劉 明，魏 芳，謝 亞，董緒燕，陳 洪，黃鳳洪

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)室，油料油脂加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

綜 述

基于衍生化技術(shù)的游離脂肪酸的色譜-質(zhì)譜分析方法研究進(jìn)展

劉 明，魏 芳*，謝 亞，董緒燕，陳 洪，黃鳳洪

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)室，油料油脂加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

游離脂肪酸在生物體內(nèi)含量極低，由于結(jié)構(gòu)中缺少易電離的官能團(tuán)，導(dǎo)致質(zhì)譜分析時(shí)檢測(cè)靈敏度不高。利用化學(xué)衍生化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是改善色譜行為和提高質(zhì)譜響應(yīng)的有效手段。近年來(lái)，化學(xué)衍生化結(jié)合色譜和質(zhì)譜技術(shù)在游離脂肪酸檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。該文綜述了國(guó)內(nèi)外基于衍生化技術(shù)的游離脂肪酸分析方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展。

游離脂肪酸；化學(xué)衍生化；色譜；質(zhì)譜；研究進(jìn)展

脂肪酸是一類羧酸化合物，由碳?xì)浣M成的烴類基團(tuán)連接羧基構(gòu)成。脂肪酸通常以酯化形式存在，作為中性脂、磷脂和糖脂等脂質(zhì)的組分(又稱為脂肪酸酯或總脂肪酸)。酯化脂肪酸在磷脂酶的作用下水解得到游離脂肪酸(Free fatty acids，F(xiàn)FA)，游離脂肪酸為非酯化的脂肪酸，是類脂代謝物的重要組成部分。一方面，外源性的脂肪通過(guò)血漿轉(zhuǎn)運(yùn)，以游離脂肪酸的形式進(jìn)入脂肪細(xì)胞，再合成脂肪儲(chǔ)存，同時(shí)機(jī)體內(nèi)的內(nèi)源性脂肪主要在肝臟中合成，也通過(guò)血漿轉(zhuǎn)運(yùn)而進(jìn)入脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存；另一方面，儲(chǔ)存的脂肪不斷降解，以游離脂肪酸的形式進(jìn)入各組織被氧化利用，使脂肪代謝處于動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，游離脂肪酸與糖、脂代謝異常及其他心血管病，如肥胖、高血壓、高胰島素血癥、2型糖尿病等密切相關(guān)[1-3]。

此外，食用油中的游離脂肪酸主要是甘油三酯的水解產(chǎn)物；游離脂肪酸不穩(wěn)定，易導(dǎo)致油脂的氧化和酸敗，影響油的品質(zhì)和功能。在粗制油中游離脂肪酸組成可用于描述壓榨油的質(zhì)量和評(píng)估油損傷程度。游離脂肪酸成分可以作為油品在不同水分、溫度、含氧量、光照貯藏以及煎炒過(guò)程中的降解參數(shù)。

游離脂肪酸的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[4-5]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[6-7]，游離脂肪酸在生物體內(nèi)及油品中含量極低，且結(jié)構(gòu)中缺少易電離的官能團(tuán)，導(dǎo)致質(zhì)譜分析靈敏度不高。利用化學(xué)衍生化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是改善色譜行為和提高質(zhì)譜響應(yīng)的有效手段。近年來(lái)，化學(xué)衍生化結(jié)合色譜和質(zhì)譜技術(shù)在游離脂肪酸檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。本文綜述了目前國(guó)內(nèi)外基于化學(xué)衍生化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的游離脂肪酸分析方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展。

1 化學(xué)衍生化技術(shù)概述

化學(xué)衍生化技術(shù)[8-9](Chemical derivatization)是一種將待測(cè)化合物與具有特定基團(tuán)的衍生化試劑通過(guò)定量快速反應(yīng)生成符合要求的衍生化產(chǎn)物，然后通過(guò)檢測(cè)衍生化產(chǎn)物的量來(lái)間接測(cè)定待測(cè)物含量的方法。經(jīng)化學(xué)衍生化后能夠改變待測(cè)物的檢測(cè)特性，增加其對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)，并且能夠生成穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物以改善待測(cè)物的不穩(wěn)定性。衍生化技術(shù)可提高電離效率，減少?gòu)?fù)雜樣品分析時(shí)的電離抑制，進(jìn)而提高電噴霧質(zhì)譜分析的檢測(cè)靈敏度和選擇性。衍生化技術(shù)適用于實(shí)際樣品中帶有目標(biāo)官能團(tuán)的代謝物的準(zhǔn)確定量和相對(duì)定量分析。在選擇衍生試劑時(shí)需綜合考慮以下因素[8-10]：衍生試劑必須包含反應(yīng)功能團(tuán)；衍生試劑必須穩(wěn)定；衍生試劑本身和生成的副產(chǎn)物干擾??；衍生化反應(yīng)條件溫和；如有可能，試劑應(yīng)無(wú)毒；衍生步驟應(yīng)適于自動(dòng)化。國(guó)內(nèi)外已有許多文獻(xiàn)利用衍生化技術(shù)對(duì)脂肪酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，將其轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的新結(jié)構(gòu)，從而提高檢測(cè)靈敏度。

