董建，楊潔，史國輝

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，河北 唐山 063000）

水飛薊素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討

董建，楊潔，史國輝

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，河北 唐山 063000）

目的探索水飛薊素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷（IRI）的保護(hù)作用及是否與抑制NF-κB活化有關(guān)。方法將30只成年雄性SD大鼠隨機(jī)為假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注模型組（IR組）及藥物組（SM組）。全自動生化分析儀檢測血肌酐、血尿素氮，HE染色檢測腎小管損傷程度，免疫組織化學(xué)檢測腎臟IL-6及NF-κB p65表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法測定腎組織勻漿上清液NF-κB、IL-6濃度。結(jié)果IR組血肌酐、尿素氮、組織勻漿細(xì)胞核內(nèi)NF-κB及細(xì)胞漿中IL-6水平較S組升高（P＜0.05），SM組較IR組降低（P＜0.05），IR組腎小管損傷較重，腎臟IL-6、NF-κB p65表達(dá)增強(qiáng)。而給藥組腎小管損傷減輕，腎臟IL-6、NF-κB p65表達(dá)減弱。結(jié)論水飛薊素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其與抑制NF-κB活化有關(guān)。

水飛薊素；大鼠；缺血再灌注損傷；NF-κB

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的發(fā)病率及死亡率較高，全球每年超過1 300萬患者發(fā)病，每年大約可引起170萬人死亡[1-2]。腎缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是誘發(fā)急性腎損傷較為重要的原因，其在休克、腎移植[3-4]、腎動脈血管成形術(shù)及造影劑腎病等疾病中較為常見[5-8]，并可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活及白細(xì)胞黏附，影響微血管血流動力學(xué)[9]。缺血誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答常常會引起細(xì)胞損傷或壞死[10]。腎臟IRI預(yù)后常常較差，目前并未有效的治療方法。核因子 -κB（nuclear factor κB，NF-κB）是在轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄時所需要的一種輔助因子，由調(diào)節(jié)多種生物應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子家族構(gòu)成[11]。NF-κB信號傳導(dǎo)通路的改變會引起多種炎癥性疾病的發(fā)生，其中就可出現(xiàn)在腎臟IRI疾病的炎癥反應(yīng)中[12]。哺乳動物NF-κB家族由5個成員組成：p65（RelA）、c-Rel、RelB、p50/p105（NF-κB1）及 p52/p100（NF-κB2），其形成不同的異源二聚體或同源二聚體[13]。在正常生理狀態(tài)時，NF-κB與核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白（inhibitory kappa B，ⅠκB）在胞質(zhì)中結(jié)合，其活性被抑制，當(dāng)有外界刺激如創(chuàng)傷、感染等時，ⅠκB會被ⅠκB酶復(fù)合物磷酸化而失去抑制作用，ⅠκB開始泛素化，隨后被特定蛋白酶降解，NF-κB變成游離狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[14]，結(jié)合靶向基因的啟動子或增強(qiáng)子區(qū)域的特定序列，調(diào)節(jié)促炎基因等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而改變多種炎癥相關(guān)因子及酶類物質(zhì)的表達(dá)，如白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）。同時編碼ⅠκB蛋白使細(xì)胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[15]。

水飛薊素是從水飛薊種子中提取的黃酮類混合物，具有明顯的抗炎作用，可以抑制炎癥信號的表達(dá)和中性粒細(xì)胞的遷移，穩(wěn)定肥大細(xì)胞。過去水飛薊素常常作為保肝藥物使用，近些年發(fā)現(xiàn)其對其他臟器同樣有一定的保護(hù)作用。TAN等發(fā)現(xiàn)水飛薊素可以降低腎IRI大鼠血清肌酐、尿素氮水平[16]，但相關(guān)研究相對較少且其機(jī)制尚不明確。鑒于水飛薊素明顯的抗炎作用、本身無毒副作用和對多種器官的保護(hù)作用，其對大鼠腎臟IRI的保護(hù)作用及其是否與抑制NF-κB活化有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠，無特定病原體（SPF）級環(huán)境飼養(yǎng)，體重250～290 g[購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2009-003]，購自華北理工大學(xué)動物實驗中心動物房飼養(yǎng)7 d，以適應(yīng)環(huán)境。12 h光照環(huán)境，12 h黑暗環(huán)境，可自由獲取食物和水。本實驗的動物處理方法經(jīng)華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會商議后批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

Olympus電動正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司），酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司），全自動生化檢測儀（美國Benckman公司），水飛薊素膠囊（德國馬博士大藥廠，生產(chǎn)批號：B1403206），IL-6、NF-κB p65免疫組織化學(xué)（免疫組化）試劑盒（購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司），NF-κB及IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 方法

