任曉宇，裴曉靜，張少云，謝立娜，杜文博，鎖 然

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000)

實驗技術(shù)

微波水解衍生高效液相色譜法測定飼料中的氨基酸

任曉宇，裴曉靜，張少云，謝立娜，杜文博，鎖 然*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000)

建立了一種微波水解衍生高效液相色譜同時測定飼料中17種氨基酸含量的方法。采用2,4-二硝基氯苯作為柱前衍生試劑，利用C18色譜柱分離。二極管陣列檢測器進行檢測，檢測波長為360 nm，并對微波水解時間及溫度進行優(yōu)化。17 種氨基酸在2.5～50 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.990 7～0.999 9；相對標準偏差為0.88%～4.2% ；加標回收率為90.6%～107.2%；檢出限為0.15～2.37 mg/L。研究結(jié)果表明，150 ℃下微波水解16 min的結(jié)果與傳統(tǒng)加熱水解(110 ℃，24 h)的效果基本相同。該方法分析時間較短，靈敏度較高，可用于飼料中氨基酸含量的檢測。

微波水解；氨基酸；高效液相色譜法；柱前衍生；飼料

飼料中的蛋白質(zhì)是畜禽的重要營養(yǎng)物質(zhì)，動物對蛋白質(zhì)的需求源自對氨基酸的需求。因此，飼料中的氨基酸含量是衡量飼料質(zhì)量的重要指標。氨基酸的國家標準檢測方法[1]是以茚三酮為衍生劑試劑采用柱后衍生的離子色譜法。但該方法分析時間長，工作量大，且有一定的實驗誤差[2]。柱前衍生高效液相色譜法測定氨基酸具有分析時間較短、靈敏度高等優(yōu)點[3],近年來的應(yīng)用日益增多。對蛋白質(zhì)中氨基酸的分析使用最為廣泛的衍生方法是加熱水解。但該法樣品前處理時間較長，操作繁瑣，勞動強度大[2]。

1975年Abu-Samra等[4]首次將微波技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的水解。微波水解是將樣品、酸置于微波電磁場中，微波頻率使極性分子取向快速變換，分子在來回轉(zhuǎn)動過程中與周圍分子高速碰撞摩擦，增加總能量,產(chǎn)生高熱。容器密閉產(chǎn)生的高溫高壓加速了水解過程，但氨基酸的化學(xué)形式不變[5-7]。近年來，越來越多人應(yīng)用微波消解儀對蛋白質(zhì)進行水解[8-10]，該法可以一次處理多個樣品，消耗時間短，可大大減少樣品前處理的時間，降低檢測成本，提高檢測氨基酸的效率[11-13]，并且能達到與加熱水解相同的結(jié)果[14]。

本研究將微波水解和衍生相結(jié)合測定飼料中的氨基酸。通過對微波水解的時間和溫度進行優(yōu)化，建立了一種快速檢測飼料中氨基酸的方法。與常規(guī)水解相比，微波水解的效果較好。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

飼料：蛋白飼料，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院提供。

17種氨基酸標準品：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)的純度均≥99%，購于北京拜爾迪生物技術(shù)公司和美國 Sanland 公司；乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；2,4-二硝基氯苯(分析純，純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司)；碳酸氫鈉、碳酸鈉、乙酸鈉、三乙胺、冰乙酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀(低壓梯度泵，自動進樣器，PDA檢測器)：美國Waters公司；TANK微波消解儀(海能儀器公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；高速中藥粉碎機(浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司)；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(保定高新區(qū)陽光科教儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；HW.SY21-K電熱恒溫水浴鍋(北京長風(fēng)儀器儀表公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1溶液的配制緩沖鹽：0.53 g Na2CO3和0.42 g NaHCO3分別溶于10 mL水中，取700 μL Na2CO3加入到10 mL NaHCO3溶液中(pH 9.0)。

衍生劑：0.3 g 2,4-二硝基氯苯溶于1 mL乙腈中。

氨基酸標準溶液：分別準確稱取17種氨基酸標準品各0.1 g(精確至0.000 1 g)置于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL，混勻，得到1 000 mg/L的17種氨基酸混合標準儲備液，4 ℃保存。然后逐級稀釋成2.5、5、10、25、50 mg/L的氨基酸混合標準液，4 ℃保存。

