李 瑤，萬(wàn)勝利，張永紅，胡雪原，張景勍

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶藥物高校工程研究中心，重慶 400016；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 瀘州 400010)

載天冬酰胺酶磺丁基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)體的穩(wěn)定性及相關(guān)機(jī)制

李 瑤1，萬(wàn)勝利2，張永紅1，胡雪原1，張景勍1

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶藥物高校工程研究中心，重慶 400016；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 瀘州 400010)

目的考察載天冬酰胺酶(asparaginase, Ase)磺丁基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)體(sulfobutyl ether-β-cyclodextrin liposomes loaded with asparaginase, ASDL)的穩(wěn)定性，并探究其穩(wěn)定性增強(qiáng)的相關(guān)機(jī)制。方法采用逆向蒸發(fā)法制備ASDL，通過(guò)酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶穩(wěn)定性、血漿穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性，考察ASDL的體外穩(wěn)定性，并利用熒光光譜法探究其穩(wěn)定性增強(qiáng)的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASDL的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶穩(wěn)定性、血漿穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性都優(yōu)于Ase。熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASDL特性提高的原因可能與熒光發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境和疏水結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。結(jié)論磺丁基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)體能夠有效保護(hù)Ase不受外界環(huán)境，如水解酶、pH、溫度的影響，從而提高了Ase的穩(wěn)定性。

生物大分子；天冬酰胺酶；環(huán)糊精脂質(zhì)體；穩(wěn)定性；體外；熒光

天冬酰胺酶(asparaginase, Ase)是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤特性的治療酶[1]，1953年，首次從幾內(nèi)亞豬血清中提取獲得，而人類血清中缺少Ase[1-2]。腫瘤細(xì)胞依賴天冬酰胺合成蛋白質(zhì)以維持自身的惡性增生，Ase能夠快速消除腫瘤細(xì)胞賴以生存的天冬酰胺，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因蛋白質(zhì)合成受阻而死亡[3-5]。在臨床應(yīng)用中，Ase等大分子藥物存在的主要問(wèn)題為穩(wěn)定性差、半衰期短、免疫原性高，且易產(chǎn)生副作用等[6-7]。

為使Ase能更好地應(yīng)用于臨床，Chien等[8]對(duì)Ase進(jìn)行PEG化修飾，Karamitros等[9-10]采用葡聚糖/聚精氨酸層的CaCO3納米粒裝載Ase，Ashrafi等[11]用一種新型脂肪酸與Ase進(jìn)行生物接合。這些改造在一定程度上阻止了蛋白酶對(duì)Ase的分解及溫度對(duì)其的影響，但仍存在Ase易脫落、免疫原性高、生物相容性低等不足。脂質(zhì)體具有類細(xì)胞的磷脂雙分子結(jié)構(gòu)，既可作為天然的保護(hù)屏障，又有好的生物相容性。環(huán)糊精脂質(zhì)體是在脂質(zhì)體基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型的藥物遞送系統(tǒng)，能給予藥物雙重保護(hù)作用，避免藥物的降解或泄漏，具有增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性、抗水解、提高藥物生物利用度等優(yōu)點(diǎn)，與普通脂質(zhì)體相比應(yīng)用前景更好[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)采用逆向蒸發(fā)法制備了門冬酰胺酶磺丁基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)體(sulfobutyl ether-β-cyclodextrin liposomes loaded with asparaginase, ASDL)，考察了ASDL的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶穩(wěn)定性、血漿穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性，并根據(jù)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)熒光光譜實(shí)驗(yàn)，探究了ASDL穩(wěn)定性增強(qiáng)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1儀器TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DF-101S型集熱式磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；Zetasizer Nano zs90激光粒度電位儀(英國(guó)馬爾文公司)。

1.2試劑Ase(以色列Prospec公司)；膽固醇(美國(guó)Sigma公司)；磷脂(德國(guó)Lipoid公司)；磺丁基-β-環(huán)糊精(南京都萊生物技術(shù)有限公司)；Tris(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；葡聚糖凝膠G-200(上?？笊锛夹g(shù)有限公司)；考馬斯亮藍(lán)G-250(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；ASDL(實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)20161024，平均粒徑：166.2 nm，平均Zeta電位：-28.2 mV)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1ASDL的制備稱取處方量的Ase和磺丁基-β-環(huán)糊精，溶于10 mL Tris-HCl緩沖液中(pH 7.3)，35℃攪拌2 h，得溶液A。將處方量的卵磷脂和膽固醇溶于15 mL二氯甲烷，減壓旋蒸至形成均勻薄膜，加入15 mL乙醚脫膜后，加入溶液A，超聲10 min至形成均勻的帶乳光的分散體系，并繼續(xù)減壓蒸發(fā)至凝膠狀塌陷為乳白色的帶乳光的均勻液體，取出定容10 mL，得ASDL。

