合c-di-GMP并作用于相應(yīng)的靶點(diǎn)而直接控制細(xì)菌某些生理活動(dòng)。因此，相比于控制c-di-GMP的代謝，通過(guò)調(diào)控c-di-GMP與受體分子的相互作用將能夠更精確更直接地控制細(xì)菌的生理活動(dòng)。然而，由于c-di-GMP與受體分子之間的作用機(jī)制尚未完全清晰，因此，對(duì)c-di-GMP受體分子抑制劑的研究仍然處于探索階段。迄今為止，研究人員僅僅對(duì) PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白和核糖體開(kāi)關(guān)抑制劑做了相應(yīng)的研究。本節(jié)將對(duì)這兩種抑制劑的研究進(jìn)展進(jìn)行論述。

3.1 PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白抑制劑

PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白是細(xì)菌內(nèi)廣泛存在的一類c-di-GMP受體，該結(jié)構(gòu)域蛋白由于其保守的RXXXR20–30(D/N)X(S/A)XXG(X 代表任意氨基酸)序列而得名[36]，PilZ蛋白結(jié)合c-di-GMP后引起結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的變化，并通過(guò)蛋白-蛋白相互作用發(fā)揮其生物學(xué)作用[37]。

銅綠假單胞菌P.aeruginosa中的Alg44蛋白是典型的PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白[38-39]，2013年，Sintim課題組[10]在研究二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的抑制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，2′-F-c-di-GMP 和2′-H-c-di-GMP(圖2 和圖6)能夠與c-di-GMP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Alg44蛋白；其中2′-F-c-di-GMP(圖2)對(duì) Alg44蛋白的抑制作用是c-di-GMP的2倍，但是2′-F-c-di-GMP對(duì)WspR蛋白同樣具有很強(qiáng)的抑制作用，缺乏選擇性。這些研究表明c-di-GMP衍生物可以作為PiLZ結(jié)構(gòu)域蛋白的潛在抑制劑。

3.2 核糖體開(kāi)關(guān)抑制劑

核糖體開(kāi)關(guān)(Riboswitch)能夠和c-di-GMP相結(jié)合從而調(diào)控基因的表達(dá)，其主要是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP信號(hào)分子的濃度變化而調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。2008年，Breaker課題組[40]發(fā)現(xiàn)了第一類c-di-GMP核糖體開(kāi)關(guān)Vc2RNA，該核糖體開(kāi)關(guān)結(jié)合c-di-GMP有利于下游基因的轉(zhuǎn)錄。2010年，他們又發(fā)現(xiàn)了第二類c-di-GMP核糖體開(kāi)關(guān) CdA RNA，這類核糖體開(kāi)關(guān)與c-di-GMP具有很好的親和力，并且參與 mRNA的自我剪切[41]。

2011年，Strobel課題組[42]在研究c-di-GMP及其衍生物與兩種核糖體開(kāi)關(guān)的結(jié)合能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP的堿基、2′-OH 和磷酸酯鍵是c-di-GMP結(jié)合核糖體開(kāi)關(guān)的關(guān)鍵基團(tuán)。其中，鳥(niǎo)嘌呤是c-di-GMP特異性識(shí)別Ⅰ類核糖體開(kāi)關(guān)Vc2RNA所必需的。各種研究表明，c-di-GMP中2′-OH和磷酸酯鍵的改變雖然明顯降低了c-di-GMP與Vc2 RNA、CdA RNA和WspR的結(jié)合能力，但是這種改變卻提高了對(duì)兩種核糖體開(kāi)關(guān)的識(shí)別能力。例如，2′-OMe-c-di-GMP(圖6)能夠特異性結(jié)合Ⅱ類核糖體開(kāi)關(guān)[43]，endo-S-c-di-GMP(圖6)能夠特異性識(shí)別Ⅰ類核糖體開(kāi)關(guān)[44]，基于這一發(fā)現(xiàn) Strobel課題組通過(guò)對(duì)c-di-GMP的2′-OH和磷酸酯鍵進(jìn)行修飾，篩選出了兩種能夠特異性結(jié)合Vc2 RNA(Ⅰ類核糖體開(kāi)關(guān))的小分子化合物2′-[biotin]-endo-S-cdi-GMP 和2′-[biotin]-AHC-c-diGMP(圖7)[45]，這些小分子化合物能夠與c-di-GMP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ⅰ類核糖體開(kāi)關(guān)，是潛在的核糖體開(kāi)關(guān)抑制劑。

圖7 核糖體開(kāi)關(guān)抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)[45]Fig.7 Chemical structures of riboswitch inhibitors[45].