1.3.2樣品水解加熱水解法：將飼料樣品經(jīng)中央粉碎機粉碎，準確稱取0.3 g(精確至0.000 1 g)于安培瓶中，加入10 mL的6 mol/L鹽酸，在110 ℃烘箱中水解24 h。放置冷卻至室溫后，用容量瓶定容至10 mL，經(jīng)離心后取上清液1 mL用真空抽干，最后用2 mL的0.1 mol/L鹽酸水溶液回溶，渦旋混勻，備用。

微波水解法：準確稱取0.3 g(精確至0.000 1 g)樣品置于微波消解罐中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，立刻安裝消解罐，控制時間與溫度進行提取與水解。水解完成后，用移液槍將水解液轉(zhuǎn)移并用6 mol/L鹽酸定容至10 mL容量瓶中，經(jīng)離心后取上清液1 mL真空抽干，最后用2 mL 0.1 mol/L鹽酸水溶液回溶，渦旋混勻，備用。

1.3.3氨基酸衍生取100 μL標準溶液或樣品水解液于1.5 mL扎孔的小離心管中，加入200 μL緩沖鹽和100 μL衍生劑，于90 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)90 min。待冷卻后加入50 μL的10%乙酸調(diào)節(jié)pH值，最后用水定容至1 mL，混勻，取上清液過0.45 μm有機膜，供HPLC檢測。

1.3.4色譜條件色譜柱：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：40 ℃；檢測波長：360 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。流動相：A為純乙腈，B為2.5 g/L乙酸鈉(含 1.5 mL 三乙胺，用冰醋酸調(diào)至pH 5.25)。梯度洗脫程序：0～10 min，18%A；10～15 min，18%～20%A；15～30 min，20%～34%A；30～35 min，34%～45%A；35～38 min，45%～55%A；38～42 min，55%～60%A；42～45 min，60%～18%A。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波水解條件的優(yōu)化

2.1.1微波水解溫度固定微波功率800 W，水解時間15 min，其他條件固定不變，考察了不同水解溫度(130、140、150、160、170、180 ℃)對檢測結(jié)果的影響[15]。結(jié)果表明，溫度變化對天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的影響最大。隨著溫度的升高，這7種氨基酸的峰面積逐漸升高，當溫度達到150 ℃時，峰面積達到最大；但繼續(xù)升高溫度，一些氨基酸會受到一定的破壞，導(dǎo)致峰面積逐漸降低。其余10種氨基酸受溫度影響不大，而且在150 ℃時峰面積幾乎最大。因此選擇最佳微波水解溫度為150 ℃。

2.1.2微波水解時間固定微波功率800 W，水解溫度150 ℃，其他條件不變，考察不同水解時間(10、12、14、16、18、20 min)對17種氨基酸測定結(jié)果的影響[16]。結(jié)果表明，水解時間的變化對天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的影響較大。隨著水解時間的增加，上述9種氨基酸的峰面積逐漸升高，當水解時間為16 min時峰面積達到最大，隨后又逐漸降低。其余8種氨基酸雖受水解溫度影響較小，但在16 min時均有較高的峰面積。因此選擇最佳微波水解時間為16 min。

2.2 線性范圍與檢出限

分別取100 μL不同濃度的氨基酸標準溶液進行衍生后，供HPLC檢測。以氨基酸的峰面積為縱坐標(y)，氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(x，mg/L)進行線性擬合，并以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，17種氨基酸在2.5～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.990 7～0.999 9之間，LOD為0.15～2.37 mg/L。

表1 17種氨基酸的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and detection limits of the method for 17 amino acids

2.3 方法精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性

取標準溶液100 μL衍生后，連續(xù)進樣5次測定色譜峰峰面積，計算17種氨基酸的相對標準偏差(RSD)為0.16%～5.7%(n=5)。再將其衍生的標準品在室溫放置0、1、2、3、4 d后進行測定，計算得RSD為0.18%～7.6%(n=5)；取同一樣品5份，經(jīng)提取、衍生后測定色譜峰峰面積，RSD為0.20%～4.6%(n=5)。以上結(jié)果表明，該方法精密度高、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于飼料中17種氨基酸的分析。