2.2活性測(cè)定使用奈斯試劑法[14]測(cè)定Ase的活性。取底物天冬酰胺溶液，加入0.1 mL Ase溶液，于37℃水浴條件下精確反應(yīng)10 min后，立即加入0.1 mL三氯醋酸溶液終止反應(yīng)，離心，取上清液，加入適量蒸餾水和奈斯勒指示劑，靜置10 min，于480 nm處測(cè)定其紫外吸光值。實(shí)驗(yàn)前，底物天冬酰胺溶液最好預(yù)熱2 min。

2.3酸堿穩(wěn)定性采用pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl緩沖液，分別溶解Ase及ASDL，得到不同pH條件下的Ase及ASDL溶液。將Ase及ASDL溶液于37℃水浴孵育40 min后，按“2.2”項(xiàng)下的方法分別考察Ase及ASDL的酸堿穩(wěn)定性。

2.4熱穩(wěn)定性將Ase及ASDL溶液置于55℃的水浴中，分別于0、1、2、3、4、5 h時(shí)取出，按“2.2” 項(xiàng)下的方法考察Ase及ASDL溶液的熱穩(wěn)定性。

2.5抗胰蛋白酶穩(wěn)定性等量胰蛋白酶溶液與Ase及ASDL溶液混合，置于37℃水浴中保存，于0、10、20、30、40、50、60 min取出，按“2.2” 項(xiàng)下的方法考察Ase及ASDL溶液的抗胰蛋白酶穩(wěn)定性。

2.6血漿穩(wěn)定性大鼠眼眶取血，置于肝素化的離心管，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液即得空白血漿。取Ase及ASDL溶液與等體積的空白血漿混合，于37℃下孵育0、1、2、4、8、12、24、48、72、96 h，按“2.2” 項(xiàng)下的方法考察Ase及ASDL溶液的血漿穩(wěn)定性。

2.7貯存穩(wěn)定性將Ase及ASDL溶液避光貯存于4℃條件下，分別于0、1、2、5、10、15、20、28 d時(shí)取出，按“2.2” 項(xiàng)下的方法考察Ase及ASDL溶液的貯存穩(wěn)定性。

2.8熒光實(shí)驗(yàn)考察游離Ase及ASDL溶液在不同溫度條件下的熒光吸收。取游離Ase及ASDL溶液2 mL，于25℃下孵化3 h，破乳，取980 μL上層清液與20 μL異硫氰酸熒光素溶液，混合，在發(fā)射波長(zhǎng)500～600 nm，激發(fā)波長(zhǎng)480 nm下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。同法，取游離Ase及ASDL溶液2 mL，于55℃下孵化3 h，破乳，按上述方法測(cè)其熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1酸堿穩(wěn)定性由Fig 1可知，整體來(lái)看，不同pH條件下ASDL的活性均優(yōu)于Ase，尤其在pH 7.5時(shí)最明顯(P<0.05)，此時(shí)ASDL的活性相對(duì)于Ase提高了約25%。因此，酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASDL相對(duì)于Ase更能抵抗環(huán)境酸堿性的變化。

3.2熱穩(wěn)定性Fig 2結(jié)果顯示，相較于ASDL，Ase的活性呈快速下降趨勢(shì)，1.5 h時(shí)Ase的活性即降至50%，而此時(shí)ASDL的活性仍高達(dá)約90%，3 h時(shí)已檢測(cè)不到Ase的活性，而ASDL的活性仍保持在50%以上，且能維持至5 h時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ASDL和Ase的熱穩(wěn)定性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且ASDL的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于Ase。

Fig 1 pH stabilities of ASDL and Ase(n=3)

*P<0.05vsAse

Fig 2 Thermal stabilities of ASDL and Ase(n=3)

*P<0.05vsAse

3.3抗胰蛋白穩(wěn)定性如Fig 3所示，與蛋白酶接觸后，ASDL和Ase的活性均受到較大影響，但與ASDL相比，Ase的活性受到的影響更為明顯。Ase的活性降至50%約需30 min，而ASDL的活性降至50%約需55 min，50 min時(shí)已檢測(cè)不到Ase的活性，但此時(shí)ASDL的活性仍保持在50%以上，且直到360 min時(shí)才檢測(cè)不到。

3.4血漿穩(wěn)定性從Fig 4可以看出，隨著時(shí)間的增加，ASDL與Ase的活性都逐步下降，但ASDL的活性均高于Ase，Ase的活性降至50%約需16 h，而ASDL的活性降至50%約需60 h，48 h即檢測(cè)不到Ase的活性，但此時(shí)ASDL的活性仍高達(dá)65%，且到96 h才降至為0。血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明ASDL較Ase具有更優(yōu)的血漿穩(wěn)定性。

Fig 3 Proteolytic stabilities of ASDL and Ase(n=3)

*P<0.05vsAse

Fig 4 Plasma stabilities of ASDL and Ase(n=3)

