邢玉鳳， 劉東海， 張淑紅， 張玉萍， 朱金玲

阿魏酸對戊四氮致癲癇大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

邢玉鳳， 劉東海， 張淑紅， 張玉萍， 朱金玲

目的探討阿魏酸(Ferulic acid,FA)對戊四氮致癲癇大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響,近而討論FA對戊四氮致癲癇鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法將60只雄性健康的Wister大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、模型組(PTZ 35 mg/kg)和阿魏酸干預(yù)組(50 mg/kg)，均采用腹腔注射的方式，連續(xù)注射28 d，停止給藥1 d后處死實(shí)驗(yàn)大鼠、取材。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western blot方法來檢測Bax和Bcl-2的表達(dá)情況，用來判斷癲癇所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果阿魏酸干預(yù)組大鼠的海馬組織Bax的表達(dá)量明顯低于模型組，差異有顯著性(P<0.01)，Bcl-2的表達(dá)量高于模型組，差異有顯著性(P<0.01)；生理鹽水組大鼠的海馬組織內(nèi)Bax的表達(dá)量明顯低于模型組，差異有顯著性(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)量明顯高于模型組，差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)論阿魏酸對戊四氮致癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用機(jī)制可能與其抑制鼠腦細(xì)胞凋亡有關(guān)。

阿魏酸； 癲癇； 戊四氮； Bax； Bcl-2

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，我國癲癇發(fā)病率在3.5%～4.8%[1]。其病理表現(xiàn)為大腦神經(jīng)元反復(fù)異常放電導(dǎo)致的大腦功能失調(diào)。癲癇的發(fā)生與神經(jīng)元的凋亡、神經(jīng)元的興奮性增加及突觸的異常等相關(guān)[2]。癲癇異常放電導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷可能導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。阿魏酸對脂多糖損傷大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用已被證實(shí)[3]，阿魏酸在治療心腦血管疾病中具有很好的耐藥性，但目前沒有人去探討其對癲癇的影響,因此我們選擇阿魏酸來探討其對戊四氮致癲癇大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 Rabbit Anti Bax，Rabbit Anti Bcl-2，Mouse Anti β-actin，Goat Anti-Mouse IgG，Goat Anti-Rabbit IgG，考馬斯亮藍(lán)染色液，考馬斯亮藍(lán)脫色液，5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)，SDS(武漢博士德生物工程有限公司)。彩虹245廣譜蛋白Marker，PMSF(100 mmol)，10×電泳液，10×轉(zhuǎn)膜液，20×TBS(北京索萊寶科技有限公司)。BCA試劑盒，ECL化學(xué)發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。兔SP檢測試劑盒，DAB 試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。戊四氮(Sigma公司)，阿魏酸(上海源葉生物科技有限公司)其他試劑均由分子實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 分組和模型的建立 選擇30只體重在(200±20)g之間健康雄性Wistar大鼠(佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),采用隨機(jī)數(shù)字表法將其平均分為3組：生理鹽水組、模型組(PTZ)、阿魏酸(PTZ+FA)干預(yù)組，每組10只。每天12點(diǎn)將戊四氮(35 mg/kg)和生理鹽水腹腔注射大鼠體內(nèi)，在注射PTZ前20 min注射阿魏酸(50 mg/kg)，連續(xù)注射28 d，最后一次給藥24 h后，用10%的水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，用隨機(jī)數(shù)字表法將每組大鼠隨機(jī)分為兩組，一組采用心臟灌注固定取腦，左右大腦半球置于10%甲醛中固定，待用于免疫組化檢測；另一組斷頭取海馬區(qū)置于液氮中保存，待用于Western blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白。

1.3 免疫組化SP法檢測大鼠海馬內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá) 從10%的中性甲醛中取出固定好的腦組織，取視交叉后4～5 mm即海馬平面。石蠟脫水，石蠟包埋，切片(5 μm)，烤片(56 ℃，24 h)，石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟后用枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)水浴97 ℃20 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。37 ℃3%H2O2去離子水孵育15 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。37 ℃山羊血清封閉20 min，吸去封閉液滴加一抗(Bax、Bcl-2 1∶200)37 ℃孵育2 h。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液37 ℃孵育20 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。DAB顯色，顯微鏡下控制時(shí)間。PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次。蘇木精復(fù)染30 s、返藍(lán)10 min。常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片，顯微鏡拍照并觀察海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞。用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對圖片進(jìn)行平均光密度分析。

