李 昊，宋春雨

·論著·

丙泊酚在腦缺血再灌注中對(duì)凋亡誘導(dǎo)因子核轉(zhuǎn)位的影響

李 昊，宋春雨*

目的研究丙泊酚是否能降低凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)線粒體核轉(zhuǎn)位，阻止Caspase非依賴性神經(jīng)元凋亡，從而起到腦保護(hù)作用。方法Wistar大鼠60只隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、抑制劑組(I組)、丙泊酚組(P組)。S組大鼠僅接受手術(shù)而不遭受全腦缺血再灌注損傷打擊；I/R組大鼠采用二血管夾閉法制造缺血模型10 min，然后再灌注；I組大鼠在缺血前2 min經(jīng)靜脈注入Caspase抑制劑；P組大鼠在全腦缺血再灌注前1 h，經(jīng)股靜脈持續(xù)泵注丙泊酚持續(xù)1 h，之后注入抑制劑，2 min后建立全腦缺血再灌注損傷模型。缺血再灌注后6、24、48 h，取海馬組織用流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡率、Western blot法分析AIF線粒體核轉(zhuǎn)位、凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果與I/R、S、I組相比，P組神經(jīng)元凋亡率顯著降低，Bax/Bcl-2比值顯著降低，AIF蛋白表達(dá)水平明顯減少。結(jié)論丙泊酚對(duì)腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用可能與抑制海馬神經(jīng)元中AIF線粒體核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

丙泊酚；腦缺血再灌注；Bax/Bcl-2；AIF

0 引言

腦缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)是指腦組織發(fā)生缺血后在一定時(shí)間內(nèi)重新得到血液灌注，其功能不僅不能恢復(fù)，且結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙反而加重的一種表現(xiàn)。腦缺血發(fā)生后，缺血中心發(fā)生缺血性壞死，而缺血周圍發(fā)生大量的細(xì)胞凋亡[1]，其中神經(jīng)元大量死亡是導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失的主要原因。丙泊酚是一種靜脈麻醉藥，具有起效快、誘導(dǎo)平穩(wěn)、蘇醒快等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于外科患者的麻醉和重癥監(jiān)護(hù)室患者的鎮(zhèn)靜。研究表明，丙泊酚具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用及腦保護(hù)作用[2-5]。多項(xiàng)研究表明，丙泊酚對(duì)腦缺血損傷有一定的防治作用，但丙泊酚腦保護(hù)作用的機(jī)制目前尚未闡明[6-8]。研究表明，丙泊酚可以通過抑制凋亡相關(guān)途徑起到腦保護(hù)作用[9]。但相關(guān)研究大多集中在丙泊酚對(duì)Caspase依賴途徑神經(jīng)元凋亡的影響[10-11]。一個(gè)新的線粒體蛋白-凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)參與了非依賴Caspase細(xì)胞凋亡途徑。本研究采用二血管夾閉法建立全腦缺血再灌注損傷大鼠模型，并使用Caspase途徑抑制劑Z-VAD-FMK，阻斷Caspase依賴途徑的神經(jīng)元凋亡，觀察Caspase非依賴凋亡途徑中，AIF在丙泊酚腦保護(hù)過程中的作用。

