王海偉，王自勤，蘇 丹，霍 堅(jiān)，呂宏迪*

參茸益精片對(duì)急性高原缺氧腦損傷的保護(hù)作用研究

王海偉1，王自勤2，蘇 丹1，霍 堅(jiān)1，呂宏迪1*

目的觀察參茸益精片對(duì)急性高原缺氧腦損傷的保護(hù)作用，并探討其分子機(jī)制。方法將SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(對(duì)照組)、高原急性缺氧模型組(模型組)和參茸益精片治療組(治療組)，每組6只。建立急性高原缺氧腦損傷大鼠動(dòng)物模型，治療組灌胃參茸益精片。觀察大鼠腦組織SOD活性和MDA水平的變化，Western blot和RT-PCR檢測(cè)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)和蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)表達(dá)水平的變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA水平顯著增加(P<0.01)；治療組大鼠腦組織SOD活性顯著增加(P<0.01)，MDA水平顯著降低(P<0.01)。模型組大鼠腦組織ChAT和PKC表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，治療組ChAT和PKC表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)論參茸益精片可以保護(hù)急性高原缺氧引起的腦損傷，可能與其調(diào)節(jié)ChAT和PKC的表達(dá)水平有關(guān)。

參茸益精片；急性高原缺氧；腦損傷；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；蛋白激酶C

0 引言

高原急性缺氧易引起腦損傷，在高原地區(qū)的臨床發(fā)病率持續(xù)增高，對(duì)當(dāng)?shù)鼐用竦纳眢w健康危害嚴(yán)重，但其發(fā)生的分子機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多[1-3]。闡明高原急性缺氧引起腦損傷的分子機(jī)制，探尋有效的臨床治療靶點(diǎn)和預(yù)防治療方案，是目前本領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

參茸益精片主要由西洋參、黃芪等14味中藥組成，具有復(fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肝、生津養(yǎng)血、安神益智壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨等功能，可用于丙肝、乙肝常規(guī)治療后以及腫瘤患者放化療后白細(xì)胞減少、血紅蛋白低、高原反應(yīng)及消化不良等癥[4-6]。但參茸益精片是否可以保護(hù)高原急性缺氧引起的大鼠腦損傷，其具體分子機(jī)制如何,目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立急性高原缺氧大鼠動(dòng)物模型，以大鼠高脂血癥動(dòng)物模型為研究對(duì)象，通過(guò)Western blot和RT-PCR等，觀察膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)和蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)表達(dá)的變化，分析參茸益精片保護(hù)高原急性缺氧引起的大鼠腦損傷的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 急性高原缺氧大鼠動(dòng)物模型的建立 SD大鼠(180～200 g)由一五九醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(對(duì)照組)、高原急性缺氧模型組(模型組)和參茸益精片治療組(治療組)，每組6只，低壓氧艙中常規(guī)喂養(yǎng)動(dòng)物，自由飲水，建立高原缺氧大鼠動(dòng)物模型，治療組在飼喂飼料的同時(shí)，灌胃參茸益精片0.5 mg/kg。治療8周后，檢測(cè)大鼠腦部相關(guān)指標(biāo)變化。

1.2 Western blot分析 取大鼠腦組織，PBS沖洗，加入裂解液，機(jī)械勻漿處理，12 000 r/min離心30 min。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%奶粉孵育1 h，封閉非特異性背景染色，再分別加入ChAT、水通道蛋白-4(AQPs-4)和PKC一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過(guò)夜后，與二抗室溫孵育。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，收集圖像。

1.3 RT-PCR分析 分別取大鼠腦組織，TRIZOL法提取總RNA，通過(guò)RT-PCR分析LDLR、VCAM-1和VEGF mRNA水平的變化。ChAT上游引物5′-CCTCG-TCTGTGGAGTTTGCG-3′,下游引物5′-AGATTGCTTGGCTTGGTTGG-3′;PKC上游引物5′-GCCGTCCACCTGT TTCC-3′，下游引物5′-AGGCCCTGCTTTCCAAT-3′;AQPs-4上游引物5′-TTGGACCATCATAGGC-3′，下游引物5′-GCATGTGATCGAC-3′;β-actin上游引物5′-GAAGTGTGACGTTGACATCCG-3′,下游引物5′-GCCTAGAAGCATTTG CGGTG-3′。瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離RT-PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀觀察圖像，分析組間差異。

1.4 腦組織中SOD和MDA活性分析 取大鼠腦組織，組織勻漿，2 000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒的要求，分析SOD、MDA活性。

2 結(jié)果

2.1 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠ChAT、AQPs-4和PKC表達(dá)的影響 ChAT和PKC與大鼠高原急性缺氧造成的腦損傷密切相關(guān)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織ChAT和PKC的表達(dá)均明顯降低，AQPs-4表達(dá)增加(P<0.05)，與模型組比較，治療組大鼠腦組織ChAT和PKC表達(dá)均顯著增加，AQPs-4表達(dá)降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1～圖3。

2.2 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠ChAT、AQPs-4和PKC mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織中ChAT、PKC mRNA表達(dá)均明顯降低，AQPs-4表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組比較，治療組ChAT、 PKC mRNA表達(dá)均顯著增加，而AQPs-4表達(dá)降低(P<0.01)。見(jiàn)圖4～圖6。