*P<0.05vsAse

3.5貯存穩(wěn)定性如Fig 5的4℃貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，當(dāng)貯存時(shí)間為1～2 d時(shí)，ASDL與Ase的活性基本相同，d 5時(shí)兩者的活性開(kāi)始出現(xiàn)較大差別，貯存10～15 d時(shí)差別最為明顯(P<0.05)，此時(shí)ASDL的活性高于Ase約24%～28%，20～28 d時(shí)，Ase的活性相對(duì)于ASDL呈現(xiàn)出更為快速的下降趨勢(shì)。

3.6熒光實(shí)驗(yàn)ASDL和Ase受熱前后的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)Fig 6。加熱后，ASDL和Ase的熒光強(qiáng)度相比加熱前都明顯降低，但ASDL受熱后熒光強(qiáng)度下降的幅度明顯低于Ase。引起熒光強(qiáng)度改變的原因可能是熒光發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境和疏水結(jié)構(gòu)的改變[15]。結(jié)合Fig 6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)磺丁基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)體對(duì)Ase起到了保護(hù)作用，阻止了加熱條件對(duì)Ase熒光發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境和疏水結(jié)構(gòu)或是構(gòu)象的進(jìn)一步改變，增加了ASDL的穩(wěn)定性。

Fig 5 Storage stabilities of ASDL andAse incubated at 4℃(n=3)

*P<0.05vsAse

Fig 6 Fluorescence results of ASDLand Ase before and after heating(n=3)

4 討論

環(huán)糊精脂質(zhì)體作為一類新型脂質(zhì)體，具有更穩(wěn)定、能掩蓋裝載藥物疏水性和實(shí)現(xiàn)更好包封效果的優(yōu)勢(shì)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)采用逆向蒸發(fā)法制備了門冬酰胺酶磺丁基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)體(ASDL)，對(duì)ASDL的微觀形態(tài)及生物學(xué)特性進(jìn)行了考察，并設(shè)計(jì)熒光光譜實(shí)驗(yàn)探究了ASDL穩(wěn)定性提高的相關(guān)機(jī)制。通過(guò)考察發(fā)現(xiàn)，ASDL的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶穩(wěn)定性、血漿穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性均明顯優(yōu)于Ase。熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，磺丁基-β-環(huán)糊精脂質(zhì)體能夠阻止加熱條件對(duì)Ase熒光發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境和疏水結(jié)構(gòu)或是構(gòu)象的進(jìn)一步改變，使Ase保持其活性結(jié)構(gòu)不受影響，從而提高了ASDL的穩(wěn)定性[15-16]。

ASDL不僅具有更優(yōu)的藥物穩(wěn)定性和更好的藥物包封效果，而且通過(guò)磺丁基-β-環(huán)糊精修飾后，理論上還具有能延長(zhǎng)封裝藥物生物半衰期、提高封裝藥物生物利用度、降低毒副作用等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，相比于Ase，經(jīng)過(guò)磺丁基-β-環(huán)糊精修飾后得到的ASDL環(huán)糊精脂質(zhì)體具有更優(yōu)的酶學(xué)特性和更好的穩(wěn)定性，為ASDL在體內(nèi)的進(jìn)一步研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Stabilitiesandrelatedmechanismofsulfobutylether-β-cyclodextrinliposomesloadedwithasparaginase

LI Yao1, WAN Sheng-li2, ZHANG Yong-hong1, HU Xue-yuan1, ZHANG Jing-qing1

(1.ChongqingResearchCenterforPharmaceuticalEngineering,CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DeptofPharmacy,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,LuzhouSichuan400010,China)

AimTo investigate the stabilities and related mechanism of sulfobutyl ether-β-cyclodextrin liposomes loaded with asparaginase(ASDL).MethodsReverse evaporating method was used for the prepar-ation of ASDL, and the acid-base stability, thermal stability, antitrypsin stability, plasma stability and storage stability of ASDL were tested. Moreover, fluorescence spectrum method was utilized to explore the stability enhancement mechanisms of ASDL.ResultsThe results of stability showed that the acid-base stability, thermal stability, antitrypsin stability, plasma stability and storage stability of ASDL were all superior to asparaginase. Fluorescence experiment results indicated that the improved characteristics of ASDL might be related to the changes of the surrounding microenvironment of fluorescent chromophore or the structure of hydrophobic.ConclusionASDL can effectively protect asparaginase from the external environment, such as hydrolase, pH, temperature and so on, to improve the stabilities of asparaginase.

biomacromolecule; asparaginase; cyclodextrin liposomes; stabilities;invitro; fluorescence

A

1001-1978(2017)11-1596-05

R345.69；R943；R977.3；R979.19

時(shí)間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.046.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.023

2017-07-24,

2017-08-26

重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目 (No CYS16133)

李 瑤(1993-)，女，碩士生，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)，E-mail：1422405629@qq.com； 張景勍(1973-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)，通訊作者，E-mail：zjqrae01@163.com