4 展望

c-di-GMP是細(xì)菌所特有一類核酸類第二信使，對(duì)c-di-GMP信號(hào)通路的研究以及針對(duì)這一通路的小分子抑制劑的開(kāi)發(fā)對(duì)于發(fā)展新一代抗菌藥物具有重要的意義和價(jià)值。迄今為止，由于c-di-GMP代謝酶的缺失所引起細(xì)菌表型的變化已經(jīng)被觀察到，而對(duì)c-di-GMP受體分子的作用機(jī)制尚未完全清楚。因此，對(duì)于c-di-GMP信號(hào)分子抑制劑的研究仍將主要集中在c-di-GMP的代謝酶上；雖然目前為止已經(jīng)報(bào)道了一批能夠抑制c-di-GMP代謝酶的小分子化合物，但是這些小分子化合物在生物活性方面往往缺乏很好的選擇性；同時(shí)在化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性方面仍有很大的發(fā)掘空間。因此，弄清楚c-di-GMP信號(hào)的作用機(jī)制，開(kāi)發(fā)高效結(jié)構(gòu)多樣且具有高度選擇性的小分子化合物將是發(fā)展c-di-GMP信號(hào)分子抑制劑的前進(jìn)方向。同時(shí)，在更多的細(xì)菌中闡明這些小分子抑制劑的生物學(xué)功能也將是潛在的研究課題。伴隨著生物學(xué)的發(fā)展，以及對(duì)c-di-GMP受體分子作用機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，將會(huì)為開(kāi)發(fā)c-di-GMP受體抑制劑帶來(lái)蓬勃的發(fā)展。

[1]Galperin MY, Nikolskaya AN, Koonin EV.Corrigendum to “novel domains of the prokaryotic two-component signal transduction systems”.FEMS Microbiol Lett,2001,204(1):213–214.

[2]Galperin MY.Bacterial signal transduction network in a genomic perspective.Environ Microbiol,2004,6(6):552–567.

[3]Tal R, Wong HC, Calhoon R, et al.Threecdgoperons control cellular turnover of cyclic di-GMP inAcetobacterxylinum: genetic organization and occurrence of conserved domains in isoenzymes.J Bacteriol,1998,180(17):4416–4425.

[4]De N, Navarro MVAS, Raghavan RV, et al.Determinants for the activation and autoinhibition of the diguanylate cyclase response regulator WspR.J Mol Biol,2009,393(3):619–633.

[5]Simm R, Morr M, Kader A, et al.GGDEF and EAL domains inversely regulate cyclic di-GMP levels and transition from sessility to motility.Mol Microbiol,2004,53(4):1123–1134.

[6]Yang CY, Chin KH, Chuah LC, et al.The structure and inhibition of a GGDEF diguanylate cyclase complexed with(c-di-GMP)2at the active site.Acta Crystallogr,2011,67(12):997–1008.

[7]Seshasayee ASN, Fraser GM, Luscombe NM.Comparative genomics of cyclic-di-GMP signalling in bacteria: post-translational regulation and catalytic activity.Nucleic Acids Res,2010,38(18):5970–5981.

[8]Christen B, Christen M, Paul R, et al.Allosteric control of cyclic di-GMP signaling.J Biol Chem,2006,281(42):32015–32024.

[9]Ching SM, Tan WJ, Chua KL, et al.Synthesis of cyclic di-nucleotidic acids as potential inhibitors targeting diguanylate cyclase.Bioorg Med Chem,2010,18(18):6657–6665.

[10]Zhou J, Watt S, Wang JX, et al.Potent suppression ofc-di-GMP synthesisviaI-site allosteric inhibition of diguanylate cyclases with2′-F-c-di-GMP.Bioorg Med Chem,2013,21(14):4396–4404.

[11]Varma RS.Synthesis of oligonucleotide analogues with modified backbones.ChemInform,1994,25(5), doi:10.1002/chin.199405298.

[12]Rozners E.Carbohydrate chemistry for RNA interference: synthesis and properties of RNA analogues modified in sugar-phosphate backbone.Curr Org Chem,2006,10(6):675–692.

[13]Fernicola S, Torquati I, Paiardini A, et al.Synthesis of triazole-linked analogues ofc-di-GMP and their interactions with diguanylate cyclase.J Med Chem,2015,58(20):8269–8284.

[14]Ohana P, Delmer DP, Carlson RW, et al.Identification of a novel triterpenoid saponin fromPisumsativumas a specific inhibitor of the diguanylate cyclase ofAcetobacterxylinum.Plant Cell Physiol,1998,39(2):144–152.

[15]Ohana P, Delmer DP, Volman G, et al.Glycosylated triterpenoid saponin: a specific inhibitor of diguanylate cyclase fromAcetobacter xylinum.Biological activity and distribution.Plant Cell Physiol,1998,39(2):153–159.

[16]Sambanthamoorthy K, Luo CY, Pattabiraman N, et al.Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.Biofouling,2014,30(1):17–28.