圖1 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠ChAT表達(dá)的影響

圖2 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠PKC表達(dá)的影響

圖3 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠AQPs-4表達(dá)的影響

圖4 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠ChAT mRNA表達(dá)的影響

圖5 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠PKC mRNA表達(dá)的影響

圖6 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠AQPs-4 mRNA表達(dá)的影響

2.3 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠腦組織中SOD、MDA活性的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織中SOD活性顯著降低(P<0.05)，而MDA活性顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，治療組SOD活性顯著升高(P<0.05)，而MDA活性顯著降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。見(jiàn)表1。

表1 參茸益精片對(duì)高原急性缺氧大鼠腦組織中SOD、MDA活性的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

參茸益精片的主要有效成分是人參皂苷(Ginsenoside)Rg1、Re和黃芪甲苷(Astragaloside A)，具有復(fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肝、生津養(yǎng)血的功效，可以疏通脈管，改善臟器供血，調(diào)節(jié)人體代謝功能[7-8]。高原急性缺氧易引起腦損傷，在高原地區(qū)的臨床發(fā)病率持續(xù)增高，其發(fā)生的分子機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多。分析并闡明參茸益精片保護(hù)高原急性缺氧引起的大鼠腦損傷的分子機(jī)制，將為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

研究證實(shí)，神經(jīng)元胞體內(nèi)合成的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，在神經(jīng)元軸突末端輔助乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到膽堿，形成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿[9-11]。缺血缺氧造成的腦損傷以及阿爾茨海默病引起的腦部功能性障礙，均可顯著造成大腦皮質(zhì)區(qū)域膽堿能神經(jīng)纖維的缺失，影響ChAT的活性；同時(shí)，PKC信號(hào)通路可影響Caspase活性，誘導(dǎo)皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而加重缺血缺氧狀態(tài)對(duì)腦部的損傷，同時(shí),可以調(diào)控淀粉樣纖維蛋白(Amyloid beta，Aβ)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)程的影響。AQP-4是一類細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是血腦屏障的重要組成，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要參與腦組織水的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[12-14]。缺氧腦損傷或腦水腫狀態(tài)下，AQP-4表達(dá)顯著增加，可通過(guò)調(diào)控MAPKs信號(hào)通路，影響ERK1/2磷酸化水平，從而加重神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。上述分子均與缺氧造成的腦損傷緊密相關(guān)，研究與上述腦損傷病理過(guò)程相關(guān)的治療藥物和干預(yù)手段，可減輕臨床腦損傷的危害，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，ChAT和PKC與大鼠高原急性缺氧造成的腦損傷密切相關(guān)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織中ChAT和PKC表達(dá)均明顯降低，AQPs-4表達(dá)增加；與模型組相比，治療組ChAT和PKC表達(dá)均顯著增加，AQPs-4表達(dá)降低。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，上述分子的mRNA表達(dá)水平也體現(xiàn)相同的趨勢(shì)。此外，經(jīng)參茸益精片治療后，模型組大鼠腦組織中SOD活性顯著增加，而MDA活性降低，提示參茸益精片具有顯著的腦保護(hù)作用，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，參茸益精片能夠顯著提高高原急性缺氧模型大鼠腦組織相關(guān)分子的表達(dá)，可能作為臨床治療并預(yù)防急性缺氧腦損傷的藥物。本研究為參茸益精片的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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ProtectiveeffectofShenRongYiJingtabletsonacutehigh-altitudehypoxiabraininjury

WANG Hai-wei1,WANG Zi-qin2,SU Dan1,HUO Jian1,Lü Hong-di1*

(1.159 Hospital of PLA,Zhumadian 463000,China;2.Armed Police Corps Hospital of Henan,Zhengzhou 450052,China)

ObjectiveTo observe the protective effect of Shen Rong Yi Jing tablets on acute high-altitude hypoxia brain injury,and explore its molecular mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into blank control group (control group),acute altitude hypoxia model group (model group) and Shen Rong Yi Jing tablets treatment group (treatment group),6 rats in each group.The rat model of acute high-altitude hypoxia brain injury was set up and the SOD and MDA level was detected after treatment with Shen Rong Yi Jing tablets.The expression of ChAT and PKC was evaluated by Western blot and RT-PCR.ResultsCompared with control group,the activity of SOD in the brain tissue of model group decreased significantly (P<0.01),while the level of MDA increased significantly (P<0.01);the activity of SOD in the brain tissue of rats in treatment group increased significantly (P<0.01),while the level of MDA decreased significantly (P<0.01).The expression of ChAT and PKC in brain tissue of model group decreased significantly (P<0.05),while the expression level of ChAT and PKC in treatment group increased significantly (P<0.05).ConclusionShen Rong Yi Jing tablets can protect brain damage caused by acute high-altitude hypoxia,which may be related to the regulation of the expression levels of ChAT and PKC.

Shen Rong Yi Jing tablets;Acute high-altitude hypoxia;Brain injury;ChAT;PKC

2017-02-23

1.解放軍第一五九醫(yī)院，河南 駐馬店 463000;2.河南省武警總隊(duì)醫(yī)院，河南 鄭州 450052

河南省科技立項(xiàng)課題(162102310264)；軍隊(duì)后勤科技立項(xiàng)課題(CJN15J090)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201710002