趙惠娟 閆慧敏 郭獨(dú)一 朱培秋 雷鵬程 路雪艷 姜薇100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科

先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病一家系及PNPLA1基因突變分析

趙惠娟 閆慧敏 郭獨(dú)一 朱培秋 雷鵬程 路雪艷 姜薇100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科

目的鑒定一先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病家系的致病基因，并探討基因型與表型的關(guān)系。方法外周血中提取先證者及其哥、父母DNA，用全基因組外顯子測(cè)序明確先證者的突變位點(diǎn)，根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，用PCR來(lái)檢測(cè)突變位點(diǎn)從而進(jìn)一步確定該家系的致病原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者PNPLA1基因的一條等位基因第4號(hào)外顯子上700位的胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代（c.700C＞T），導(dǎo)致了脯氨酸變成了絲氨酸（p.pro234ser），先證者哥也檢測(cè)到相同突變；父母均為該突變基因的攜帶者，該突變?cè)诮】祵?duì)照者中未檢出。結(jié)論P(yáng)NPLA1基因的錯(cuò)義突變（p.pro234ser）是引起該患者臨床癥狀的特異突變。

遺傳性疾病，先天性；染色體障礙；突變；基因，PNPLA1；先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病

先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病（autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI；OMIM242300）是一種以皮膚干燥、全身脫屑為主要特點(diǎn)的角質(zhì)形成細(xì)胞分化障礙性疾病，有一定的遺傳異質(zhì)性，可伴有系統(tǒng)損害而出現(xiàn)相應(yīng)的綜合征。目前已證實(shí)該病的致病基因有 9 個(gè)：TGM1［1］、ALOX12B［2］、ALOXE3［2］、ABCA12［3］、NIPAL4 （ichthyin）［4］、CYP4F22［5］、CRE53［6］、LIPN3［7］、PNPLA1［8］，其中TGM1突變占34%～55%。PNPLA1基因自2012年首次發(fā)現(xiàn)為ARCI致病基因以來(lái)，迄今只報(bào)道5個(gè)家系。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)一個(gè)ARCI家系，在進(jìn)行基因突變研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該家系由PNPLA1基因突變所致，進(jìn)而對(duì)其發(fā)病的分子基礎(chǔ)與臨床表型之間的關(guān)系進(jìn)行了探討。

資料與方法

一、臨床資料

先證者男（圖1，Ⅳ2），14歲。因全身散在皮疹伴鱗屑14年就診?；純撼錾鬅o(wú)明顯誘因全身出現(xiàn)不規(guī)則迂曲斑片，暗紅色、覆有鱗屑、漸融合成片、無(wú)明顯自覺癥狀，偶伴癢感。其哥（Ⅳ1）15歲，出生時(shí)呈火棉膠樣?jì)雰罕憩F(xiàn)，隨年齡增長(zhǎng)皮疹逐漸減輕。其父母均無(wú)類似疾病史，但為近親結(jié)婚（Ⅲ1、Ⅲ2），見圖1。先證者皮膚科檢查：面部、前胸、下腹部、雙下肢可見散在迂曲的暗紅色、暗褐色斑上覆有灰白色鱗屑，部分皮損融合成片、鱗屑較厚，皮損部分邊緣微隆起（圖2A）。其哥僅見軀干、四肢皮膚干燥、粗糙，上覆細(xì)碎鱗屑（圖2B）。兩患兒毛發(fā)、指甲均正常；生長(zhǎng)發(fā)育正常、智力正常；無(wú)瞼外翻、唇外翻、耳聾等畸形。組織病理（取材于先證者及其哥股內(nèi)側(cè)皮膚）可見：①角化過度伴部分區(qū)域角化不全；②棘層肥厚；③表皮乳頭瘤樣增生；④真皮淺層血管周圍以淋巴為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2C、2D）。診斷ARCI。2例患者經(jīng)外用維生素E乳膏，早晚各1次，囑患者洗澡后即刻涂抹保濕潤(rùn)膚劑，使用3個(gè)月后皮損明顯減輕，鱗屑明顯減少。正常對(duì)照取材來(lái)源于同年齡、同部位切除色素痣男性的正常皮膚。