[17]Fernicola S, Paiardini A, Giardina G, et al.In silicodiscovery andinvitrovalidation of catechol-containing sulfonohydrazide compounds as potent inhibitors of the diguanylate cyclase PleD.J Bacteriol,2016,198(1):147–156.

[18]Wassmann P, Chan C, Paul R, et al.Structure of BeF3–-modified response regulator PleD:implications for diguanylate cyclase activation,catalysis, and feedback inhibition.Structure,2007,15(8):915–927.

[19]Z?hringer F, Lacanna E, Jenal U, et al.Structure and signaling mechanism of a zinc-sensory diguanylate cyclase.Structure,2013,21(7):1149–1157.

[20]Sambanthamoorthy K, Sloup RE, Parashar V, et al.Identification of small molecules That antagonize diguanylate cyclase enzymes to inhibit biofilm formation.Antimicrob Agents Chemother,2012,56(10):5202–5211.

[21]Srivastava D, Harris RC, Waters CM.Integration of cyclic di-GMP and quorum sensing in the

[22]Lieberman OJ, Orr MW, Wang Y, et al.High-throughput screening using the differential radial capillary action of ligand assay identifies ebselen as an inhibitor of diguanylate cyclases.ACS Chem Biol,2014,9(1):183–192.

[23]Roelofs KG, Wang JX, Sintim HO, et al.Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(37):15528–15533.

[24]Donaldson GP, Roelofs KG, Luo YL, et al.A rapid assay for affinity and kinetics of molecular interactions with nucleic acids.Nucleic Acids Res,2012,40(7): e48.

[25]Ryan RP, McCarthy Y, Andrade M, et al.Cell-cellsignal-dependent dynamic interactions between HD-GYP and GGDEF domain proteins mediate virulence inXanthomonascampestris.Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(13):5989–5994.

[26]Ryan RP, Fouhy Y, Lucey JF, et al.Cell-cell signaling inXanthomonascampestrisinvolves an HD-GYP domain protein that functions in cyclic di-GMP turnover.Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(17):6712–6717.

[27]Schmidt AJ, Ryjenkov DA, Gomelsky M.The ubiquitous protein domain EAL is a cyclic diguanylate-specific phosphodiesterase: enzymatically active and inactive EAL domains.J Bacteriol,2005,187(14):4774–4781.

[28]Wang JX, Zhou J, Donaldson GP, et al.Conservative change to the phosphate moiety of cyclic diguanylic monophosphate remarkably affects its polymorphism and ability to bind DGC,PDE, and PilZ proteins.J Am Chem Soc,2011,133(24):9320–9330.

[29]Alm RA, Bodero AJ, Free PD, et al.Identification of a novel gene,pilZ, essential for type4 fimbrial biogenesis inPseudomonasaeruginosa.J Bacteriol,1996,178(1):46–53.

[30]Ko J, Ryu KS, Kim H, et al.Structure of PP4397 reveals the molecular basis for differentc-di-GMP binding modes by Pilz domain proteins.J Mol Biol,2010,398(1):97–110.

[31]Galperin MY, Nikolskaya AN, Koonin EV.Novel domains of the prokaryotic two-component signal transduction systems.FEMS Microbiol Lett,2001,203(1):11–21.

[32]Navarro MVAS, De N, Bae N, et al.Structural analysis of the GGDEF-EAL domain-containingc-di-GMP receptor FimX.Structure,2009,17(8):1104–1116.

[33]Tchigvintsev A, Xu XH, Singer A, et al.Structural insight into the mechanism ofc-di-GMP hydrolysis by EAL domain phosphodiesterases.J Mol Biol,2010,402(3):524–538.

[34]Shanahan CA, Gaffney BL, Jones RA, et al.Identification ofc-di-GMP derivatives resistant to an EAL domain phosphodiesterase.Biochemistry,2013,52(2):365–377.

[35]Zheng Y, Tsuji G, Opoku-Temeng C, et al.Inhibition ofP.aeruginosac-di-GMP phosphodiesterase RocR and swarming motility by a benzoisothiazolinone derivative.Chem Sci,2016,7(9):6238–6244.

[36]Ryjenkov DA, Simm R, R?mling U, et al.The PilZ domain is a receptor for the second messengerc-di-GMP: the PilZ domain protein YcgR controls motility in enterobacteria.J Biol Chem,2006,281(41):30310–30314.

[37]Amikam D, Galperin MY.PilZ domain is part of the bacterial c-di-GMP binding protein.Bioinformatics,2006,22(1):3–6.

[38]Merighi M, Lee VT, Hyodo M, et al.The second messenger bis-(3′-5′)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis inPseudomonasaeruginosa.Mol Microbiol,2007,65(4):876–895.

[39]Remminghorst U, Rehm BH.Alg44, a unique protein required for alginate biosynthesis inPseudomonasaeruginosa.FEBS Lett,2006,580(16):3883–3888.