1 材料

成年雄性Wistar大鼠6只，體重200～250 g，清潔級(jí)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK(黑)2013-001。丙泊酚注射液(規(guī)格：20 mL∶200 mg，批號(hào)：XLH057，四川國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司)，Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(規(guī)格：5 mg，批號(hào)：HY-16658，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，氟烷由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 全腦缺血再灌注損傷模型的制備和分組 Wistar 大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、全腦缺血再灌注組(I/R)、全腦缺血再灌注+Z-VAD-FMK組(I組)、丙泊酚+Z-VAD-FMK組(P組)，每組15只。所有大鼠禁食 8～12 h，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉和放血全身低血壓法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。大鼠用4%氟烷麻醉(與其他麻醉藥物相比，氟烷的腦保護(hù)作用較小，可基本排除干擾)，之后明視下行氣管插管，機(jī)械通氣用30% O2/70% N2O，維持大鼠動(dòng)脈血?dú)飧黜?xiàng)指標(biāo)正常。當(dāng)大鼠達(dá)到一定麻醉深度后，消毒頸部和右下肢皮膚。沿頸部正中線剪一切口，鈍性分離頸部肌肉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。在大鼠的右下肢沿腹股溝剪一切口，鈍性分離肌肉，游離股動(dòng)靜脈。選用24號(hào)靜脈穿刺針，進(jìn)行股動(dòng)靜脈插管，以備動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)、放血、采血樣、靜脈給藥及血液回輸用。建立動(dòng)靜脈通路后，緩慢放血，使平均動(dòng)脈壓達(dá)到40 mmHg，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min。當(dāng)腦電波成一條直線時(shí)，模型成立。S組大鼠僅接受手術(shù)而不遭受全腦缺血再灌注損傷打擊；I/R組大鼠二血管夾閉法制造全腦缺血模型10 min，之后再灌注；I組大鼠在缺血前2 min經(jīng)靜脈注入0.5 mg的Caspase抑制劑300 μL；P組大鼠在全腦缺血再灌注前1 h，經(jīng)股靜脈持續(xù)泵注丙泊酚1.0 mg/(kg·min)，持續(xù)1 h，之后經(jīng)靜脈注入0.5 mg的Z-VAD-FMK 300 μL，2 min后建立全腦缺血再灌注損傷模型。分別在缺血6、24、48 h后對(duì)大鼠進(jìn)行斷頭取腦，在-20 ℃冰盤上迅速分離海馬組織，置于液氮中保存待測(cè)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定全腦缺血再灌注損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率 取全腦缺血再灌注后24 h大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，之后經(jīng)靜脈進(jìn)行全身肝素化。肝素化之后開胸，經(jīng)主動(dòng)脈應(yīng)用冰鹽水進(jìn)行腦組織灌洗。灌洗完畢斷頭取腦。將腦組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，眼科剪剪碎，加入5 mL PBS液振蕩混勻后，以200目尼龍網(wǎng)過濾，將細(xì)胞懸液以500 r/min低溫離心5 min。收集細(xì)胞加入2 mL PBS液振蕩混勻后，以300目尼龍網(wǎng)過濾，再次將細(xì)胞懸液以500 r/min低溫離心5 min。收集細(xì)胞后加入Buffer液以備染色上機(jī)。

2.3 Western blot法分析Bcl-2、Bax的表達(dá) 大鼠在全腦缺血再灌注后 6、24、48 h，麻醉狀態(tài)下斷頭取海馬組織，將海馬組織切碎后，立即放入冰預(yù)冷的 0.5 mL緩沖液中5 s。在 4 ℃溶解的組織下，以12 000 r/min離心5 min，取上清液用于免疫印跡分析?？偟鞍椎攘康氖榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)10%聚丙烯酰胺凝膠，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，然后用一抗將膜稀釋在2%的BSA中，在PBST孵育，4 ℃過夜。然后用PBST洗滌3次(每次間隔10 min)，在室溫下用適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶共軛二次體孵育45 min，然后用 PBST 洗滌3次。顯色充分后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑使印跡顯影，并在X射線膠片曝光。

2.4 Western blot分析AIF線粒體核轉(zhuǎn)位 大鼠在全腦缺血再灌注后6、24、48 h，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)，麻醉狀態(tài)下斷頭取腦組織。將腦組織切碎后，立即放入10 mL用冰預(yù)冷的緩沖液(250 mmol/L蔗糖，10 mmol/L Hepes，pH 7.4，1 mg/mL牛血清白蛋白，0.5 mol/L medta，0.5 mol/L megta)中，在0 ℃冰槽中用玻璃勻漿器手動(dòng)勻漿，勻漿液備用。經(jīng)過在一系列梯度濃度的蔗糖溶液中超速離心，獲取細(xì)胞核濃縮部分。將懸浮于250 mmol/L蔗糖溶液中的線粒體部分取出，于-80 ℃保存，備用。取20 μg 蛋白質(zhì)進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF膜；膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉；分別加入1∶500稀釋的兔抗人AIF多抗、1∶100稀釋的兔抗人a-actin多抗、1∶200稀釋的小鼠抗人HSP60單抗，4 ℃過夜。加人HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，用DAB顯色。顯色充分后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑使印跡顯影，并在X線膠片曝光。對(duì)凝膠劑進(jìn)行掃描和定量分析。圖片上每組樣本的顯影條帶代表不同分子量的蛋白，對(duì)照蛋白分子量標(biāo)記圖，判斷條帶的蛋白分子量，用圖像定量程序來測(cè)定AIF和actin的含量水平。用相同條帶上actin值為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算各個(gè)條帶上的 AIF 相對(duì)含量。

3 結(jié)果

3.1 大鼠生理參數(shù) 三組大鼠在體重、平均動(dòng)脈血壓(MAP)或動(dòng)脈血?dú)鈴埩Ψ治龇矫娌町悷o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PaO2、PaCO2及血液pH值保持在正常范圍內(nèi)。在I/R組和P組的缺血期間，MAP 保持在預(yù)定限度內(nèi)[(40±5) mmHg]。見表1。

表1 三組大鼠生理參數(shù)比較(mmHg)