此外，質(zhì)譜分析脂肪酸及其代謝物時(shí)，還存在復(fù)雜代謝物穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)獲得十分困難等問(wèn)題。為解決以上問(wèn)題，穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化技術(shù)(Stable isotope-coded derivatization，ICD)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。穩(wěn)定同位素衍生化定量方法的原理是使用化學(xué)衍生的辦法為含某一特定官能團(tuán)的化合物引入同位素標(biāo)簽，輕/重標(biāo)記的樣品等量混合后進(jìn)行質(zhì)譜分析，同種物質(zhì)會(huì)因質(zhì)量上的差異在質(zhì)譜圖中出現(xiàn)1對(duì)同位素特征峰。由于它們的離子化效率相同，可通過(guò)比較輕/重同位素標(biāo)記的同一物質(zhì)譜峰強(qiáng)度，來(lái)分析不同處理樣品中該分析物的含量變化。通過(guò)穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化技術(shù)[11-14]，將脂肪酸代謝物引入不同的同位素標(biāo)記基團(tuán)，其中1個(gè)同位素標(biāo)記衍生物作為內(nèi)標(biāo)，有利于減小基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)定量分析。

在氣相色譜-質(zhì)譜分析中，利用氫輕重標(biāo)記甲醇(d0/d3)甲酯化脂肪酸[15-18]，d0-甲醇標(biāo)記脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，d3標(biāo)記樣品中脂肪酸，以d0-甲醇標(biāo)記的脂肪酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)，兩者等體積混合，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。Chen等[18]應(yīng)用d0/d3-甲醇對(duì)脂肪酸進(jìn)行甲酯化標(biāo)記，結(jié)合GC-MS對(duì)健康小鼠肝臟和肝損傷小鼠肝臟中的脂肪酸進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析，比較健康和患病小鼠肝臟中脂肪酸的變化，尋找肝損傷小鼠肝臟中的脂肪酸生物標(biāo)記物。在液相色譜-質(zhì)譜分析中，Lamos等[19-20]選擇氫輕重標(biāo)記的乙酰胺對(duì)雞蛋中的脂肪酸進(jìn)行衍生化，形成脂肪酸季胺衍生物，由于分析物引入1個(gè)帶正電荷的季胺基團(tuán)，使其能夠在ESI-MS正離子模式下分析，并且提高了檢測(cè)靈敏度，結(jié)合HPLC-MS法對(duì)圈養(yǎng)和散養(yǎng)雞蛋中的脂肪酸變化進(jìn)行了定量分析。

2 氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜(GC)是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)脂肪酸的方法，由于脂肪酸含有羧基等極性基團(tuán)，不易揮發(fā)，因此需先將其甲酯化為易揮發(fā)的非極性脂肪酸甲酯，以便于氣相色譜分析。甲酯化是用于脂肪酸衍生化的經(jīng)典方法，其衍生化試劑采用氫氧化鈉-甲醇溶液、濃硫酸-甲醇溶液、氯甲酸甲酯、三氟化硼(BF3)-甲醇溶液等，總脂肪酸的酯化反應(yīng)多用氫氧化鈉-甲醇甲酯化[21-23]，而游離脂肪酸的酯化反應(yīng)多采用濃硫酸-甲醇甲酯化。常用的衍生化技術(shù)除甲酯化外，還有硅烷化、胺化和?；?。

Cha等[24]采用固相微萃取(Solid phase micro-extraction,SPME)對(duì)肺結(jié)核病人唾液中的游離脂肪酸(FFA)進(jìn)行萃取富集，而后采用6%濃硫酸-甲醇對(duì)FFA萃取液進(jìn)行甲酯化衍生反應(yīng)(于80 ℃下加熱反應(yīng)15 min)，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)對(duì)FFA進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用磁性納米顆粒固相萃取(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)技術(shù)對(duì)食用油中FFAs進(jìn)行萃取富集，在解吸附過(guò)程中加入2 mL 1%濃硫酸-甲醇，渦旋5 min，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)FFAs的解吸附和甲酯化衍生反應(yīng)，結(jié)合GC/FID分析，成功應(yīng)用于植物油中FFAs的檢測(cè)[25]。Gao等[26]采用氯甲酸甲酯在4-二甲基氨基吡啶的催化作用下，使游離脂肪酸與氯甲酸甲酯發(fā)生酯化反應(yīng)，然后結(jié)合GC/FID檢測(cè)人血清和血漿中FFAs。

Notter等[27]采用三甲基硅烷化反應(yīng)作為衍生化方法測(cè)定圈養(yǎng)豬脂蠟體中的游離脂肪酸含量，首先采用固相萃取(氨基柱)純化富集游離脂肪酸，然后向FFA萃取物中加入三甲基硅烷，60 ℃加熱30 min，得到硅烷化產(chǎn)物，采用GC-MS分析，檢測(cè)到豬脂蠟體中有8種游離脂肪酸。

Kangani等[28]利用胺化反應(yīng)對(duì)血漿中游離脂肪酸進(jìn)行衍生化，采用二甲胺及雙-(2-甲氧基乙基)胺三氟化硫作為衍生化試劑將游離脂肪酸衍生成脂肪酸的二甲酰胺形式。該衍生化方法溫和、有效，且對(duì)FFAs具有專屬選擇性，所以無(wú)需將FFAs從總脂中先富集和純化出來(lái)，其靈敏度高，重復(fù)性好，具有應(yīng)用參考價(jià)值。表1列出了文獻(xiàn)中已報(bào)道的不同衍生化技術(shù)結(jié)合氣相色譜法分析游離脂肪酸的研究及其應(yīng)用。