圖1 先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病家系圖 近親婚配

圖2 先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病患者臨床特點(diǎn)及組織病理 2A：先證者前胸、腹部皮損，可見暗褐色斑片，上覆灰白色鱗屑，部分區(qū)域融合成片；2B：先證者哥前胸、腹部皮損，可見前胸部皮膚干燥，上覆細(xì)碎鱗屑；2C、2D：先證者（2C）和先證者哥（2D）皮損組織病理 表皮角化過度伴部分區(qū)域角化不全，棘層肥厚，表皮乳頭瘤樣增生，真皮淺層血管周圍以淋巴為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×100）

二、提取基因組DNA

收集家系中先證者及其哥、父母及100例健康人靜脈血4 ml，并用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度及純度的測(cè)定。本研究通過北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者和健康人均簽署知情同意書。

三、全基因組外顯子測(cè)序

1.合格的DNA樣本送深圳華大基因研究院，用NimbleGen商業(yè)化2.1M外顯子序列捕獲芯片進(jìn)行外顯子組區(qū)域的測(cè)序。整個(gè)樣品制備過程包括雜交文庫(kù)制備、芯片雜交洗脫以及雜交后測(cè)序文庫(kù)制備，通過Illumina測(cè)序系統(tǒng)（IlluminaHiSeq 2000測(cè)序系統(tǒng)，美國(guó)Illumina公司）獲得外顯子序列信息。

2.測(cè)序驗(yàn)證：PNPLA1基因序列來(lái)自GenBank（NM_001145717），引物設(shè)計(jì)采用軟件Primer3，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，PNPLA1基因的8個(gè)外顯子被分成8個(gè)片段，其中擴(kuò)增4號(hào)外顯子合成。引物：PNPLA1正向引物5′?CATGGGCCATTTCGATGTAC?3′，反向引物5′?CCTAGTCCCTGGTACCTTCT?3′，引物由北京天一輝遠(yuǎn)測(cè)序公司合成。分別對(duì)患者、其父母、正常人的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用25 μl體系，包括2 × mix 12.5 μl，10 ng的引物1 μl，ddH2O 9.5 μl以及100 ng的樣本DNA 2 μl。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，退火溫度為58℃30 s，72℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠（溴化乙錠染色）電泳分析，經(jīng)酶純化后用ABIPrism377型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序（北京天一輝遠(yuǎn)測(cè)序公司）。

3.常染色體隱性遺傳性魚鱗病的臨床表現(xiàn)千差萬(wàn)別，最常見表現(xiàn)為丑角魚鱗病、板層狀魚鱗病和先天性非大皰性魚鱗病樣紅皮病3種，診斷主要依據(jù)出生時(shí)或嬰兒期皮損特點(diǎn)（多數(shù)出生時(shí)為膠樣?jì)雰海约斑z傳方式和分子生物學(xué)診斷。從臨床表現(xiàn)上該家系先證者的哥哥出生時(shí)為膠樣?jì)雰海?例患者的皮損表現(xiàn)符合ARCI三種亞型中的先天性非大皰性魚鱗病樣紅皮病的表現(xiàn)；父母均不患病，且為近親婚配；分子生物學(xué)檢測(cè)證實(shí)該家系中的2例患者均為純合突變，正常人100個(gè)等位基因驗(yàn)證并未發(fā)現(xiàn)該突變，而父母均為該致病基因PNPLA1（c.700C＞T）的攜帶者。因此明確診斷為ARCI。

圖3 健康人皮膚及先證者皮損透射電鏡（×12 000） 3A：健康人皮膚角質(zhì)層；3B：先證者皮膚角質(zhì)層，其中可見異常橢圓形脂滴（箭頭）；3C：健康人的角質(zhì)包膜；3D：患者的角質(zhì)包膜，角質(zhì)包膜不連續(xù)（箭頭）

圖4 測(cè)序結(jié)果及PNPLA1基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖 4A：PCR測(cè)序結(jié)果，Ⅳ1、Ⅳ2 PNPLA1第700位堿基由C突變?yōu)門，父母均為攜帶者，健康人第700位堿基為C；4B：PNPLA1基因結(jié)構(gòu)（上排包含8個(gè)外顯子，突變發(fā)生在4號(hào)外顯子上）及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（下排包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域），紅色箭頭示該家系突變位點(diǎn)；黑色箭頭示迄今世界上已報(bào)道的突變位點(diǎn)

