李張維，李濤

（西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，四川 瀘州 646000）

臨床研究·論著

miR-148a對食管癌細胞遷移及侵襲的影響及潛在分子機制研究

李張維，李濤

（西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，四川 瀘州 646000）

目的探究微小核糖核酸148a（miR-148a）在食管鱗狀細胞癌（ESCC）中的表達及對食管癌TE-1細胞遷移和侵襲能力的影響。方法收集48例食管癌患者腫瘤及癌旁組織的RNA標本，逆轉(zhuǎn)錄PCR合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），實時熒光定量聚合酶鏈反應PCR檢測miR-148a在腫瘤及癌旁組織中的表達情況，分析腫瘤組織中miR-148a表達差異的臨床意義。將人工合成的miR-148a模擬物（miR-148a mimics）轉(zhuǎn)染入食管癌細胞TE-1中，劃痕愈合實驗檢測過表達miR-148a對TE-1細胞遷移的影響，Transwell小室模型檢測miR-148a對TE-1侵襲的影響。Western blot檢測miR-148a過表達對TE-1細胞中原癌基因（c-myc）及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白表達的影響。結(jié)果MiR-148a在食管癌組織中表達水平下調(diào)（P=0.031）；過表達miR-148a能夠抑制 TE-1 細胞遷移（P=0.021）及侵襲（P=0.018）并下調(diào)細胞內(nèi) c-myc（P=0.037）及 MMP-9（P=0.026）的表達水平。結(jié)論miR-148a在食管癌中低表達，miR-148a可能通過抑制c-myc/MMP-9通路的表達來發(fā)揮抑制食管癌細胞遷移及侵襲。

MiR-148a；食管癌；遷移；侵襲；原癌基因（c-myc）；基質(zhì)金屬蛋白酶9

食管癌是我國常見的上消化道惡性腫瘤之一[1]，對于食管癌發(fā)生、發(fā)展機制的研究對于提高食管癌患者的診斷及預后評價效果具有重要意義。MicroRNAs是一類長度在25個核苷酸以內(nèi)的單鏈、短序列RNA。MicroRNAs不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，而是通過結(jié)合與靶基因mRNA的3’-端非編碼區(qū)（three prime untranslated region，3’-UTR）來抑制靶基因表達[2]。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA 148a（miR-148a）的異常表達與卵巢癌[3]、肺癌[4]等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因而，miR-148a被認為是一種具有潛在應用價值的腫瘤評估指標。但是miR-148a在食管癌中的表達及生物作用尚不完全清楚。本研究通過檢測miR-148a在食管癌及對應癌旁組織中的表達情況及其對細胞遷移侵襲的效應，為食管癌的診治提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2014年3月-2015年4月于四川省腫瘤醫(yī)院收治的48例食管鱗狀細胞癌及對應癌旁組織患者。其中，年齡45～68歲；男性34例，女性14例。所有入組患者均簽署研究知情同意書。人食管癌細胞系TE-1（購自中國科學院上海生物化學與細胞生物研究所），細胞液體培養(yǎng)基 DMEM（11965-084）、胎牛血清（16000044）（購自美國 Gibco公司），Trizol試劑（15596026）及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）、一步法轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（10928042）（購自美國 Invitrogen公司），miR-148a mimics、陰性對照 mimics、miR-148a 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 引物試劑盒及 RNU6B qRT-PCR引物試劑盒（購自廣州復能基因有限公司），兔抗人原癌基因（c-myc）（#5605）及基質(zhì)金屬蛋白 酶 9 （matrix metalloproteinases 9，MMP-9）（#13667）多克隆抗體和小鼠抗人β-actin（#3700）單克隆抗體（購自美國Cell Signaling Technology公司），ECL化學發(fā)光試劑盒（WBKLS0050）（購自美國密理博公司），8.0μm 孔徑 Transwell小室（#3458）（購自美國Corning公司），基質(zhì)膠（貨號：354230）（購自美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 按Trizol試劑說明書提取組織或細胞總RNA，按試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增體系。設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃ 30min，94℃ 2min，循環(huán) 1 次；94℃ 15s，60℃ 30s，68℃ 3min，循環(huán)次數(shù)40；72℃ 10min。以 RNU6B 作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計算miR-148a的相對表達量。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及mimics轉(zhuǎn)染 TE-1細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2、3代。按過夜增殖至愈合度達70%之密度接種6孔細胞培養(yǎng)板。達到預定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×PBS溶液充分洗滌細胞。轉(zhuǎn)染分組：miR-148a組每孔加入100 pmol miR-148a mimics及5 μl轉(zhuǎn)染試劑；對照組每孔加入100 pmol的陰性對照mimics及5 μl轉(zhuǎn)染試劑。添加無血清DMEM培養(yǎng)液至終體積1 ml/孔。4 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細胞劃痕愈合實驗 轉(zhuǎn)染24 h后的TE-1細胞接種于6孔板中，接種密度以過夜鋪滿為準。無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細胞4 h已減弱細胞間連接。100 μl的槍頭由每孔中線劃過，PBS清洗6孔板內(nèi)殘余懸浮細胞，每孔加入2ml無血清DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照。