表1 不同衍生化技術(shù)結(jié)合氣相色譜法在游離脂肪酸分析中的應(yīng)用Table 1 Applications of different derivatization methods couple with GC for the analysis of free fatty acids

3 液相色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜(LC)用于游離脂肪酸分離需在流動(dòng)相中添加甲酸等有機(jī)酸，以使分析物能夠保留在反相色譜柱中，保證色譜分離；但由于電噴霧液滴中弱酸能夠攜帶很多負(fù)電荷，抑制分析物羧酸負(fù)離子的形成，從而抑制分析物的離子化效率，不利于分析物的質(zhì)譜檢測(cè)[38]。因此，將羧酸化合物通過(guò)化學(xué)衍生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為陽(yáng)離子化合物，在質(zhì)譜正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行分析，可以避免酸性流動(dòng)相的離子抑制，提高電離效率，從而能夠提高電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)的檢測(cè)靈敏度。

在基于化學(xué)衍生化技術(shù)結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)的游離脂肪酸分析中，游離脂肪酸與衍生化試劑主要發(fā)生酯化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)，形成的衍生產(chǎn)物主要有脂肪酸季胺類衍生物、叔胺類衍生物、哌嗪-嘧啶衍生物、苯并呋咱類衍生物以及其他衍生物。

3.1 脂肪酸季胺類衍生物

圖1 衍生試劑BMP和CMP與脂肪酸的反應(yīng)[38]Fig.1 Derivative reaction of BMP and CMP with fatty acids[38]

Regnier等[38]采用2-溴-1-甲基吡啶碘化物(2-Bromo-1-methylpyridinium iodide,BMP)和3-甲醇-1-甲基吡啶碘化物(3-Carbinol-1-methylpyridinium iodide,CMP)衍生游離脂肪酸，CMP的羥基與脂肪酸的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)生成3-酰氧甲基-1-甲基吡啶碘化物(3-Acyl-oxymethyl-1-methylpyridinium iodide,AMMP)衍生物(圖1)，其中催化試劑三乙胺(TEA)提供弱堿性環(huán)境，促進(jìn)衍生化反應(yīng)的進(jìn)行。該衍生化技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS 聯(lián)用技術(shù)被用于人血清中的游離脂肪酸(C4～C24)的分析，與在負(fù)離子模式下檢測(cè)未衍生的游離脂肪酸相比，其靈敏度提高了約2 500倍。

圖2 衍生試劑AMPP與脂肪酸的反應(yīng)[39]Fig.2 Derivative reaction of AMPP with fatty acids[39]

Bollinger等[19,39-43]合成了一種新的衍生化試劑4-氨甲基苯基吡啶((4-Aminomethylphenyl) pyridinium,AMPP)用于衍生游離脂肪酸，在AMPP吡啶N—C鍵之間引入1個(gè)帶正電荷的苯環(huán)標(biāo)記基團(tuán)，以增強(qiáng)吡啶N—C之間的穩(wěn)定性，同時(shí)可以增強(qiáng)衍生產(chǎn)物與反相色譜柱之間的作用，從而減少ESI-MS/MS分析的基質(zhì)效應(yīng)。該衍生化技術(shù)結(jié)合LC-MS方法，可應(yīng)用于生物樣品中脂肪酸氧化物和游離脂肪酸的分析。AMPP與游離脂肪酸的衍生化反應(yīng)中，以N,N-二甲基酰胺(DMF)為溶劑，在酰胺合成中，碳二亞胺(EDC)作螯合劑，與羧基活化劑N-羥基苯并三氮唑(HOBt)聯(lián)用，用于—COOH與—NH2的縮合反應(yīng)，HOBt的—OH在EDC的作用下與羧酸生成酯，再被AMPP的—NH2親核攻擊取代，形成1個(gè)穩(wěn)定的帶正電頭部基團(tuán)的季胺化合物(圖 2)。經(jīng)AMPP衍生后，游離脂肪酸的羧基轉(zhuǎn)變?yōu)?個(gè)帶正電的季胺基的化合物，結(jié)合HPLC-ESI-MS/MS聯(lián)用技術(shù)分析，游離脂肪酸的靈敏度較ESI負(fù)離子模式下提高了約60 000倍。此外，AMPP衍生物在質(zhì)譜中的碰撞誘導(dǎo)解離是從遠(yuǎn)離正電荷標(biāo)簽部分開(kāi)始產(chǎn)生碎片，即遠(yuǎn)電荷碎裂規(guī)律，因此AMPP衍生產(chǎn)物能夠產(chǎn)生特異性的質(zhì)譜碎片，有助于游離脂肪酸雙鍵位置異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)鑒定。

Johnson[44-45]采用二甲基乙醇胺(Dimethylaminoethanol,DMAE)和碘甲烷衍生游離脂肪酸，游離脂肪酸首先與DMAE生成二甲基乙醇胺酯化物，然后與碘甲烷反應(yīng)生成三甲基乙醇胺酯化；Pettinella等[46]將該衍生化技術(shù)結(jié)合HPLC-MS方法，用于動(dòng)脈病硬化斑塊組織中游離脂肪酸的分析，定性、定量分析了18種游離脂肪酸，其中包括C18∶1的順?lè)串悩?gòu)體。

