郭建強(qiáng) ，孫鵬 ，李素娟 ，趙鵬偉 ，牛燕 ，張烜

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫實驗中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050）

自發(fā)性高血壓大鼠心腎交感神經(jīng)的分布狀況*

郭建強(qiáng)1，孫鵬2，李素娟3，趙鵬偉2，牛燕2，張烜2

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫實驗中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050）

目的探討自發(fā)性高血壓大鼠心臟及腎臟交感神經(jīng)的分布狀況。方法選取6及12周齡的自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和相應(yīng)周齡的同源正常血壓大鼠（WKY），以兒茶酚胺合成限速酶酪氨酸羥化酶（TH）的表達(dá)作為交感神經(jīng)分布的標(biāo)志，采用免疫組織化學(xué)檢測TH，尾套法檢測大鼠血壓及心率。結(jié)果6及12周齡的SHR血壓及心率高于相應(yīng)周齡的WKY鼠。6及12周齡的SHR心臟及腎臟TH的表達(dá)高于相應(yīng)周齡的WKY鼠。SHR 12周齡時腎臟TH的表達(dá)高于6周齡，心臟TH的表達(dá)在2個周齡組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論SHR心及腎臟交感神經(jīng)纖維分布密度增加，并且隨著高血壓的進(jìn)展，腎臟交感神經(jīng)纖維分布密度有增加的趨勢。

高血壓；交感神經(jīng)；心臟；腎臟

交感神經(jīng)的活化是高血壓的一個主要發(fā)病機(jī)制，但早年認(rèn)為交感神經(jīng)主要在血壓的短期調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，在長期的血壓調(diào)整及高血壓的發(fā)展中其發(fā)揮的作用有限。隨著研究的深入及方法學(xué)的改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)的活化在高血壓的形成過程中一直發(fā)揮很大的作用[1]。常規(guī)的心率和血尿中兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物是交感神經(jīng)活化的功能學(xué)表現(xiàn)[2]，而組織交感神經(jīng)分布是交感神經(jīng)狀態(tài)的解剖學(xué)基礎(chǔ)[3]。本文擬探討高血壓時心臟及腎臟交感神經(jīng)分布狀況。采用自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertension rat，SHR）模型，檢測心臟及腎臟的交感神經(jīng)分布。SHR在12周左右血壓已穩(wěn)定升高，進(jìn)入成熟期，因此選擇6及12周齡的SHR進(jìn)行研究[4]。以兒茶酚胺合成限速酶酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）作為交感神經(jīng)分布的標(biāo)志[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

6和12周齡的雄性SHR及相應(yīng)的正常血壓大鼠（wistar kgoto rat，WKY）（購于北京維通利華公司），抗酪氨酸羥化酶一抗（ab41528）（購自英國Abcom公司），免疫組織化學(xué)其他相關(guān)試劑[包括山羊血清封閉液、加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC）法染色試劑、DAB顯色試劑（購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）]。動物實驗方案或內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)并遵守相關(guān)規(guī)定實施。

1.2 血壓及心率檢測

大鼠的血壓及心率測量采用BP-98A測量儀（北京軟隆生物技術(shù)有限公司）檢測，具體操作根據(jù)其產(chǎn)品說明書進(jìn)行。將大鼠置于安靜、溫暖的環(huán)境，適應(yīng)30 min后將大鼠放在鼠袋中，保持恒溫，然后將感應(yīng)器置于老鼠的尾根部，按下開始鍵，BP-98A自動監(jiān)測老鼠尾部的血流脈動，當(dāng)判定脈波穩(wěn)定時，自動開始測量，從測壓儀上讀取收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及心率數(shù)據(jù)，連測5次，取其平均值。分別測量6及12周齡的WKY和SHR的血壓及心率。

1.3 心、腎交感神經(jīng)分布測定

交感神經(jīng)纖維為TH陽性纖維。通過免疫組織化學(xué)的方法半定量分析TH表達(dá)。測量6及12周齡大鼠的TH表達(dá)。脊椎脫臼法處死大鼠，甲醛心臟灌注處理后，將心、腎組織標(biāo)本固定于甲醛，常規(guī)石蠟包埋，切片為4μm厚，并常規(guī)脫蠟，pH值7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗5 min，共清洗3次后，用0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液微波煮沸修復(fù)抗原5 min，PBS清洗3次，用3%過氧化氫H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，PBS清洗3次，山羊血清封閉液孵育1 h，消除非特異性染色，吸水紙延邊吸去血清，加兔抗人TH抗體，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃作用1h后。PBS清洗3次，加入ABC過氧化物酶復(fù)合物室溫作用1 h，然后DAB顯色5 min，蘇木精染色。中性樹膠封固，鏡檢。采用平均光密度（mean optical density，MOD）值分析TH的表達(dá)量。選擇左心室間隔部心肌與腎皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處組織切片，每只大鼠心臟及腎臟切片各3張。每張切片隨機(jī)分析6個高倍鏡視野（×200），采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量TH表達(dá)的MOD。MOD=積分光密度值（integrated optical density，IOD）/所測量的面積。6個視野MOD的平均值作為該切片的MOD值，3張切片的平均MOD值作為該只大鼠的TH 蛋白表達(dá)水平[6]。色調(diào)（H）、飽和度（S）、亮度（I）所選擇的參數(shù)分別為 12～40、0～255、0～188。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHR和WKY的血壓和心率比較