1.2.4 Transwell侵襲小室檢測 按1∶8比例采用DMEM培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠后，每孔100μl包被Transwell小室膜的上室面，取轉(zhuǎn)染72h后的TE-1細胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞至5×105個/ml，上層小室每室加入250 μl細胞懸液，下層小室中加入含10%FBS的培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽擦凈上室面細胞，4%多聚甲醛固定下室面細胞，Giemsa染液染色?！?00光鏡下隨機選擇10個視野計數(shù)下室面的細胞個數(shù)。以每個小室的平均細胞數(shù)為最終計數(shù)。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測 提取轉(zhuǎn)染72 h后的TE-1細胞總蛋白。SDS-PAGE膠垂直電泳分離蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%BSA室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋的c-myc、MMP-9及β-actin抗體。在4℃下孵育相應條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，ECL法發(fā)光觀察蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a在食管癌組織中的表達

在對48組食管癌癌及癌旁組織中進行PCR定量檢測發(fā)現(xiàn)，miR-148a在食管癌組織中的相對表達量為（0.475±0.013）。結(jié)果表明，其表達水平較癌旁組織（1.136±0.011）降低（t=2.307，P=0.031）。以 48例食管癌組織中miR-148a的平均表達量為界值，將患者分為miR-148a高表達組（≥0.475，n=35）及miR-148a低表達組（＜0.475，n=13）。對兩組患者的臨床病理特征進行分析表明，食管癌組織中miR-148a陽性表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=6.553，P=0.019）關(guān)系密切。見附表。

附表 食管癌患者miR-148a與臨床特征表達的關(guān)系

2.2 過表達miR-148a表達對TE-1遷移及侵襲的影響

為探究miR-148a的生物學功能，筆者首先通過mimics轉(zhuǎn)染在TE-1細胞內(nèi)成功過表達miR-148a（t=17.291，P=0.003）（見圖 1A）。細胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對照mimics組（33.430±4.356）比較，過表達miR-148a能抑制TE-1細胞遷移（51.283±7.201）（t=6.833，P=0.021）（見圖 1B）。Transwell侵襲小室檢測結(jié)果表明，與陰性對照mimics比較（89.685±9.375），miR-148a對 TE-1細胞的侵襲能力（27.094±6.281）同樣具有抑制效果（t=7.124，P=0.018），見圖 1C。

圖1 過表達miR-148a抑制TE-1細胞遷移及侵襲

2.3 過表達miR-148a抑制TE-1細胞內(nèi)c-myc及MMP-9的表達

生物信息學檢索表明，癌性轉(zhuǎn)錄因子c-myc是miR-148a的下游潛在作用靶點（見圖2A）。筆者在TE細胞內(nèi)過表達miR-148a后，通過蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)c-myc蛋白的表達下調(diào)（0.623±0.074 vs 0.466±0.101，t=5.307，P=0.037）（見圖 2B）。同時，對細胞遷移和侵襲具有重要促進作用的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達量也降低（0.760±0.111 vs 0.512±0.109，t=6.113，P=0.026）。

