張倩，杜海云，賈厚振，王明林，辛力

(1. 山東省果樹(shù)研究所，山東 泰安 271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271000；3.泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000)

HPLC-MS/MS法測(cè)定設(shè)施甜櫻桃果實(shí)中的赤霉素含量

張倩1，2，杜海云3，賈厚振1，王明林2，辛力1

(1. 山東省果樹(shù)研究所，山東 泰安 271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271000；3.泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000)

為了測(cè)定設(shè)施甜櫻桃果實(shí)中的赤霉素含量，建立了甜櫻桃果實(shí)中赤霉酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)定性定量檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈提取，液-液分配法進(jìn)行凈化，在SIM模式下對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，同時(shí)對(duì)設(shè)施甜櫻桃激素坐果果實(shí)中赤霉酸含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，赤霉酸的定量限為4.03 μg·kg-1，在5.0～100.0 μg·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.9996。方法的加標(biāo)回收率為87.64%～91.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.9%～13.5%，5份設(shè)施甜櫻桃樣品中赤霉酸含量在21.3～71.1 μg·kg-1。本試驗(yàn)建立的方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度和重復(fù)性好，可用于甜櫻桃果實(shí)中赤霉酸含量檢測(cè)。

設(shè)施甜櫻桃；赤霉素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

赤霉素(Gibberellins)是指具有赤霉烷骨架，能剌激細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)的一類化合物的總稱，屬于雙萜類的植物內(nèi)源激素，由四個(gè)異戊二烯單位組成，有四個(gè)環(huán)，環(huán)上各基團(tuán)的變化組合形成了各種不同活性的赤霉素[1]，現(xiàn)已分離鑒定的有100余種。赤霉素是一種高效能的廣譜性植物生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)，在落葉果樹(shù)上應(yīng)用廣泛，具有誘導(dǎo)無(wú)子果實(shí)的形成、提高坐果率、防止落花落果、促進(jìn)果實(shí)早熟和打破休眠的調(diào)控作用；還能改變一些植物雌雄比率，并使某些二年生植物在當(dāng)年開(kāi)花[2]。

甜櫻桃設(shè)施栽培實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，由于設(shè)施內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境的改變，果實(shí)成熟期提前，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期拉長(zhǎng)，加上管理不及時(shí)，低溫傷害、授粉受精不良、落花落果、隔年結(jié)果等現(xiàn)象時(shí)而發(fā)生，不能保證其安全生產(chǎn)，嚴(yán)重影響到果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入。因此，在有些地區(qū)，果農(nóng)通過(guò)使用以赤霉素為主的復(fù)合坐果劑替代授粉，輔助果實(shí)發(fā)育。赤霉素是一種低毒的植物激素類農(nóng)藥，盡管毒性不大，但是長(zhǎng)期、大量、不合理使用也會(huì)對(duì)人類身體健康產(chǎn)生不利影響，目前我國(guó)尚未出臺(tái)農(nóng)產(chǎn)品中赤霉素殘留檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，開(kāi)展農(nóng)產(chǎn)品如水果、蔬菜中赤霉素殘留量檢測(cè)方法的研究具有重要意義[3]。

目前赤霉素的檢測(cè)方法有毛細(xì)管氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]和酶聯(lián)免疫法[8]等，有些前處理步驟較為繁瑣，有些方法靈敏度低。本研究建立了甜櫻桃果實(shí)赤霉素含量的HPLC-MS/MS定性定量檢測(cè)方法，并測(cè)定了5份設(shè)施甜櫻桃樣品中的含量，為開(kāi)展赤霉素的安全性研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試樣品采自山東某設(shè)施甜櫻桃主產(chǎn)區(qū)5處大棚，品種均為‘紅燈’，樹(shù)齡5～7年，管理水平中等。每棚隨機(jī)選取生長(zhǎng)勢(shì)基本一致、結(jié)果量較多、無(wú)病蟲(chóng)害的植株采樣，選取大小均一、成熟度一致的果實(shí)樣品于-20℃冷凍保存待測(cè)。

1.2儀器與試劑

電子天平，粉碎機(jī)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，漩渦振蕩儀，HPLC-MS/MS(TSQ Quantum Access MAX，Thermo)。

乙腈，甲醇，乙酸乙酯，氯化鈉，98%濃硫酸，去離子化純凈水，硫酸水溶液(pH=2.5)，磷酸緩沖溶液(pH=7)。

1.3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：0.15%乙腈-甲酸水溶液(35∶65，V/V)，流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：30 μL。

電噴霧ESI離子源，離子源溫度：350℃；反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式SRM；脫溶劑溫度：300℃；毛細(xì)管電壓2.5 kV；輔助氣壓力2 kV；霧化氣、氣簾氣、輔助氣均為高純氮?dú)?，碰撞氣為氬氣，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求。

1.4樣品前處理

稱取5.0 g勻漿甜櫻桃果肉樣品至50 mL離心管中，加入25 mL乙腈和2.0 g氯化鈉，渦旋震蕩1 min后4 000 r/min離心10 min,下層用乙腈重復(fù)提取兩次，合并提取液45℃旋轉(zhuǎn)蒸干。用10 mL硫酸-水(pH 2.5)溶液溶解后加20 mL乙酸乙酯，渦旋混合1 min，4 000 r/min離心10 min。乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到燒瓶中，重復(fù)提取兩次，合并提取液。加10 mL磷酸緩沖溶液(pH 7)于提取液中，渦旋震蕩1 min，4 000 r/min離心10 min，磷酸緩沖液層轉(zhuǎn)移到離心管中，重復(fù)提取兩次，合并磷酸緩沖溶液，用硫酸-水(1∶1)調(diào)整提取物pH 2.5，然后加20 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到燒瓶中，重復(fù)提取兩次，合并提取物，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干。加甲醇-水(1∶1)10 mL，渦旋混合60 s ，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾到玻璃LC小瓶中，濾液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1赤霉素GA3的定性和定量檢測(cè)