1.4 Western blot方法檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá) 從液氮中取出海馬組織，放入2 ml的EP管中倒入磁珠和Western細(xì)胞裂解液，用組織研磨機(jī)將組織碾碎致勻漿，4 ℃靜置30 min后，4 ℃ 12000 rpm 離心10 min，取上清液。用BCA試劑盒測蛋白的濃度，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液55 ℃水浴10 min，恢復(fù)室溫。凝膠:下層膠采用15%的分離膠(10 ml)；上層膠采用5%的壓縮膠(3 ml)。電泳：上層壓縮膠恒壓70 V；下層分離膠恒壓120 V，至膠板最下端1 cm處停止。并按照Marker和目的蛋白的分子量來切膠。轉(zhuǎn)膜：將PVDF膜裁剪合適的大小，甲醇浸潤20 s，用電轉(zhuǎn)液將纖維層和濾紙浸濕。按照陰極-纖維層-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-纖維層-陽極順序制作“三明治”，用電壓100 V、電流200 mA進(jìn)行電轉(zhuǎn)。37 ℃ 5%脫脂奶粉(TBS溶解)封閉1.5 h。一抗孵育4 ℃過夜(β-actin 1∶1000，Bax 1∶200，Bcl-2 1∶200)。TBST 5 min/遍，洗3遍。二抗室溫孵育1 h(HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 1∶1000)。TBST 5 min/遍，洗3遍，ECL曝光。使用天能GLS拍照并進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶的光密度值比。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化SP法檢測的大鼠海馬內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 Bax、Bcl-2蛋白免疫反應(yīng)表現(xiàn)為棕色或棕黃色定位于細(xì)胞胞漿內(nèi),結(jié)果(見圖1、圖2)。阿魏酸干預(yù)組大鼠的海馬組織Bax的表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.01)，生理鹽水組Bax的表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.01)(見圖1);阿魏酸干預(yù)組大鼠的海馬組織bcl-2的表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.01),生理鹽水組大鼠的海馬組織內(nèi)Bcl-2明顯高于模型組(P<0.01)(見圖2)。

2.2 Western blot方法檢測的Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 阿魏酸干預(yù)組大鼠的海馬組織Bax的表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.01)，生理鹽水組Bax的表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.01)；阿魏酸干預(yù)組大鼠的海馬組織Bcl-2的表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.01),生理鹽水組大鼠的海馬組織內(nèi)Bcl-2明顯高于模型組(P<0.01)(見圖3)。

圖1A 是生理鹽水組(NS)，模型組(PTZ),阿魏酸干預(yù)組(PTZ+FA)海馬CA1區(qū)免疫組化圖片(×200);圖1B 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞Bax平均光密度(生理鹽水組、阿魏酸干預(yù)組分別和模型組相比P<0.01)

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)

圖2A 是生理鹽水組(NS)，模型組(PTZ),阿魏酸干預(yù)組(PTZ+FA)海馬CA1區(qū)免疫組化圖片(×200);圖2B 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2平均光密度(生理鹽水組、阿魏酸干預(yù)組分別和模型組相比P<0.01)

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)

圖3 Western blot方法檢測的大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

癲癇是慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征,以腦神經(jīng)元異常放電引起反復(fù)癇性發(fā)作為特征。癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一,在我國的發(fā)病率在3.5%～4.8%,嚴(yán)重影響了人類健康。目前苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鈉是廣泛應(yīng)用的一線抗癲癇藥，但30%患者出現(xiàn)耐藥性，為此尋找新的抗癲癇藥物，研究癲癇的發(fā)病機(jī)制成為人們研究的熱點(diǎn)。

戊四氮點(diǎn)燃大鼠慢性癲癇模型與人類癲癇發(fā)作十分相似，有病理反應(yīng)的局灶部位的確定性、病理反應(yīng)的漸進(jìn)性、效應(yīng)的穩(wěn)定性和持久性等優(yōu)點(diǎn)；且戊四氮本身不具有神經(jīng)毒性，不會(huì)直接造成神經(jīng)元的凋亡[4]。是理想的癲癇動(dòng)物模型。目前廣泛應(yīng)用于抗癲癇新藥的實(shí)驗(yàn)研究中。為此我們選用戊四氮誘導(dǎo)的癲癇模型鼠，研究阿魏酸對癲癇大鼠的腦的保護(hù)作用，及其可能的發(fā)生機(jī)制。

阿魏酸(FA)是廣泛使用的藥材的重要組成部分，屬于羥基肉桂酸家族。FA在許多植物的葉子和種子中高度豐富，特別是在糙米、全麥和燕麥等谷物中，已被認(rèn)為具有許多藥理學(xué)性質(zhì)，包括神經(jīng)元祖細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)活性[5,6]。許多實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道了FA的神經(jīng)保護(hù)作用，包括腦損傷、脊髓缺血和阿爾茨海默氏病[7～9]，但目前沒有人應(yīng)用阿魏酸對癲癇進(jìn)行研究腦保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行研究，目前已有研究證實(shí)阿魏酸具有抗細(xì)胞凋亡作用[10～12]，而癲癇導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷會(huì)引起細(xì)胞凋亡，我們推測阿魏酸可以抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)癲癇導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。因此我們選擇阿魏酸來探討其對戊四氮致癲癇大鼠腦海馬區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)的影響。