結(jié) 果

1.透射電鏡結(jié)果：①與正常對(duì)照（圖3A、3C）相比，患者角質(zhì)層數(shù)明顯增多，高達(dá)40層；②患者皮膚角質(zhì)層中出現(xiàn)了很多異常的橢圓形的脂滴（圖3B）；③與正常人的皮膚中完整連續(xù)的角質(zhì)包膜相比，患者皮膚電鏡中角質(zhì)包膜是不連續(xù)的（圖3D）。

2.對(duì)先證者進(jìn)行了全基因組外顯子測(cè)序，后期進(jìn)行篩選，最終將致病基因鎖定為PNPLA1基因（NM_001145717），突變位點(diǎn)為4號(hào)外顯子上700位的胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代（c.700C＞T），導(dǎo)致了脯氨酸變成了絲氨酸（p.pro234ser）；后經(jīng)直接測(cè)序驗(yàn)證先證者的哥哥同樣存在相同突變，而父母均為攜帶者，在100例正常人中未發(fā)現(xiàn)該突變（圖4）。該突變符合此家系的遺傳方式，對(duì)測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001145717）及Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ensemble.org/）所公布的序列進(jìn)行比較，可排除單核苷酸多態(tài)性，并排除其他基因存在突變后，由此初步判斷該家系的致病基因?yàn)镻NPLA1。

討 論

ARCI主要包括3種亞型：花斑型魚鱗 病（harlequin ichthyosis，HI；OMIM 242500）、先天性非大皰性魚鱗病樣紅皮 病（congenital ichthyosiformerythro?derma，CIE；OMIM 242100）及板層狀魚鱗 ?。╨amellar ichthyosis，LI；OMIM 242300、604777、601277、606545）［9］，不同類型的ARCI臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重程度迥異，其中HI是最嚴(yán)重致死的一種類型。目前已證實(shí)，與ARCI發(fā)病相關(guān)的有9個(gè)致病基因，其中相對(duì)少見的是CRE53、LIPN和PNPLA1，且目前已知的致病基因與臨床表型尚無(wú)明確關(guān)系。PNPLA1基因位于6p21.31，自從2012年證實(shí)該病與PNPLA1基因突變有關(guān)以來(lái)［8］，全世界共報(bào)道了5個(gè)家系，其中4個(gè)錯(cuò)義突變，1個(gè)無(wú)義突變（圖4B），2個(gè)家系來(lái)自阿爾及利亞［8］，2個(gè)家系來(lái)自巴基斯坦［10?11］，還有 1 個(gè)家系來(lái)自西班牙［12］。PNPLA1基因全長(zhǎng)1 599 bp，包括8個(gè)外顯子，編碼533個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，PNPLA1蛋白屬于馬鈴薯糖蛋白家族之一，PNPLA1蛋白有3個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖4B），馬鈴薯糖蛋白結(jié)構(gòu)域（Patatin區(qū)，第16～185位氨基酸）和脯氨酸富集疏水區(qū)（Pro_rich區(qū)，第326～ 451位氨基酸）［13］，目 前 PNPLA1 的 功 能 尚 不 清 楚［14］，PNPLA1蛋白除了在消化系統(tǒng)、骨髓、脾臟中高表達(dá)，在表皮顆粒層等其他組織中也有少量表達(dá)［13］。