6及12周齡的SHR收縮壓及舒張壓均高于相應(yīng)周齡的WKY。隨著周齡的增長，SHR的血壓逐漸升高，從6周齡的（147.8±8.2）/（107.8±5.6）mmHg升高到12周齡（194.0±13.5）/（153.6±11.7）mmHg（P＜0.05），而WKY的血壓則保持不變，6周齡組為（118.6±9.8）/（86.2±8.7）mmHg，12周齡組為（123.4±6.9）/（90.4±9.8）mmHg（P＞0.05）（見表1）。6和12周齡的SHR心率均快于相應(yīng)周齡的WKY。見表2。

表1 兩組大鼠6和12周齡收縮壓、舒張壓的比較 （n=5，mmHg，±s）

表1 兩組大鼠6和12周齡收縮壓、舒張壓的比較 （n=5，mmHg，±s）

組別 收縮壓舒張壓6周 12周 t值 6周 12周 t值 P值WKY 組 118.6±9.8 123.4±6.9 -0.897 0.396 86.2±8.7 90.4±9.8 -0.719 0.492 SHR 組 147.8±8.2 194.0±13.5 -6.531 0.000 107.8±5.6 153.6±11.7 -7.901 0.000 t值 -5.114 -10.403 -4.671 -9.286 P值 0.001 0.000 0.002 0.000 P值

表2 兩組大鼠6和12周齡心率的比較（n=5，次 /min，±s）

表2 兩組大鼠6和12周齡心率的比較（n=5，次 /min，±s）

組別 6周 12周WKY組 365±21 327±22 SHR組 414±26 398±27 t值 -3.290 -4.601 P值 0.011 0.002

圖1 兩組大鼠6和12周心臟TH表達(dá) （×200）

圖2 兩組大鼠6和12周腎臟TH表達(dá) （×200）

2.2 SHR和WKY心臟、腎臟的TH表達(dá)水平

6及12周齡的SHR心臟及腎臟的TH表達(dá)水平高于相應(yīng)的WKY；12周齡SHR腎臟TH的表達(dá)水平高于6周齡；6和12周齡SHR心臟TH表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、2和表3、4。

表3 兩組大鼠6和12周心臟TH表達(dá)水平 （±s）

表3 兩組大鼠6和12周心臟TH表達(dá)水平 （±s）

組別 6周 12周 t值 P值WKY組 0.78±0.08 0.89±0.09 -1.899 0.094 SHR組 5.36±0.82 5.06±0.76 0.606 0.561 t值 -12.378 -12.127 P值 0.000 0.000

表4 兩組大鼠6和12周腎臟TH表達(dá)水平 （±s）

表4 兩組大鼠6和12周腎臟TH表達(dá)水平 （±s）

組別 6周 12周 t值 P值WKY組 0.37±0.10 0.41±0.08 -0.853 0.418 SHR組 0.81±0.27 1.82±0.25 -6.068 0.000 t值 -3.439 -11.586 P值 0.009 0.000

3 討論

高血壓是最常見的心血管疾病，是心腦血管病嚴(yán)重事件（心肌梗死和腦血管意外）的最重要的危險因素。靜息心率和心輸出量是評價交感神經(jīng)活性的間接指標(biāo)，研究表明，在年輕的高血壓患者中，靜息心率及心輸出量均有增加。腎上腺素能受體的多態(tài)性與高血壓有著密切的關(guān)系[7]。去甲腎上腺素由交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元末梢釋放，是交感神經(jīng)系統(tǒng)主要的效應(yīng)分子，其濃度的升高是交感神經(jīng)活化的標(biāo)志，高血壓患者的血漿及尿液中的去甲腎上腺素水平也有增加[8]。近年來有關(guān)新的評價交感神經(jīng)活性的方法，比如肌肉交感神經(jīng)活力檢測，放射性標(biāo)記的去甲腎上腺素溢出率，能夠更加準(zhǔn)確的檢測交感神經(jīng)的活性，在高血壓患者中，該指標(biāo)均出現(xiàn)異常，進(jìn)一步明確交感神經(jīng)系統(tǒng)在高血壓發(fā)病過程中的重要作用[2-3]。