2.4 加標回收率實驗

準確稱取5份已知含量的飼料樣品0.3 g，分別加入一定量的氨基酸標準溶液，經(jīng)衍生后供HPLC分析，進行回收率測定。由表2可知，飼料中氨基酸的平均回收率為90.6%～107.2%，RSD為 0.88%～4.2%。其中甲硫氨酸、賴氨酸以及酪氨酸的加標回收率較低，可能是由于高溫部分氧化導(dǎo)致。該方法的準確度較高，適用于飼料中氨基酸的檢測。

2.5 樣品中氨基酸含量的測定

以2,4-二硝基氯苯為柱前衍生試劑，利用最佳的微波水解條件進行處理，采用HPLC檢測飼料中的氨基酸，結(jié)果如表2所示，標準品及樣品的色譜圖如圖1所示。

表2 飼料中氨基酸含量、回收率及其相對標準偏差(RSD)Table 2 The contents,recoveries and RSDs of amino acids in feed

圖1 氨基酸標準品(A)與飼料樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of amino acids in 17 amino acids standard solution(A) and in the feed sample(B)the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

圖2 微波水解與常規(guī)水解的比較Fig.2 Comparison of microwave hydrolysis and conventional hydrolysis

由表2可知，飼料中含量最高的氨基酸為谷氨酸，含量為89.21 mg/g；其次是天冬氨酸，含量為49.77 mg/g，這兩種氨基酸是飼料中的主要氨基酸，占氨基酸總量的35%。

由圖1可知，17種氨基酸標準溶液經(jīng)衍生后分離效果較好，并且飼料樣品中的氨基酸也被較好分離，因此，該方法適合用于飼料中氨基酸的測定。

2.6 微波水解與常規(guī)水解的比較

微波水解與常規(guī)水解結(jié)果的比較如圖2所示。結(jié)果表明，微波水解與常規(guī)水解得到的各氨基酸含量基本相同，只有極少數(shù)的氨基酸效果不如常規(guī)水解，可能是加熱過程中因溫度高而被破壞[6]，但總體效果大致相同，因此微波水解能達到與常規(guī)水解相同的效果。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種微波水解衍生高效液相色譜法測定飼料中17種氨基酸含量的方法。研究結(jié)果表明，150 ℃下微波水解16 min與傳統(tǒng)加熱水解能達到相同的效果，因此該方法可以取代傳統(tǒng)的加熱水解。該方法操作簡單，消耗時間較短，有效降低了檢測成本，提高了檢測效率。實驗準確度高，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好，而且17種氨基酸的衍生物均能較好分離，可用于飼料中的氨基酸檢測。

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Determination of Amino Acids in Feed by High Performance Liquid Chromatography with Microwave Hydrolysis Derivatization

REN Xiao-yu,PEI Xiao-jing,ZHANG Shao-yun,XIE Li-na,DU Wen-bo,SUO Ran*

(College of Food Science and Technology,Agriculture University of Hebei,Baoding 071000,China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method with microwave hydrolysis derivation was developed for the simultaneous determination of 17 amino acids in feed.The method was based on pre-column derivatization with 2,4-dinitro-chlorobenzene.The compounds were separated on a C18column.And the conditions of microwave hydrolysis were optimized.The detection was performed using a diode array detector at 360 nm.The calibration curves of 17 amino acids all exhibited good linearities in the range of 2.5-50 mg/L.The correlation coefficients(r2) for the determination varied between 0.990 7 and 0.999 9 with the relative standard deviations(RSDs) of 0.88% to 4.2%,and the recoveries of 17 amino acids were in the range of 90.6%-107.2% with the limits of detection of 0.15-2.37 mg/L.The results showed that the results of microwave hydrolysis in 16 min at 150 ℃ are basically the same as those of traditional heating hydrolysis(110 ℃,24 h).With the advantages of short analysis time,high sensitivity,the method could be used for the determination of amino acids in feed.

microwave hydrolysis;amino acid;high performance liquid chromatography(HPLC);pre-column derivatization;feed

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.016

O657.7

A

1004-4957(2017)10-1255-05

2017-06-16；

2017-07-06

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鎖 然，博士，副教授，研究方向：食品分析，Tel：0312-7528195，E-mail：ransuo@qq.com