通過全基因組外顯子及PCR測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)，PNPLA1基因的錯(cuò)義突變（c.700C ＞T，p.Pro234Ser）是導(dǎo)致該家系中2例ARCI患者發(fā)病的主要原因。通過透射電鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)患者皮膚角質(zhì)層中出現(xiàn)了很多異常的橢圓形脂滴，說(shuō)明患者的脂質(zhì)代謝途徑存在異常，而脂類是角質(zhì)包膜（cornified envelope，CE）不可分割的一部分；與正常人的皮膚中完整連續(xù)的CE相比，患者的CE是不連續(xù)的，說(shuō)明患者CE的合成過程存在障礙。正常CE的形成是角質(zhì)形成細(xì)胞正常分化的重要環(huán)節(jié)，也是皮膚屏障功能的重要組成成分，正常的角質(zhì)包膜形成過程需要轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，內(nèi)披蛋白，兜甲蛋白，脂質(zhì)等［15］。近年的研究表明，PNPLA1參與甘油磷脂的代謝［8］，甘油磷脂參與角質(zhì)包膜的合成［16］，因此我們推測(cè)，PNPLA1突變導(dǎo)致脂質(zhì)代謝障礙，影響正常角質(zhì)包膜合成，影響角質(zhì)形成細(xì)胞正常分化導(dǎo)致ARCI發(fā)生。我們的研究為進(jìn)一步研究ARCI基因型與表型之間的關(guān)系提供了資料。

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第三屆全國(guó)銀屑病學(xué)術(shù)會(huì)議征文通知

為了讓皮膚科醫(yī)師了解國(guó)內(nèi)外關(guān)于銀屑病研究的最新動(dòng)向，分享知名專家的臨床診治經(jīng)驗(yàn)，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)定于2018年9月21-23日在上海召開“第三屆全國(guó)銀屑病學(xué)術(shù)會(huì)議”。會(huì)議將邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)外知名專家報(bào)告他們?cè)阢y屑病基礎(chǔ)與臨床的最新研究進(jìn)展，演講者報(bào)告形式多樣、內(nèi)容豐富。歡迎從事銀屑病基礎(chǔ)及臨床研究的皮膚科醫(yī)師和相關(guān)人員踴躍投稿和參會(huì)。

一、投稿要求：①投稿內(nèi)容：銀屑病基礎(chǔ)研究論文、銀屑病臨床診斷和治療等方面的論文、典型與疑難病例等；②投稿方式：中文全文和400字以內(nèi)的中文摘要，請(qǐng)通過電子郵件投稿，Email：pfkxh@126.com。來(lái)稿請(qǐng)注明第三屆全國(guó)銀屑病學(xué)術(shù)會(huì)議征文，截稿日期：2018年8月1日；③會(huì)議交流形式：特邀演講、大會(huì)發(fā)言、分會(huì)發(fā)言、書面交流。

二、聯(lián)系方式：上海市黃浦區(qū)成都北路500號(hào)峻嶺廣場(chǎng)19樓1908室，上海長(zhǎng)征醫(yī)院《中國(guó)真菌學(xué)雜志》編輯部，郵編200003，Email：pfkxh@126.com，聯(lián)系人：施慧，021-81885497，手機(jī)13764560811。

Mutation analysis of the PNPLA1 gene in a family with autosomal recessive congenital ichthyosis

Zhao Huijuan,Yan Huimin,Guo Duyi,Zhu Peiqiu,Lei Pengcheng,Lu Xueyan,Jiang Wei
Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

Jiang Wei,Email:jiangwei7366@163.com

ObjectiveTo identify a causative gene of autosomal recessive congenital ichthyosis（ARCI）in a Chinese family,and to analyze the genotype?phenotype correlation.MethodsPeripheral blood samples were collected from the proband,his elder brother and parents,and genomic DNA was extracted from these blood samples.Genome?wide exome sequencing was conducted to determine the mutation site in the proband,and then allele?specific oligonucleotide primers were designed based on the mutation site.PCR was performed to detect the mutation site to further identify the causative gene of ARCI in the family.ResultsA new homozygous missense mutation was identified in exon 4 in 1 allele of the PNPLA1 gene in the proband,which led to a codon change from cytosine（C）to thymine（T）at position 700（c.700C ＞ T）and resulted in the substitution of proline by serine（p.pro234ser）.The same mutation was also detected in the proband′s brother,and his parents were the mutation carriers.No mutations were found in unrelated healthy Chinese individuals.ConclusionThe missense mutation in the PNPLA1 gene（p.pro234ser）is associated with clinical symptoms of the patient with ARCI.

Genetic diseases,inborn;Chromosome disorders;Mutation;Genes,PNPLA1;Autosomal recessive congenital ichthyosis

姜薇，Email：jiangwei7366@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201216）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81201216）

2016?09?28）

（本文編輯：吳曉初）