這類衍生化技術(shù)，通過(guò)化學(xué)衍生化在游離脂肪酸分子中引入易電離的吡啶基團(tuán)，可以提高電離效率，減少?gòu)?fù)雜基質(zhì)樣品的電離抑制，提高分析靈敏度，有利于低豐度游離脂肪酸分子的檢測(cè)；能夠產(chǎn)生豐富的二級(jí)碎片離子，利于游離脂肪酸雙鍵位置異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)鑒定。

3.2 脂肪酸叔胺類衍生物

圖3 衍生試劑DMED與脂肪酸的反應(yīng)[48]Fig.3 Derivative reaction of DMED with fatty acids[48]

N,N-二甲基氨基丁二胺(2-Dimethylaminobutylamine,DMBA)[47]和N,N-二甲基乙二胺(2-Dimethylaminoethylamine,DMED)[48-50]能與羧酸化合物反應(yīng)生成具有叔胺基的衍生物，且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定。Zhu等[48-49]采用1對(duì)同位素衍生試劑(DMED,d4-DMED)選擇性標(biāo)記生物樣品中類二十烷酸和脂溶性羧酸化合物，在1-氯-4-甲基吡啶碘化物(CMPI)和三乙胺(TEA)的催化作用下，衍生試劑DMED/d4-DMED與羧酸化合物發(fā)生酰胺化反應(yīng)，形成帶正電的叔胺化合物(圖3)。反應(yīng)中CMPI為羧基激活劑，TEA為衍生反應(yīng)提供弱堿性環(huán)境，衍生時(shí)，CMPI先與脂肪酸發(fā)生反應(yīng)形成中間產(chǎn)物，加入衍生試劑后再與衍生試劑反應(yīng)形成脂肪酸叔胺衍生物(圖3)。在衍生化產(chǎn)物中，引入了1個(gè)帶正電的叔胺基團(tuán)，有利于提高分析物的電噴霧電離效率，提高檢測(cè)靈敏度(提高了9～323倍)。將d4-DMED標(biāo)記的健康人血清中的脂溶性羧酸(作為內(nèi)標(biāo))與DMED標(biāo)記的患者血清中的脂溶性羧酸以1∶1混合，實(shí)現(xiàn)了溶血性羧酸的相對(duì)定量分析。將所建立的方法成功應(yīng)用于健康人和2型糖尿病患者血清中脂溶性羧酸的剖析及相對(duì)定量分析，在患病血清中檢測(cè)到81種溶血性羧酸存在顯著性變化，其中有18種為游離脂肪酸，12種游離脂肪酸含量顯著下降，分析其代謝途徑，發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病患者血清中不飽和脂肪酸途徑的生物合成代謝異常。

上述叔胺類衍生化技術(shù)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)；叔胺基團(tuán)的引入可以極大地提高電離效率，減少?gòu)?fù)雜基質(zhì)的電離抑制，從而獲得較高的檢測(cè)靈敏度；叔胺類衍生化產(chǎn)物在質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離中會(huì)產(chǎn)生相同的不帶電碎片離子，利用該碎片離子，采用中性丟失掃描模式能夠選擇性地對(duì)同類羧酸化合物進(jìn)行篩查，極大地提高質(zhì)譜的選擇性。

3.3 脂肪酸苯并呋咱類衍生物

圖4 衍生試劑DBD-PZ-NH2與脂肪酸的反應(yīng)[52]Fig.4 Derivative reaction of DBD-PZ-NH2 with fatty acids[52]

Tsukamoto等[51-53]采用苯并呋咱類(Benzofuroxan)衍生試劑：7-(N,N-二甲基磺酰胺)-4-(胺乙基)哌嗪-2,1,3-苯并呋咱(7-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-4-(aminoethyl) piperazino-2,1,3-benzoxadiazole,DBD-PZ-NH2)及其氘代化合物((d6)-7-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-4-(aminoethyl) piperazino-2,1,3-benzoxadiazole,DBD-PZ-NH2(D))與游離脂肪酸發(fā)生化學(xué)衍生化反應(yīng)，生成含有苯并呋咱基團(tuán)的衍生物(圖4)。衍生化反應(yīng)中，以二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，碳二亞胺(EDC)為縮合劑，4-二甲氨基吡啶(DMAP)為?；饔玫拇呋瘎捎肈BD-PZ-NH2(D)標(biāo)記的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ丈飿颖局械挠坞x脂肪酸作為內(nèi)標(biāo)，與DBD-PZ-NH2標(biāo)記的生物樣本1∶1混合，結(jié)合HPLC-MS對(duì)大鼠血漿中游離脂肪酸進(jìn)行了絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。該衍生化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于,通過(guò)引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的衍生試劑可以靶向用于生物樣品中含有羧酸類功能基團(tuán)的復(fù)雜化合物的絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。

3.4 脂肪酸哌嗪-嘧啶衍生物

圖5 衍生試劑DMPP與脂肪酸的反應(yīng)[54]Fig.5 Derivative reaction of DMPP with fatty acids[54]