[40]Sudarsan N, Lee ER, Weinberg Z, et al.Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.Science,2008,321(5887):411–413.

[41]Lee ER, Baker JL, Weinberg Z, et al.An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger.Science,2010,329(5993):845–848.

[42]Furukawa K, Gu HZ, Sudarsan N, et al.Identification of ligand analogues that controlc-di-GMP riboswitches.ACS Chem Biol,2012,7(8):1436–1443.

[43]Smith KD, Shanahan CA, Moore EL, et al.Structural basis of differential ligand recognition by two classes of bis-(3′-5′)-cyclic dimeric guanosine monophosphate-binding riboswitches.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(19):7757–7762.

[44]Zhou J, Sayre DA, Wang JX, et al.Endo-S-c-di-GMP analogues-polymorphism and binding studies with class I riboswitch.Molecules,2012,17(11):13376–13389.

[45]Luo YL, Zhou J, Watt SK, et al.Differential binding of2′-biotinylated analogs ofc-di-GMP withc-di-GMP riboswitches and binding proteins.Mol Biosyst,2012,8(3):772–778.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress inc-di-GMP inhibitors

Xuwen Xiang1,2,3, Xingyu Liu1,2,3, Hui Tao1,2,3, Zining Cui1,2,3, and Lianhui Zhang1,2,3
1State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Guangzhou510642,Guangdong,China
2Integrative Microbiology Research Centre,College of Agriculture,South China Agricultural University,Guangzhou510642,Guangdong,China
3Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control,Guangzhou510642,Guangdong,China

The cyclic dinucleotidec-di-GMP is known as an important second messenger in bacteria, which controls various important cellular processes, such as cell differentiation, biofilm formation and virulence factors production.It isextremely vital for the development of new antibacterial agents by virtue of blockingc-di-GMP signal conduction.Current research indicates that there are three potential targets for discovering new antibacterial agents based onc-di-GMP regulated signal pathway, which arec-di-GMP synthases,c-di-GMP degrading enzymes andc-di-GMP receptors.Herein,we review small molecules that have been developed to inhibitc-di-GMP related enzymes and indicate perspectives ofc-di-GMP inhibitors.

c-di-GMP, diguanylatecyclases, phosphodiesterases, receptors, inhibitors

March28,2017;Accepted:May3,2017

Zining Cui.Tel: +86-20-85288229; E-mail: ziningcui@scau.edu.cn

向緒穩(wěn), 劉星宇, 陶輝, 等.環(huán)二鳥(niǎo)苷酸信號(hào)分子抑制劑的研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1466?1477.

Xiang XW, Liu XY, Tao H, et al.Progress inc-di-GMP inhibitors.Chin J Biotech,2017,33(9):1466?1477.

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2015CB150600), National Natural Science Foundation of China(No.31570122), Pearl River S&T Nova Program of Guangzhou(No.201506010029).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2015CB150600)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31570122)，廣州市珠江科技新星專項(xiàng)(No.201506010029)資助。

張煉輝 教授，國(guó)際群體感應(yīng)研究權(quán)威專家，國(guó)家“千人計(jì)劃”特聘專家、長(zhǎng)江講座特聘教授、“973”首席科學(xué)家(微生物群體感應(yīng)通訊系統(tǒng)及病害防控應(yīng)用基礎(chǔ))、國(guó)務(wù)院學(xué)位委員會(huì)第七屆學(xué)科評(píng)議組成員、廣東省領(lǐng)軍人才、新加坡2005年度“國(guó)家科學(xué)獎(jiǎng)”得主，2017年當(dāng)選為美國(guó)微生物科學(xué)院(American Academy of Microbiology, AAM)院士(Fellow)，被認(rèn)為是群體感應(yīng)領(lǐng)域的奠基者之一，群體淬滅防治植物病害新理論的建立者。2013年協(xié)調(diào)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)多個(gè)單位組建“廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”；同年協(xié)助引進(jìn)廣東省“群體微生物基礎(chǔ)理論與前沿技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”；2016年組建了首個(gè)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校級(jí)研究中心——“群體微生物研究中心”。

崔紫寧 教授，2010年畢業(yè)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，獲得理學(xué)博士。日本JSPS外籍特別研究員(2010?2012)，入選2015年珠江科技新星。主要從事活性小分子的設(shè)計(jì)合成、農(nóng)藥學(xué)以及化學(xué)生物學(xué)相關(guān)的科研與教學(xué)工作。主持國(guó)家自然科學(xué)基金面上及青年項(xiàng)目各1項(xiàng)，973計(jì)劃子課題1項(xiàng)，省部級(jí)項(xiàng)目3項(xiàng)。至今發(fā)表SCI研究論文40余篇，申請(qǐng)中國(guó)發(fā)明專利12項(xiàng)，獲得授權(quán)5項(xiàng)。