選用隨機(jī)數(shù)字法將30只雄性大鼠分為3組，分別為假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注模型組（IR組）及藥物組（SM組）。各組處理情況：S組及IR組術(shù)前給予生理鹽水灌胃7 d，SM組術(shù)前給予水飛薊素100 mg/（kg·d）灌胃7 d。術(shù)前12 h給予禁食水，腹腔緩慢注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠后，仰臥位固定。劍突下至恥骨聯(lián)合上備皮并用安爾碘消毒3次，充分暴露手術(shù)區(qū)域，手術(shù)器械于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)120℃，40 min滅菌。術(shù)中使用生理鹽水浸濕紗布保護(hù)腹腔臟器，同時注意保暖。手術(shù)切口3～4 cm，腹中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉及腹膜，逐層打開腹腔。IR組、SM組結(jié)扎右側(cè)輸尿管及右側(cè)腎動靜脈，摘取右側(cè)腎臟，無創(chuàng)動脈夾阻斷左側(cè)腎臟血液供應(yīng)，夾閉左側(cè)腎動靜脈40 min，再灌注24 h后，給予10%水合氯醛腹腔注射再次麻醉大鼠，逐層打開腹腔，留取血液樣品及腎組織。S組不給予缺血再灌注處理，其余步驟與其他組相同。取出各組左側(cè)腎臟后分別沿冠狀面和矢狀面切成4分，一部分立即放入4%多聚甲醛中固定12～24 h，包埋制成蠟塊，放于4℃冰箱冷凍中保存。一部分腎臟迅速放入-180℃液氮罐中速凍，后保存在-80℃低溫冰箱中，用于組織勻漿的制備，組織勻漿上清液保存于-20℃。用含有促凝集的真空管抽取下腔靜脈血3.5 ml，放入4℃冰箱中。應(yīng)用Benckman全自動生化檢測儀測量血清肌酐及尿素氮濃度；HE染色后，在Olympus電動正置顯微鏡下觀察腎病組織病理學(xué)改變；免疫組織化學(xué)染色檢測NF-κB p65在細(xì)胞核中的表達(dá)及IL-6在細(xì)胞漿中的表達(dá)；ELISA檢測腎組織勻漿細(xì)胞核NF-κB及細(xì)胞漿IL-6濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢測結(jié)果

各組大鼠腎臟缺血再灌注40 min后，各組大鼠血肌酐濃度變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=198.993，P=0.000），兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，IR組血肌酐濃度高于S組（t=19.938，P=0.000），但SM組血肌酐濃度較IR 組低（t=9.377，P=0.000），但高于 S組（t=10.561，P=0.000）。各組大鼠血尿素氮濃度變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=450.588，P=0.000），IR 組血尿素氮濃度高于 S組（t=30.472，P=0.000），但 SM 組血尿素氮濃度較IR組低（t=20.183，P=0.000）。見表1。

2.2 腎臟病理結(jié)果

S組腎小球、腎小管清晰可見，結(jié)構(gòu)完整，無異常改變。IR組鏡下可見腎組織皮髓質(zhì)交界區(qū)大量腎小管腫脹、壞死，刷狀緣脫落，部分腎小管阻塞，腎間質(zhì)有大量中性粒細(xì)胞浸潤。SM組腎小管腫脹較輕，無壞死及未見腎基膜破裂及刷狀緣脫落，腎間質(zhì)僅有少量中性粒細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果

IR組腎組織中包漿IL-6、胞核NF-κB p65表達(dá)水平高于S組，SM組包漿IL-6、胞核NF-κB p65表達(dá)較IR組降低，但仍高于S組。見圖2、3。

表1 各組大鼠血肌酐及血尿素氮濃度比較 （n=10，±s）

表1 各組大鼠血肌酐及血尿素氮濃度比較 （n=10，±s）

注：1）與 S組比較，P ＜0.05；2）與 IR 組比較，P＜0.05

組別血肌酐/（μmol/L）血尿素氮/（mmol/L）S 組（n=10） 46.67±5.20 6.02±0.42 IR 組（n=10） 151.51±15.521） 27.59±2.511）SM 組（n=10） 102.21±12.121） 13.31±1.011）2）F值 198.993 450.588 P值 0.000 0.000

圖1 各組大鼠腎小管染色結(jié)果比較 （HE×400）

2.4 ELISA檢測結(jié)果

各組大鼠細(xì)胞核NF-κB濃度變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=95.892，P=0.000），IR 組細(xì)胞核 NF-κB濃度高于 S組（t=13.694，P=0.000），但SM組NF-κB濃度較IR組低（t=8.639，P=0.000），但高于S組（t=5.055，P=0.000）。各組大鼠細(xì)胞質(zhì)IL-6濃度變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1618.489，P=0.000），IR 組細(xì)胞質(zhì)IL-6濃度高于 S組（t=56.892，P=0.000），SM組 IL-6濃度高于 S組（t=28.022，P=0.000），SM 組IL-6濃度較IR組低（t=28.870，P=0.000）。見表2。

圖2 各組大鼠IL-6的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

圖3 各組大鼠NF-κB p65的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

表2 各組大鼠腎臟細(xì)胞核NF-κB及細(xì)胞漿IL-6濃度比較 （n=10，ng/g，±s）

表2 各組大鼠腎臟細(xì)胞核NF-κB及細(xì)胞漿IL-6濃度比較 （n=10，ng/g，±s）

注：1）與 S組比較，P ＜0.05；2）與 IR 組比較，P ＜0.05

組別 NF-κB IL-6 S 組（n=10） 0.62±0.06 144.32±23.91 IR 組（n=10） 1.47±0.211） 1 890.31±97.641）SM 組（n=10） 0.93±0.111）2） 1 004.31±63.431）2）F值 95.892 1618.489 P值 0.000 0.000