3.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞死亡率 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組在再灌注24 h后海馬神經(jīng)元的凋亡情況，觀察各組凋亡神經(jīng)元的分布。S組未見凋亡細(xì)胞；在I/R組有大量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；與I/R組相比，P組細(xì)胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)。與S組(6.4%±0.8%)相比，I/R組神經(jīng)元凋亡率(50.9%±3.2%)明顯升高(P<0.05)，P組的凋亡率(24.7%±1.2%)低于抑制劑組(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組大鼠缺血再灌注后海馬神經(jīng)元凋亡水平

3.3 丙泊酚對(duì)凋亡因子Bax、Bcl-2表達(dá)情況的影響 免疫組化結(jié)果顯示，缺血再灌注后24 h，與C組相比，I組Bax/Bcl-2比值較高(P<0.05)，而且顯著高于 P組(P<0.05)。見圖 2。

圖2 三組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較

3.4 AIF 線粒體核轉(zhuǎn)位的表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示，P組AIF蛋白的表達(dá)水平低于I組(P<0.05)。缺血后AIF蛋白水平無明顯變化，再灌注6、24、48 h后，AIF從線粒體向細(xì)胞核移位明顯。I/R組和P組的線粒體AIF相對(duì)水平低于S組(P<0.05)。I/R組線粒體組AIF相對(duì)水平低于P組(P<0.05)。I/R組和P組核因子的AIF相對(duì)水平高于S組(P<0.05)。I/R組核因子AIF相對(duì)水平高于P組。見圖3、圖4。

圖3 腦缺血再灌注后AIF蛋白表達(dá)的相對(duì)水平

圖4 缺血再灌注損傷后海馬組織中AIF轉(zhuǎn)位表達(dá)情況

注：A.Western blot顯示，再灌注后24 h，三組細(xì)胞核和線粒體中AIF的表達(dá)；B.再灌注6、24、48 h后，三組線粒體中AIF含量的相對(duì)變化；C.再灌注6、24、48 h后，三組核因子含量相對(duì)變化。*與S組比較，P<0.05;#與I/R組比較，P<0.05

4 討論

缺血再灌注損傷不僅影響缺血組織和器官的結(jié)構(gòu)，而且功能損傷和代謝障礙的嚴(yán)重程度明顯高于單純由缺血引起的損傷[12]。因此，減輕或避免缺血再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展已成為基礎(chǔ)研究和臨床研究的熱點(diǎn)。隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，有很多降低腦缺血再灌注損傷風(fēng)險(xiǎn)的方法，如：縮短操作時(shí)間，改進(jìn)操作方式，增加腦血供等，但是對(duì)生化因素誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷沒有明顯改變[13]。有研究表明，缺血再灌注前預(yù)處理，可以增加器官或組織對(duì)缺血再灌注的耐受[14-17]。

腦缺血后神經(jīng)元的凋亡過程主要是通過Caspase依賴途徑和Caspase非依賴途徑實(shí)現(xiàn)的。這兩種途徑最后都集中到線粒體來執(zhí)行凋亡過程。線粒體是動(dòng)植物能量代謝的主要場(chǎng)所，其在調(diào)控細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用[18]。大量研究表明，線粒體在細(xì)胞凋亡中起著最基本的執(zhí)行者的作用，同時(shí)線粒體也是缺血再灌注損傷攻擊的主要對(duì)象[19]。一些凋亡相關(guān)的基因產(chǎn)物都?xì)G位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，在腦缺血缺氧損傷等凋亡刺激因素作用下，線粒體崩解，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放，呼吸鏈斷裂，線粒體膜間隙的凋亡誘導(dǎo)因子釋放到胞質(zhì)或轉(zhuǎn)位到胞核，啟動(dòng)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase依賴途徑：MPTP開放，細(xì)胞色素C等釋放到胞質(zhì)后，與dATP、凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合成復(fù)合物，激活Caspase-9，之后激活Caspase-3，Caspase-3水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞解體，形成凋亡小體。Caspase非依賴途徑：線粒體中存在一些凋亡蛋白，如AIF等，從線粒體進(jìn)入胞質(zhì)后能直接作用于細(xì)胞核，引發(fā)細(xì)胞凋亡。AIF是一種膜間蛋白，具有DNA內(nèi)切酶活性，由線粒體釋放并轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)促凋亡作用，獨(dú)立地將DNA裂解為60 KB左右的DNA片段，直接引起DNA斷裂。當(dāng)細(xì)胞受到特定凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的刺激后，線粒體膜上的通透性孔道MPTP打開，允許AIF從線粒體釋放到胞漿，并轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而引起DNA大片段裂解，即AIF線粒體核轉(zhuǎn)位[20-22]。在腦缺血缺氧性損傷后，Bcl-2家族各成員的表達(dá)發(fā)生不同的變化，可直接或間接調(diào)節(jié)MPTP，決定神經(jīng)元能否成活。MPTP是細(xì)胞死亡的開關(guān)，在缺血的過程中是關(guān)閉的，但再灌注開始時(shí)，自由基大量釋放，鈣離子內(nèi)流增加，誘導(dǎo)MPTP開放，MPTP開放導(dǎo)致膜電位下降，呼吸鏈解耦聯(lián)，細(xì)胞色素C及其他壞死因子外流，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死[23]。丙泊酚可抑制MPTP的開放，降低鈣離子濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，從而對(duì)腦缺血再灌注起到積極作用[24]。