Leng等[54-56]采用衍生試劑2,4-二甲氧基-6-哌嗪-1-嘧啶(2,4-Dimethoxy-6-piperazin-1-yl pyrimidine,DMPP)用于游離脂肪酸衍生，在碳二亞胺的作用下10 s內(nèi)即可完成反應(yīng)(圖5)，結(jié)合HPLC-ESI-MS對(duì)人甲狀腺組織和尿液中游離脂肪酸進(jìn)行定性、定量分析。DMPP作為脂肪酸衍生試劑，具有衍生操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，且其結(jié)構(gòu)中含1個(gè)嘧啶環(huán)，ESI模式下可提高離子化效率，缺點(diǎn)是衍生后存在中間副產(chǎn)物和未衍生完全的衍生試劑。衍生后利用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附衍生中間產(chǎn)物和未衍生完全的衍生試劑，然后用乙醇沖洗，消除中間副產(chǎn)物和未衍生完全的衍生試劑的干擾，檢測(cè)靈敏度和重現(xiàn)性以及檢測(cè)通量均得到很大的提高和改進(jìn)，檢測(cè)靈敏度提高了375～1 000倍，檢出限為160 nmol/L。此外，DMPP穩(wěn)定同位素衍生化技術(shù)結(jié)合電噴霧-離子遷移譜-質(zhì)譜(ESI-IM-MS/MS)成功地應(yīng)用于人甲狀腺組織中游離脂肪酸[56]的分析，利用不同的離子漂移時(shí)間和指示離子，結(jié)合同位素標(biāo)記對(duì)游離脂肪酸進(jìn)行定性和定量分析，該方法無(wú)需色譜分離即可對(duì)生物樣品中16種游離脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)，分析時(shí)間大大縮減，有利于大量生物樣本的分析。

DMPP衍生化技術(shù)的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)迅速，靈敏度高；但反應(yīng)后存在大量的中間產(chǎn)物和未反應(yīng)的衍生試劑，因此需先除去衍生中間產(chǎn)物和未衍生完全的衍生試劑后才能進(jìn)質(zhì)譜分析，否則會(huì)對(duì)檢測(cè)器造成污染。

3.5 其他脂肪酸衍生物

2-硝基苯肼(2-Nitrophenylhydrazine,2-NPH)[57-58]常用于衍生脂肪酸等羧酸化合物，形成脂肪酸酰肼衍生物，這些衍生物在230 nm處有較強(qiáng)吸光度，可以使用HPLC-DAD-MS(Diode array detector,DAD,二極管陣列)進(jìn)行檢測(cè)。此外，3-硝基苯肼(3-Nitrophenylhydrazine,3-NPH)也被用于衍生丙酮酸和乳酸[59]，衍生后色譜分離效果和檢出限顯著提高。Han等[60]運(yùn)用3-NPH衍生化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)法分析了2型糖尿病人排泄物中9種游離短鏈飽和脂肪酸(C2～C6)，通過(guò)優(yōu)化衍生化條件和色譜分離條件，檢測(cè)靈敏度、重現(xiàn)性和檢測(cè)通量均得到很大的提高，線性范圍為0.12～2 500 nmol/L，檢出限為0.3～15 fmol。該衍生化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于過(guò)量的衍生試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物不會(huì)干擾HPLC分析。

此外，氨甲基吡啶(2-Picolylamine,PA)[61-62]也被用于衍生羧酸類化合物，結(jié)合HPLC-ESI-MS方法，對(duì)生物樣品中鵝去氧膽酸、膽汁酸、前列腺素E2和類前列腺素等羧酸化合物成功進(jìn)行了定性和定量分析，其檢測(cè)靈敏度提高了9～158倍。

表2列出了文獻(xiàn)中報(bào)道的不同衍生化技術(shù)結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜法分析游離脂肪酸的研究及應(yīng)用情況。

表2 不同衍生化技術(shù)結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜法在游離脂肪酸分析中的應(yīng)用Table 2 Applications of different chemical derivatization technologies couple with HPLC-MS for the analysis of free fatty acids

(續(xù)表2)