3 討論

在正常腎臟組織中，炎癥因子水平較低，但在病理狀態(tài)下易急劇升高，腎小球濾過率快速下降與腎小管、腎小球的變化伴隨間質(zhì)性炎癥有關(guān)[17]，IRI可以通過誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、刺激白細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、降低微小血管的血流量引起急性腎損傷[18]。建立缺血再灌注損傷模型很多，該損傷均與炎癥反應(yīng)有較為密切的關(guān)系。炎癥是導(dǎo)致腎臟IRI的主要因素[19]，大量的炎癥介質(zhì)與腎臟IRI有關(guān)，如IL-6可以激活中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等向損傷部位聚集，發(fā)生炎癥反應(yīng)損傷腎組織。在缺血再灌注損傷后，TNF-α抑制劑減輕炎癥改變[20]。在HgCl2介導(dǎo)的大鼠急性腎損傷模型中，腎臟IL-19的表達(dá)水平較高[21]。在遭受IRI的細(xì)胞懸液中，模型組中的TNF-α、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白 -1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）濃度高于對照組[22]。在本實驗中，IR組腎組織中IL-6的表達(dá)升高，而在SM組IL-6表達(dá)降低。

一直以來，NF-κB通路被認(rèn)為是典型的促炎信號通路，很大程度上被細(xì)胞因子、趨化因子及黏附分子等促炎基因的表達(dá)影響[23]，NF-κB可以被多種致病因素活化，有文獻(xiàn)報道，NF-κB在缺血時活化，再灌注12 h開始升高，2～3 d達(dá)到頂峰[24]。預(yù)先給予大鼠NF-κB抑制劑不僅抑制由IR引起的NF-κB的活化，且阻止MCP-1 mRNA的表達(dá)，表明NF-κ B在IRI炎癥的開始占有重要角色[25]。轉(zhuǎn)錄因子p65是NF-κB家族中的一員，可以調(diào)節(jié)大多數(shù)NF-κB靶基因[26]，p65基因敲除大鼠只會有較弱的外周炎癥反應(yīng)[27]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前給予大鼠水飛薊素灌胃7 d，與IR組相比，SM組降低血清肌酐、血清尿素氮及中性粒細(xì)胞的浸潤，改善了腎功能，減輕腎小管損傷，免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞核NF-κBp65及細(xì)胞漿IL-6表達(dá)水平較IR降低，ELISA檢測腎組織勻漿細(xì)胞核NF-κB及細(xì)胞漿IL-6濃度SM組偏低，表明水飛薊素可以改善腎功能，抑制NF-κB的活化，進(jìn)而降低IL-6的表達(dá)。

綜上所述，目前研究可以證實水飛薊素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用其可能與抑制NF-κB活化有關(guān)。臨床腎缺血再灌注損傷患者病情較為復(fù)雜，常常合并多種疾病，且目前并未明確有效保護(hù)腎臟IRI的藥物應(yīng)用于臨床，而本實驗發(fā)現(xiàn)水飛薊素可以改善大鼠腎功能、減輕腎臟損傷，其與抑制NF-κB的活化有關(guān)，此外水飛薊素還對心臟、腦、胃及腸IRI有保護(hù)作用，更適合臨床應(yīng)用。但水飛薊素是否可以通過影響ⅠκB的活性抑制NF-κB活化還需進(jìn)一步研究。

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Protective effect of Silymarin on renal ischemia-reperfusion injury in rats

Jian Dong,Jie Yang,Guo-hui Shi
(Department of Nephrology,North China University of Science and Technology Affiliated Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Silymarin on renal ischemia-reperfusion injury(IRI)and its underlying inhibiting mechanism towards nuclear factor κB(NF-κB).MethodsA total of 30 male sprague-dawley(SD)rats were randomly divided into three groups:sham operation(S)group,IRI (IR)group and IRI plus Silymarin(SM)group.Serum creatinine(Cr)and blood urea nitrogen(BUN)were analyzed with automatic biochemical analyzer.Hematoxylin-eosin (HE)staining was performed for histological grading of kidney injury.Expression of interleukin 6 (IL-6)and NF-κB p65 was identified by Immunohistochemical staining and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsCirculating Cr,BUN,NF-κB and IL-6 were elevated significantly in the IR group compared with those in the S group (P＜0.05),and those in the SM group (P＜0.05).Animals in the IR group experienced obvious increase of renal tubular damage and expression of IL-6 and NF-κB,which were ameliorated with treatment of Silymarin.ConclusionsInactivation of NF-κB signaling pathway mediates protective effect of Silymarin on renal ischemia-reperfusion.

Silymarin;rat;ischemia-reperfusion injury;NF-κB

R692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.004

1005-8982（2017）24-0017-05

2017-03-07

史國輝，E-mail：saint40@sina.com

（王榮兵 編輯）