圖2 過表達miR-148a抑制TE-1細胞內(nèi)c-myc及MMP-9表達

3 討論

目前，在臨床上有實際應用價值的食管癌的生物學診斷標志物及治療靶極少[5]。因而，研究新的食管癌生物治療靶點靶標具有重要的臨床應用價值。miR-148a由位于染色體7p15.2上的基因編碼[6]。研究確認，miR-148a在生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用。例如，前B淋巴細胞激活后能誘導miR-148的表達，miR-148a進而誘導活化的B淋巴細胞進一步分化成漿細胞，即效應B淋巴細胞[7]。除此之外，miR-148a在骨骼肌細胞分化的過程中同樣具有誘導作用[8]。近年來對miR-148a功能的研究多集中于腫瘤學領(lǐng)域。在胃癌組織及多種胃癌細胞系中均檢測到miR-148a的表達下調(diào)[9]。低表達的miR-148a與患者腫瘤體積增大、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高TNM臨床分期[10]及不良預后均密切相關(guān)[11]。提示miR-148a在癌組織中的低表達，并具有相當?shù)呐R床意義。在本研究中，筆者通過對食管癌及癌旁組織檢測發(fā)現(xiàn)，miR-148a在食管癌組織中的表達明顯降低，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的惡性表型關(guān)系密切，提示miR-148a可能通過抑制食管癌細胞侵襲而抑制腫瘤發(fā)展。

本研究中，筆者通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)提高食管癌TE-1細胞中miR-148a的表達，通過細胞劃痕愈合試驗和Transwell侵襲小室模型發(fā)現(xiàn)，過表達miR-148a能夠明顯抑制TE-1細胞的遷移和侵襲能力。該研究結(jié)果與國內(nèi)外學者在腎癌[12]、乳腺癌[13]及卵巢癌[14]中的研究結(jié)論相一致。為探討miR-148a的作用機制，通過生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)，癌性轉(zhuǎn)錄因子c-myc可能是miR-148a的作用靶點之一。通過蛋白免疫印跡檢測，證實miR-148a對c-myc表達的負調(diào)控作用。并且c-myc轉(zhuǎn)錄靶標MMP-9的表達水平也受到明顯的抑制。MMP-9是參與分解細胞外機制而促進細胞遷移侵襲的蛋白酶之一[15]，其表達改變從分子水平解釋了過表達miR-148a后細胞遷移及侵襲能力變化的原因。

綜上所述，miR-148a在食管癌中表達下調(diào)并與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)表型關(guān)系密切。在體外，miR-148a夠通過抑制c-myc/MMP-9的表達來抑制食管癌細胞的遷移侵襲能力，最終抑制食管癌進展。

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Role and potential mechanism of miR-148a in migration and invasion of esophageal carcinoma

Zhang-wei Li,Tao Li
(School of Clinical Medicine,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-148a in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its role in cell migration and invasion.MethodsA total of 48 cases of ESCC and tumor adjacent tissue ribonucleic acid (RNA)samples were collected in our hospital.Complementary deoxyribonucleic acid(cDNA)was synthetized by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The expression level of miR-148a was detected by real-time PCR.MiR-148a mimics were synthesized and transfected into TE-1 cells.Migration and invasion rates were determined by wound-healing assay and Transwell assay,respectively.The expression levels of c-myc and matrix metalloprotein 9(MMP-9)were measured by Western blot.ResultsmiR-148a was down-regulated in ESCC tissue(P=0.031).Over-expression of miR-148a inhibited migration and invasion rates of TE-1 cells(P=0.021 and 0.018,respectively).Moreover,protein levels of c-myc and MMP-9 were decreased with miR-148a over expression(P=0.037 and 0.026,respectively).ConclusionsmiR-148a inhibits cell migration and invasion of ESCC through inhibition of c-myc/MMP-9 signal pathway.

miR-148a;esophageal cancer;migration;invasion;c-myc;matrix metalloproteinases 9

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.006

1005-8982（2017）24-0029-05

2017-02-28

李濤，Tel：13709000298

（王榮兵 編輯）