有報(bào)道，丙泊酚可以增加凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)，減少Bax的表達(dá)[25-27]，而且丙泊酚預(yù)處理可以上調(diào)Bcl-2/Bax比值，抑制全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡[28]。本研究表明，丙泊酚可以下調(diào)Bax/Bcl-2比值，抑制神經(jīng)元凋亡，與之前的研究[28]一致。Bcl-2家族成員可以調(diào)節(jié)AIF釋放，以及隨后的Caspase非依賴性細(xì)胞死亡。Bcl-2家族具有調(diào)控線粒體膜通透性的功能，在多種物質(zhì)誘導(dǎo)的凋亡中過度表達(dá)Bcl-2，可以抑制AIF從線粒體的釋放和細(xì)胞死亡。Bcl-2過度表達(dá)時(shí)，可阻止AIF從線粒體釋放，并且能調(diào)節(jié)AIF從線粒體到核的轉(zhuǎn)位[29]。Bax對(duì)AIF的釋放也有作用，過表達(dá)Bax可以引起AIF從線粒體釋放增多。因此，AIF的促凋亡功能及Bcl-2家族成員對(duì)其釋放的調(diào)控可能代表了一條降解DNA和導(dǎo)致細(xì)胞死亡的全新的信號(hào)通路。本研究表明，丙泊酚能夠顯著降低神經(jīng)元細(xì)胞凋亡水平，使凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)增加、Bax表達(dá)降低，抑制全腦缺血再灌注后AIF線粒體的核轉(zhuǎn)位。

本研究選擇臨床劑量1 mg/(kg·min)作為試驗(yàn)劑量，該劑量可以提供更好的腦保護(hù)作用和更少的循環(huán)抑制。本實(shí)驗(yàn)采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈合并低血壓方法建立全腦缺血再灌注模型，此模型模擬了臨床上的休克、心功能不全等低灌注引起的不同程度的腦組織缺血損傷，更接近臨床腦損傷患者的病理生理，對(duì)探討腦缺血損傷規(guī)律及評(píng)價(jià)藥物療效等有價(jià)值。本課題深入探討丙泊酚腦保護(hù)作用的線粒體機(jī)制，為臨床腦保護(hù)策略提供新的方法和理論基礎(chǔ)。此外，抑制AIF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路可能是治療腦損傷患者的較好選擇。

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Effectsofpropofolonnucleartranslocationofapoptosisinducingfactorduringcerebralischemiareperfusion

LI Hao,SONG Chun-yu*

(the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150006,China)

ObjectiveTo investigate whether propofol can reduce the apoptosis inducing factor (AIF),inhibit the nuclear translocation of mitochondria and prevent the apoptosis of Caspase independent neurons.MethodsTotally 60 Wistar rats were randomly divided into sham operation group (group S),ischemia reperfusion group (group I/R),inhibitor group (group I) and propofol group (group P).Rats in group S only underwent surgery without suffering from cerebral ischemia-reperfusion injury blow;rats in group I/R were established as blood deficiency model by two vessel clip preparation for 10 min,and then were given reperfusion;rats in group I were given intravenous injection of Caspase inhibitor at 2 min before ischemia;rats in group P were given intravenous continuous infusion of propofol via femoral vein for 1 h at 1 h before cerebral ischemia reperfusion,and then they were given intravenous injection of inhibitors,and the cerebral ischemia reperfusion injury model was established after 2 min.The hippocampus was taken,and the apoptosis rate was measured by flow cytometry respectively at 6 h,24 h and 48 h after ischemia reperfusion;meanwhile,the expression of AIF nuclear translocation,Bax and Bcl-2 were analyzed by Western blot.ResultsCompared with group I/R,group S and group I,the apoptosis rate,ratio of Bax/Bcl-2 and the expression of AIF protein in group P decreased significantly (P<0.05).ConclusionThe neuro-protective effect of propofol on cerebral ischemia reperfusion injury may be related to the inhibition of AIF nuclear translocation in hippocampus neurons.

Propofol;Cerebral ischemia reperfusion;Bax/Bcl-2;AIF

2017-06-28

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150006

國(guó)家自然基金課題(304000393)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201710001