SamplesDerivativeChromatographiccolumnMobilephaseAnalytesDetector&scanmodeReferenceRatliver,heart,braintissuesandhumanserum(大鼠肝臟、心臟、腦組織和人血清)N,N-二甲基乙二胺(d0/d4-DMED)AcquityUPLC-BEHphenylcolumn(2.1mm×50mm,1.7μm)A:Water-formicacid(100∶0.01,byvolume);B:Acetonitrile-methyl(7∶3,byvolume)類二十烷酸(HETEs,DHETs,EETs)ESI-MS/MS,DNLS&MRM(Doubleneutrallossscan&Multi-pleReactionMoni-toring)[48]Type2diabe-tespatientser-um(2型糖尿病患者血清)N,N-二甲基乙二胺(d0/d4-DMED)ShimadzuVP-ODScolumn(150mm×2.0mm,5μm)A:Water-formicacid(100∶0.01,byvolume);B:Acetonitrile脂溶性羧酸ESI-MS/MS,QNLS&MRM(Quadrupleneutrallossscan&MultipleReactionMonitoring)[49]Atheroscleroticplaquetissue(動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織)N.N-二甲基乙醇胺(DMAE)和碘甲烷VarianPursuitDi-phenylcolumn(150mm×2mm,3μm)A:5mmol/LAmmoniumacetateinwater;B:5mmol/LAmmoniumace-tateinacetonitrile游離脂肪酸ESI-MS/MS,MRM(MultipleRe-actionMonitoring)[46]Humanthyroidtissueofthy-roidcarcinoma(甲狀腺癌患者的甲狀腺組織)2,4-二甲氧基-6-哌嗪-1-嘧啶(DMPP-d0/d6)ZorbaxSB-C8col-umn(2.1mm×100mm,1.8μm)A:Water;B:Acetoni-trile游離脂肪酸ESI-MS/MS,SRM[54]Humanurine(人尿液)2,4-二甲氧基-6-哌嗪-1-嘧啶(DMPP-d0/d6)ZorbaxSB-C8col-umn(2.1mm×100mm,1.8μm)A:Water;B:Acetoni-trile游離脂肪酸ESI-MS/MS,SRM[55]Carboxylicacidssolution(羧酸化合物標(biāo)準(zhǔn)品)2-硝基苯肼(2-NPH)Nucleosil120-5-C18reversed-phasecolumn(250mm×4mm)A:Water;B:Acetoni-trile羧酸化合物DAD-APCI-MS,negativeionmode[58]Type2diabe-tespatientfe-ces(2型糖尿病人排泄物)3-硝基苯肼(3-NPH)WatersBEHC18column(2.1mm×100mm,1.7μm)A:Water-formicacid(100∶0.01,byvolume);B:Acetonitrile-formicacid(100∶0.01,byvol-ume)短鏈飽和脂肪酸(Shortchainfattyacids,SCFAs,C2～C6)ESI-MS/MS,MRM(MultipleReactionMonito-ring),negativeionmode[60]Humansaliva(人唾液)氨甲基吡啶(PA)J'sphereODS-H80column(150mm×2.0mm,4μm)A:10mmol/LAmmoni-umformateinmethanol(byvolume);B:Metha-nol-water(7∶3,byvolume)鵝去氧膽酸、膽汁酸和前列腺素E2ESI-MS[61]Brainandliverfrommice(大鼠腦和肝臟)氨甲基吡啶(PA)和肼基吡啶(HP)ZorbaxSB-C18RapidResolutionHDcol-umn(2.1mm×100mm,1.8μm)A:Water-formicacid(99.9∶0.1,byvolume);B:Acetonitrile-formicacid(99.9∶0.1,byvolume)類前列腺素ESI-MS[62]

4 直接進(jìn)樣質(zhì)譜技術(shù)

直接進(jìn)樣質(zhì)譜法，即“鳥(niǎo)槍法”(Shotgun-MS)[64]是目前研究脂質(zhì)組學(xué)較為常用的分析方法。脂質(zhì)樣品在提純后，不經(jīng)色譜柱分離，直接進(jìn)樣后進(jìn)行質(zhì)譜分析，能有效提高分析速度，電噴霧電離源(ESI)是目前最為常用的電離源?！傍B(niǎo)槍法”的主要原理是源內(nèi)分離(Intra-source separation)，直接進(jìn)樣后根據(jù)脂質(zhì)分子在不同pH值條件下的電荷差異性進(jìn)行質(zhì)譜離子源內(nèi)分離，在正、負(fù)離子模式下分開(kāi)檢測(cè)不同脂質(zhì)分子。鳥(niǎo)槍法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、樣品用量少、分析時(shí)間短等特點(diǎn)，缺點(diǎn)是較難分析低豐度脂質(zhì)。

圖6 AMPP-α-亞麻酸(Δ9,12,15 18∶3)衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜碎裂規(guī)律圖[43]Fig.6 MS fragmentation pattern of derivatives for AMPP-α-linolenic acid(Δ9,12,15 18∶3)[43]

圖7 丙酮與不飽和脂肪酸的光催化衍生化反應(yīng)[65]Fig.7 Photochemical reaction of acetone with unsaturated fatty acid[65]

5 展 望

由于復(fù)雜基質(zhì)樣品中游離脂肪酸含量極低，具有強(qiáng)極性和弱揮發(fā)性，且其在質(zhì)譜負(fù)離子檢測(cè)模式下存在電離效率低、檢測(cè)靈敏度不足等困難，而利用化學(xué)衍生化技術(shù)，可在游離脂肪酸中引入易電離的特定基團(tuán)，改變游離脂肪酸結(jié)構(gòu)，改善色譜行為和質(zhì)譜響應(yīng)，提高電離效率，減少?gòu)?fù)雜樣品分析時(shí)的電離抑制，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。開(kāi)發(fā)新型衍生化試劑，簡(jiǎn)化衍生化反應(yīng)的步驟，減少衍生化副產(chǎn)物的干擾，提高衍生化反應(yīng)的效率、專屬性和穩(wěn)定性；同時(shí)，衍生化產(chǎn)物易于產(chǎn)生豐富的二級(jí)碎片離子，利于脂肪酸位置異構(gòu)體(雙鍵位置異構(gòu)，順?lè)串悩?gòu)等)的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定，是今后基于衍生化技術(shù)的游離脂肪酸分析方法研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

[1] Lu Z H,Mu Y M,Wang B A,Li X L,Lu J M,Li J Y,Pan C Y,Yanase T,Nawata H.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2003,303(4):1002-1007.

[2] Prentki M,Murthy Madiraju S R.Mol.Cell.Endocrinol.,2012,353:88-100.

[3] Li J Q,Dai Y X,Liu Y M,Zheng J,Liu W B.Chin.J.PublicHealth.(李嘉強(qiáng)，戴穎秀，劉玉敏，鄭基，劉文斌.高血壓雜志),2006,11(5):352-355.

[4] Sepp?nen-Laakso T,Laakso I,Hiltunen R.Anal.Chim.Acta,2002,465:39-62.