B淋巴細(xì)胞瘤-2基因簡稱Bcl-2,是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。Bcl-2蛋白家族是一個(gè)特別的家族，其成員中有些促進(jìn)凋亡，如Bad、Bid、Bax，有些成員阻止細(xì)胞凋亡,如Bcl-2、 Bcl-x、Bcl-w。其中Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，如果Bax相對量高于Bcl-2，則Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡；而如果Bcl-2相對量高于Bax，則促進(jìn)形成Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl-2同二聚體的量增多，從而抑制細(xì)胞凋亡。我們的研究結(jié)果顯示：阿魏酸干預(yù)組大鼠的海馬組織CA1區(qū)的Bax蛋白的表達(dá)量明顯低于模型組;相反Bcl-2的表達(dá)量高于模型組;生理鹽水組大鼠的海馬組織內(nèi)Bcl-2明顯高于模型組;Bax的表達(dá)量明顯低于模型組，說明阿魏酸可促進(jìn)Bcl-表達(dá)，降低Bax表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。阿魏酸可減少戊四氮致癲癇鼠的癲癇發(fā)作強(qiáng)度和頻率以及癲癇發(fā)作時(shí)間。阿魏酸對大鼠海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用，抗凋亡可能是其作用的機(jī)制之一。

[1]張曉莉，張曉莉，曾 皎,等.5種抗癲癇藥物單藥治療初診癲癇患兒2a單藥保留率比較[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，33(4):297-301.

[2]Kai K,Ruusuvuori E,Seja P,et al.GABA actions and Ionicplasticity in epilepsy[J].Curr Opin Neurobiol,2014,26(5):34-41.

[3]黃 浩，馬增春，王宇光,等.阿魏酸對脂多糖損傷的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2016,4:330-337.

[4]Hurgel M,Ivy GO.Astrocytes in kindling:relevance to epileptogenesis[J].Epilepsy Res,1996,26(1):163-175.

[5]Yabe T,Hirahara H,Harada N,et al.Ferulic acid induces neural progenitor cell proliferation in vitro and in viv[J].Neuroscience,2010,165(2):515-524.

[6]Kim BW,Koppula S,Park SY,et al.Attenuation of neuroinflammatory responses and behavioral deficits by Ligusticum officinale (Makino) Kitag in stimulated microglia and MPTP-induced mouse model of Parkinson’s disease[J].J Ethnopharmacol,2015,164:388-397.

[7]Mori T,Koyama N,Guillot-Sestier MV,et al.Ferulic acid is a nutraceutical β-secretase modulator that improves behavioral impairment and alzheimer-like pathology in transgenic mice[J].PLoS One,2013,8(2):e55774.

[8]Sultana R,Ravagna A,Mohmmad-Abdul H,et al.Ferulic acid ethyl ester protects neurons against amyloid beta-peptide (1-42)-induced oxidative stress and neurotoxicity: relationship to antioxidant activity[J].J Neurochem,2005,92(4):749-758.

[9]Koh PO.Ferulic acid prevents cerebral ischemic injury-induced reduction of hippocalcin expression[J].Synapse,2013,67(7):390-398.

[10]林秉獎(jiǎng)，閔 瑋，駱 丹.中波紫外線對HaCaT細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期變化及p16、c-myc蛋白表達(dá)的影響及阿魏酸干預(yù)作用研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2010,1:8-11.

[11]張立才.脊髓損傷大鼠細(xì)胞凋亡、自噬程度的評估及阿魏酸的干預(yù)作用研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2017,10:1308-1311.

[12]Katarzyna Kotulska,Wieslaw Magdalena,Larysz-Brysz,et al.Impaired regeneration of bcl-2 lacking peripheral nerves[J].Neurological Research,2005,27(12):843-849.

EffectsofferulicacidontheexpressionofBaxandBcl-2proteininhippocampusofpentylenetetrazole-inducedepilepsyrats

XINGYufeng,LIUDonghai,ZHANGShuhong,etal.

(SchoolofBasicMedicalSciencesofJiamusiUniversity,Jiamusi154007,China)

ObjectiveTo investigate the effect of ferulic acid (FA) on the expression of Bax and Bcl-2 protein in hippocampus of pentylenetetrazole (PTZ)-induced epilepsy rats,and to discuss the protective effect of FA on hippocampal neurons in pentylenetetrazol-induced epilepsy effect.Methods60 male healthy wister rats were randomly divided into saline group，model group (PTZ 35 mg/kg) and ferulic acid intervention group (50 mg/kg).The rats were injected intraperitoneally with continuous 28 days,the rats were sacrificed after one day.Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of Bax and Bcl-2,which were used to determine the apoptosis induced by epilepsy.ResultsThe expression of Bax in the hippocampus was significantly lower than that in the model group (P<0.01).The expression of Bcl-2 was significantly higher than that of the model group (P<0.01).ConclusionFerulic acid has protective effect on hippocampal neuronal injury induced by pentylenetetrazole in epilepsy rats,and its protective mechanism may be related to its inhibition of brain cell apoptosis.

Ferulic acid; Epilepsy; Pentylenetetrazole; Bax； Bcl-2

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0919-03

2017-08-20；

2017-10-04

佳木斯大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助(No.CXTDPY-201602)

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

通迅作者：朱金玲，E-mail:370786436@qq.com