以保留時(shí)間和離子對(duì)進(jìn)行赤霉素GA3定性檢測(cè)。樣品保留時(shí)間為3.67 min。由表1可知，樣品中選擇的3個(gè)離子豐度和標(biāo)準(zhǔn)品離子豐度比基本一致，則判斷該樣品中含有GA3。

表1 離子豐度比判定標(biāo)準(zhǔn) (%)

圖1 GA3標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖

圖2 GA3的3個(gè)碎片離子豐度信息

表2 GA3的HPLC-MS/MS測(cè)定參數(shù)

注：“*”定量離子。

圖1和圖2分別為GA3標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖和碎片離子豐度信息，可看出在所采用的色譜條件下，分析物可以得到很好的分離，未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰的干擾。表2為GA3的LC-MS/MS測(cè)定參數(shù)。綜合圖2和表2結(jié)果，選擇m/z=239為定量離子，采用外標(biāo)法定量，在5.0 ～100.0 μg·L-1范圍內(nèi)，工作曲線線性方程為Y=2441.95X，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9996，方法檢出限為1.21 μg·kg-1，定量限為4.03 μg·kg-1；選擇3個(gè)濃度做添加回收率試驗(yàn)，回收率為87.64%～91.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.9%～13.5%。

2.2甜櫻桃樣品的GA3含量

由表3可看出，5份設(shè)施甜櫻桃樣品中均檢出GA3，含量在21.3～71.1 μg·kg-1范圍內(nèi)。

表3 5份設(shè)施甜櫻桃樣品中的GA3測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

目前歐盟、日本和加拿大等組織和國(guó)家已制定了赤霉素的最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)，歐盟規(guī)定赤霉素在58種水果上的MRL為5.0 mg·kg-1，日本規(guī)定赤霉素(GA3)在42種水果中的MRL為0.2 mg·kg-1[9，10]，我國(guó)目前尚未出臺(tái)赤霉素限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照歐盟和日本限量標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)5份甜櫻桃樣品中的赤霉素含量未超標(biāo)。

近年來(lái)，水果中植物生長(zhǎng)激素的殘留問(wèn)題已引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道，廣東地區(qū)330份市售水果和蔬菜中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢出率為55.5%，赤霉素檢出數(shù)為24個(gè)，含量在0.996 ～54.6 μg·kg-1[11]；吉林省75份市售水果赤霉素檢出率為10.67%，含量為2.77～506 μg·kg-1[12]。目前我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模種植果園所占比例較少，仍以小農(nóng)散戶為主，部分果農(nóng)對(duì)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑認(rèn)識(shí)不足，盲目增加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用濃度和使用次數(shù)等情況還難以完全杜絕，果品存在一定的食用安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，建議國(guó)家加強(qiáng)安全標(biāo)準(zhǔn)研究，完善植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系，規(guī)范果品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)主要圍繞甜櫻桃果實(shí)中赤霉素GA3的檢測(cè)方法展開(kāi)，目標(biāo)是滿足實(shí)際樣品分析需要的前提下，建立簡(jiǎn)便、快速、高效的植物樣品中GA3檢測(cè)方法。在此基礎(chǔ)上，建立了GA3的液液分配提取、凈化前處理方法和HPLC-MS/MS分析方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際甜櫻桃樣品的分析中。添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，5份設(shè)施甜櫻桃樣品中GA3含量為21.3～71.1 μg·kg-1。

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DeterminationofGibberellinContentinSweetCherryFruitunderProtectedCultivationbyHPLC-MS/MS

Zhang Qian1,2, Du Haiyun3, Jia Houzhen1, Wang Minglin2, Xin Li1

(1.ShandongInstituteofPomology,Taian271000,China; 2.DepartmentofFoodScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271000,China;3.TaianCenterforFoodandDrugControl,Taian271000,China)

A qualitative and quantitative determination method for gibberellin content in sweet cherry fruit was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was extracted by acetonitrile, and purified by liquid-liquid distribution method, then the sample solution was qualitatively and quantitatively detected by HPLC-MS/MS with SIM mode. The results showed that the quantification limit for gibberellin was 4.03 μg·kg-1, the gibberellin standard showed a good linearity in the range of 5.0～100.0 μg·L-1with the correlation coefficient of 0.9996.The average recovery of gibberellin was 87.64%～91.75%, and the relative standard deviations was 8.9%～13.5%. The gibberellin contents in 5 samples were 21.3～71.1 μg·kg-1. This method was simple to operate with high sensitivity and good reproducibility. It could be used to determinate the gibberellin content in sweet cherry fruit.

Sweet cherry under protected cultivation; Gibberellin; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

S662.5

A

1001-4942(2017)10-0117-04

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.025

2017-08-29

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系水果創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-06-13);山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目——櫻桃采后商品化處理設(shè)備研制與試驗(yàn)示范;泰安市科技計(jì)劃重大專項(xiàng)(201340629)

張倩,山東淄博人,在讀博士，從事果品貯藏加工方面的研究。E-mail:cherryzhang2006@126.com

辛力，研究員，主要從事果品貯藏保鮮與加工利用研究。E-mail：sdxinl：@foxmail.com