[5] Brondz I.Anal.Chim.Acta,2002,456:1-37.

[6] Chen S H,Chuang Y J.Anal.Chim.Acta,2002,465:145-155.

[7] Li G L,You J M,Suo Y R,Song C H,Sun Z W,Xia L,Zhao X N,Shi J Y.FoodChem.,2011,125(4):1365-1372.

[8] Wang X，Wei F，Lü X，Dong X Y，Chen H.J.Agric.Sci.Technol.(王湘，魏芳，呂昕，董緒燕，陳洪.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào))，2015,17:141-150.

[9] Xu F G,Zou L,Liu Y,Zhang Z J,Ong C N.MassSpectrom.Rev.,2011,30(6):1143-1172.

[10] Jiang R Q,Jiao Y,Xu F G.Bioanalysis,2016,18(8):1881-1883.

[11] Qi B L,Liu P,Wang Q Y,Cai W J,Yuan B F,Feng Y Q.TrACTrendsinAnal.Chem.,2014,59:121-132.

[12] Higashi T,Ogawa S.J.Pharm.Biomed.Anal.,2016,130:181-193.

[13] Chapman H M,Schutt K L,Dieter E M,Lamos S M.Bioanalysis,2012,4(20):2525-2541.

[14] Wang X,Wei F,Xu J Q,Lv X,Dong X Y,Han X L,Quek S Y,Huang F H,Chen H.Anal.Chim.Acta,2016,902:142-143.

[15] Li J J,Yue Y X,Hu X J,Zhong H Y.Anal.Chem.,2009,81(12):5080-5087.

[16] Li T T,Dai L,Li L,Hu X J,Dong L J,Li J J,Salim S K,Fu J Y,Zhong H Y.Anal.Chim.Acta,2011,684:8-16.

[17] Zhong H Y,Dong L J,Dong Q J,Ke C S,Fu J Y,Wang X L,Liu C,Dai L.Anal.Bioanal.Chem.,2012,404:207-216.

[18] Liu W H,Inbaraj S B,Chen B H.FoodChem.,2007,104(4):1740-1749.

[19] Lamos S M,Shortreed M R,Frey B L,Belshaw P J,Smith L M.Anal.Chem.,2007,79:5143-5149.

[20] Torde R G,Therrien A J,Shortreed M R,Smith L M,Lamos S M.Molecules,2013,18(12):14977-14988.

[21] Eder K.J.Chromatogr.B,1995,671:113-131.

[22] Sanchez-Avila N,Mata-Granados J M,Ruiz-Jimenez J,Luque D C M D.J.Chromatogr.A,2009,1216(40):6864-6872.

[23] Cha D M,Liu M M,Zeng Z R,Cheng D,Zhan G Q.Anal.Chim.Acta,2006,572(1):47-54.

[24] Cha D M,Cheng D E,Liu M M,Zeng Z R,Hu X W,Guan W W.J.Chromatogr.A,2009,1216(9):1450-1457.

[25] Wei F,Zhao Q,Lv X,Dong X Y,Feng Y Q,Chen H.J.Agric.FoodChem.,2013,61(1):76-83.

[26] Gao X F,Pujos-Guillot E,Martin J F,Galan P,Juste C,Jia W,Sebedio J L.Anal.Biochem.,2009,393(2):163-175.

[27] Notter S J,Stuart B H,Dent B B,Keegan J.Euro.J.LipidSci.Technol.,2008,110(1):73-80.

[28] Kangani C O,Kelley D E,Delany J P.J.Chromatogr.B,2008,873(1):95-101.

[29] Wang D C,Sun C H,Liu L Y,Sun X H,Jin X W,Song W L,Liu X Q,Wan X L.NeurobiologyofAging,2010,33(6):1057-1066.

[30] Bravi E,Benedetti P,Marconi O,Giuseppe P.FoodChem.,2014,151:374-378.

[32] Masood A,Stark K D,Jr S N.J.LipidRes.,2005,46(10):2299-2305.

[33] Leggio A,Belsito E L,Marco D R,Liguori A,Siciliano C,Spinella M.J.Chromatogr.A,2012,1241:96-102.

[34] Lin X,Bo J,Oliver S A,Corl B A,Jacobi S K,Oliver W T,Harrell R J,Odle J.J.Nutr.Biochem.,2011,22(11):1047-1054.

[35] Quehenberger O,Armando A,Dumlao D,Stephens D L,Dennis E A.ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids,2008,79:123-129.

[37] Jurado-Sanchez B,Ballesteros E,Gallego M.Talanta,2012,93:224-232.

[38] Yang W C,Adamec J,Regnier F E.Anal.Chem.,2007,79(14):5150-5159.

[39] Bollinger J G,Thompson W,Lai Y,Oslund R C,Hallstrand T S,Sadilek M,Turecek F,Gelb M H.Anal.Chem.,2010,82:6790-6796.

[40] Bollinger J G,Rohan G,Sadilek M,Gelb M H.J.LipidRes.,2013,54(12):3523-3530.

[41] Liu X P,Moon S H,Mancuso D J,Jenkins C M,Guan S,Sims H F,Gross R W.Anal.Biochem.,2013,442(1):40-50.

[42] Wang M,Han R H,Han X L.Anal.Chem.,2013,85(19):9312-9320.

[43] Yang K,Dilthey B G,Gross R W.Anal.Chem.,2013,85(20):9742-9750.