近年來，國內(nèi)外相繼開展心血管疾病中神經(jīng)分布異常的研究，發(fā)現(xiàn)組織中的神經(jīng)失分布、再生和過度分布現(xiàn)象，初步確立交感神經(jīng)分布異常是交感神經(jīng)活性的解剖學(xué)基礎(chǔ)，是交感神經(jīng)活性最根本的決定因素，目前基礎(chǔ)研究常用測定去甲腎上腺素含量、兒茶酚胺組織熒光、抗酪氨酸羥化酶的免疫組織化學(xué)法檢測組織中的交感神經(jīng)分布，其中抗酪氨酸羥化酶TH的免疫組織化學(xué)染色直接地檢測組織中的交感神經(jīng)分布[9]。TH是兒茶酚胺合成的限速酶，抗TH的免疫組織化學(xué)染色方法檢測交感神經(jīng)分布已被認(rèn)為較其他方法更為準(zhǔn)確客觀，是動物實驗及尸檢中檢測交感神經(jīng)分布，分析交感神經(jīng)活性的主要方法[3]。

本研究觀察自發(fā)性高血壓大鼠不僅血壓、心率高于正常對照組，心臟和腎臟交感神經(jīng)的分布都比正常組有增加，表明交感神經(jīng)激活是高血壓的重要發(fā)病機(jī)制，并且存在交感神經(jīng)過度分布這一交感神經(jīng)激活的解剖學(xué)基礎(chǔ)。另外，筆者觀察到，隨著高血壓的不斷進(jìn)展，腎交感神經(jīng)分布增強(qiáng)，但心臟交感神經(jīng)并未呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢，說明腎臟交感神經(jīng)的活化可能是高血壓進(jìn)展的主導(dǎo)因素。這也與近年來的臨床研究結(jié)果相符合，即經(jīng)皮導(dǎo)管腎動脈射頻消融去神經(jīng)術(shù)治療難治性高血壓所展示出一定的有效性[10-11]。郭運忠等研究表明，給SHR行去腎交感神術(shù)在降低血壓的同時可導(dǎo)致腎臟TH的表達(dá)降低[12]。本研究也印證交感神經(jīng)的過度分布在高血壓發(fā)病中的重要作用，本研究的結(jié)論進(jìn)一步豐富該理論，為高血壓的防治提供部分理論依據(jù)。

綜上所述，交感神經(jīng)激活是高血壓的重要發(fā)病機(jī)制，高血壓時心臟及腎臟交感神經(jīng)纖維分布密度明顯增加，并且隨高血壓的進(jìn)展，尤其腎臟有逐漸加重的趨勢，是高血壓交感神經(jīng)活化的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

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Distribution of heart and kidney sympathetic nerves in spontaneous hypertension rats*

Jian-qiang Guo1，Peng Sun2,Su-juan Li3,Peng-wei Zhao2,Yan Niu2,Xuan Zhang2
(1.Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot,Inner Mongolia 010050,China;2.Department of Expriment Center for Microbiology and Immunology,Inner Mongolia Medical University,Hohhot,Inner Mongolia 010050,China;3.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot,Inner Mongolia 010050,China)

ObjectiveTo investigate the cardiac and nephrological distribution of sympathetic nerves in spontaneous hypertension rats (SHR).MethodsHeart and liver tissues were harvested from 6-week and 12-week old SHR and homogenous Wistar-Kyoto rats (WKY).Immunohistochemistry staining of Tyrosine hydroxylase(TH),a catecholamine synthesis rate-limiting enzyme,was performed as an indication of sympathetic nerves.Blood pressure and heart rate were measured by tail-cuff method.ResultsBoth blood pressure and heart rate of 6-week and 12-week old SHR were significantly increased compared with those of WKY.Expression levels of TH in heart and kidney of 6-week and 12-week old SHR were significantly higher than those of WKY.In SHR groups,TH expression in kidney of 12-week upregulated significantly when compared with that of the 6-week group,while there was no difference in terms of hepatic TH between 6-week and 12-week old ones.ConclusionThe density of sympathetic nerves is much higher in SHR than that in WKY;nephrological sympathetic nerves were increased in time-dependent manner alongside the progression of hypertension.

hypertension;sympathetic neural;heart;renal

R544

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.002

1005-8982（2017）24-0007-04

2017-01-23

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金博士基金（No：2014BS0806）

（王榮兵 編輯）