[44] Johnson D W.RapidCommun.MassSpectrom.,1999,13:2388-2393.

[45] Johnson D W.RapidCommun.MassSpectrom.,2000,14:2019-2024.

[46] Pettinella C,Lee S H,Cipollone F,Blair I A.J.Chromatogr.B,2007,850:168-176.

[47] Huang Y Q,Wang Q Y,Liu J Q,Hao Y H,Yuan B F,Feng Y Q.Analyst,2014,139(13):3446-3454.

[48] Zhu Q F,Hao Y H,Liu M Z,Yue J,Ni J,Yuan B F,Feng Y Q.J.Chromatogr.A,2015,1410:154-163.

[49] Zhu Q F,Zhang Z,Liu P,Zheng S J,Peng K,Deng Q Y,Zheng F,Yuan B F,Feng Y Q.J.Chromatogr.A,2016,1460:100-109.

[50] Luo D，F(xiàn)eng Y Q，Yao J T，Sun Y B，Huang T H，Hashi Y.Chin.J.Chromatogr.(駱丹，馮鈺锜，姚勁挺，孫友寶，黃濤宏，端裕樹(shù).色譜)，2017,35(1):27-31.

[51] Tsukamoto Y,Santa T,Saimaru H,Imai K,Funatsu T.Biomed.Chromatogr.，2005,19(10):802-808.

[52] Tsukamoto Y,Santa T,Yoshida H,Miyano H,Fukushima T,Hirayama K,Imai K,Funatsu T.Biomed.Chromatogr.,2006,20(4):358-364.

[53] Al-Dirbashi O Y,Santa T,Rashed M S,Al-Hassnan Z,Shimozawa N,Chedrawi A,Jacob M,Al-Mokhadab M.J.LipidRes.,2008,49(8):1855-1862.

[54] Leng J P,Guan Q,Sun T Q,Wu Y,Cao Y J,Guo Y L.J.Pharm.Biomed.Anal.,2013,84:256-262.

[55] Leng J P,Wang H Y,Zhang L,Zhang J,Wang H,Guo Y L.Anal.Chim.Acta,2013,758:114-121.

[56] Leng J P,Guan Q,Sun T Q,Wang H Y,Cui J L,Liu Q H,Zhang Z X,Zhang M Y,Guo Y L.Anal.Chim.Acta,2015,887:148-154.

[57] Miwa H.Anal.Chim.Acta,2002,465:237-255.

[58] Peters R,Hellenbrand J,Mengerink Y,Van Der Wal S.J.Chromatogr.A,2004,1031:35-50.

[59] Uran S,Landmark K E,Hjellum G,Skotland T.J.Pharm.Biomed.Anal.,2007,44(4):947-954.

[60] Han J,Lin K,Sequeira C,Borchers C H.Anal.Chim.Acta,2015,854:86-94.

[61] Higashi T,Ichikawa T,Inagaki S,Min J Z,Fukushima T,Toyo′oka T.J.Pharm.Biomed.Anal.,2010,52(5):809-818.

[62] Dupuy A,Le Faouder P,Vigor C,Oger C,Galano J M,Dray C,Lee J C Y,Valet P,Gladine C,Durand T,Bertrand-Michel J.Anal.Chim.Acta,2016,921:46-58.

[63] Leavens W J,Lane S J,Carr R M,Lockie A M,Waterhouse I.RapidCommun.MassSpectrom.,2002,16:433-441.

[64] Han X L,Gross R W.Expert.Rev.Proteomics,2005,2(2):253-264.

[65] Ma X X,Chong L,Tian R,Shi R Y,Hu T Y,Ouyang Z,Xia Y.PNAS,2016,113(10):2573-2578.

[66] Ma X X,Zhao X,Li J J,Zhang W P,Cheng J X,Ouyang Z,Xia Y.Anal.Chem.,2016,88(18):8931-8935.

Progress on Analysis of Free Fatty Acids by Chromatography-Mass Spectrometry Based on Chemical Derivatization

LIU Ming,WEI Fang*,XIE Ya,DONG Xu-yan,CHEN Hong,HUANG Feng-hong

(Hubei Key Laboratory of Lipid Chemistry and Nutrition,Oil Crops and Lipids Process Technology National & Local Joint Engineering Laboratory,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops of Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Oilseeds Processing of Ministry of Agriculture,Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,China)

There are extremely low contents of free fatty acids in biological matrices.Lacking of ionized groups in the chemical structures of free fatty acids leadsnhance the response of mass spectrometry by modifying the chemical structures of free fatty to the poor ionization and sensitivity in mass spectrometry analysis.It is an effective way to e acids through derivatization technique.In recent years,chromatography-mass spectrometry combined with the chemical derivatization has been widely used in fatty acid analysis.The progresses in analysis of free fatty acids by chromatography-mass spectrometry based on chemical derivatization and its application are summarized in this paper.

free fatty acids; chemical derivatization; chromatography; mass spectrometry; research progress

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.019

O657;Q547

A

1004-4957(2017)10-1269-10

2017-04-12；

2017-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571926)；農(nóng)業(yè)部中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(1610172016005)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2013-OCRI)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-13)

*

魏 芳，博士，副研究員，研究方向：脂質(zhì)分析與營(yíng)養(yǎng)研究，Tel:027-86711669，E-mail:willasa@163.com，weifang@caas.cn