龐曉晨，成睿珍，李玥，趙飛，趙靜

肛洗二號中藥復(fù)方熏洗劑的含量測定及其臨床應(yīng)用

龐曉晨1，2，成睿珍1，2，李玥1，趙飛1，趙靜1

目的：采用超高效液相色譜（UPLC）方法，建立中藥復(fù)方熏洗劑中鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素含量測定方法，并通過臨床應(yīng)用對照觀察，闡明中藥復(fù)方熏洗劑的臨床藥用價值。方法：采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；以乙腈-0.1%甲酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.3 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30℃。臨床觀察根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為治療組和對照組，治療組予以中藥洗劑坐浴，對照組予1∶5000高錳酸鉀溶液坐浴，療程2周，觀察兩組手術(shù)后肛緣水腫例數(shù)及2周后療效。結(jié)果：鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素分別在(5.09～101.80)μg/mL、(10.13～202.60)μg/mL和(5.14～102.80)μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為100.73%、100.44%和100.73%（n=6）；RSD分別為0.59%、0.89%和0.76%。治療組水腫160例，對照組為160例，治療組2周后，治療組總有效率95.65%，對照組為67.5%（P＜0.05）。結(jié)論：本實驗含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好，為中藥復(fù)方熏洗劑的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。臨床應(yīng)用研究表明，中藥熏洗劑治療痔瘡有效、方便。

中藥熏洗劑；混合痔；含量測定；超高效液相色譜法；臨床應(yīng)用

中藥復(fù)方熏洗劑由黃柏、槐花、五倍子、乳香、沒藥等10多味中藥組成，是多年臨床治療的經(jīng)驗方。根據(jù)濕熱下注型混合痔術(shù)后表現(xiàn)為濕、熱、瘀的臨床癥狀，依靠其藥力和熱力作用于肛腸病變部位，使患處腠理疏通，氣血流暢，有利于消除水腫、控制炎癥，改善局部微循環(huán)、促進(jìn)創(chuàng)口愈合的功效[1]。其中黃柏為君藥，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡等功效，主要含小檗堿等多種活性成分，而小檗堿具有抗菌、抗炎、抗病毒等活性作用[2-3]?；被ň哂袥鲅寡⑶甯螢a火的功效?，F(xiàn)代研究表明，其主要成分為蘆丁和槲皮素，均具有抗炎、止血、抗病毒等多種藥理作用。本試驗采用超高效液相色譜梯度洗脫法，同時測定黃柏有效成分鹽酸小檗堿及槐花中有效成分蘆丁和槲皮素；通過對熏洗劑的臨床應(yīng)用進(jìn)行觀察研究，闡明了中藥熏洗劑的臨床藥用價值。

1 材料與方法

1.1 材料超高效液相色譜儀（Waters，Acquity，TUV Detector，Sample Manager-FTN，Quaternary Solvent Manager美國），AX205電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），臺式通用冷凍離心機(jī)（THERMO FISHER美國），電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

小檗堿對照品(批號110713-201212)，蘆丁對照品(批號100080-201409)，槲皮素對照品(批號100081-201509)，中藥飲片（購自天津市中藥飲片廠有限公司和北京盛世龍藥業(yè)有限公司，經(jīng)天津濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科宋斌主管中藥師鑒定，均符合2015年版《中國藥典》一部規(guī)定），乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水。

1.2 色譜分析方法

1.2.1 色譜條件Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸水溶液為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長260 nm；流速0.3 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL。

表1 梯度洗脫

1.2.2 對照品溶液的制備取鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含鹽酸小檗堿101.80 μg/mL、蘆丁202.60 μg/mL和槲皮素102.80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1.2.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備稱取處方量飲片，放入砂鍋中，加入適量水浸泡0.5 h，加水量為沒過藥材飲片半寸或一寸。先武火煎煮，煮沸后改為文火20 min，倒出第一次所煎藥液。紗布過濾，收集續(xù)慮液。再次加水煎煮，方法同上。合并兩次煎煮的續(xù)慮液。取1 mL續(xù)慮液至10 mL量瓶中，加甲醇定容，于離心機(jī)內(nèi)離心10 min，取上清液，經(jīng)0.20 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例及制備工藝制備缺黃柏和槐花的陰性樣品，稱取相應(yīng)量，如上處理，得陰性樣品溶液。

1.2.4 專屬性實驗取鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的混合對照品、砂鍋煎煮供試品和陰性樣品溶液，進(jìn)樣。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素對照品適量，分別配成含鹽酸小檗堿5.09、10.18、20.36、40.72、81.44、101.80 μg/mL、蘆丁10.13、20.26、40.52、81.04、162.08、202.60 μg/mL和含槲皮素5.14、10.28、20.56、41.12、82.24、102.80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按色譜條件進(jìn)樣2 μL，測定峰面積，以峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸。

1.2.6 精密度取混合對照品2 μL，按“2.1.1”項下方法測定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣5次，測量鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的峰面積[4-5]。

1.2.7 重復(fù)性取同一供試品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定并計算鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素含量[6]。

1.2.8 穩(wěn)定性取同一供試品溶液，與室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)行含量測定。

1.2.9 加樣回收率稱取已測定含量的供試品溶液適量，精密稱定，共6份，分別精密加入含一定量鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定樣品中鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的含量，計算回收率[7]。

1.3 樣品測定取3批處方量藥材，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別測定鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的峰面積。

1.4 臨床應(yīng)用

1.4.1 臨床資料本次研究共選取患者320例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為治療組和對照組，各160例。治療組男92例，女58例；年齡20～64歲，平均（45±5）歲。病程1～15年，平均（8±2）年。對照組男76例，女84例；年齡20～68歲，平均（43±5）歲。病程1～18年，平均（10±2）年。兩組性別、年齡、病程等無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.4.2 入選標(biāo)準(zhǔn)按照2006年中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會結(jié)直腸肛門外科學(xué)組、中華中醫(yī)藥學(xué)會且肛腸分會和中圍中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會肛腸分會聯(lián)合制定的“痔臨床診治指南”中混合痔的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中痔的診斷依據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)且實施混合痔外剝內(nèi)扎術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肛腸疾病如瘺、脹腫等。

1.4.3 治療方法兩組均實施混合痔外剝內(nèi)扎術(shù)。手術(shù)后治療組使用中藥熏洗劑坐浴。由制劑室統(tǒng)一煎制，真空包裝，每劑兩袋，每袋300 mL。加水至1500 mL，待藥液溫度合適（30℃～40℃），熏洗坐浴15～20 min，2次/d。對照組用1∶5000高錳酸鉀溶液，熏洗坐浴，方法同上。共治療2周[8]。

1.4.4 療效評價標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》制定。顯效：混合痔術(shù)后傷口無水腫或水腫癥狀消失，水腫范圍和疼痛基本消失。有效：混合痔術(shù)后傷口水腫癥狀好轉(zhuǎn)，水腫范圍縮小，疼痛減輕。無效：療程結(jié)束時混合痔術(shù)后傷口水腫癥狀基本無改變，水腫范圍和疼痛不變[9]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，療效比較用Riddit分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 樣本量估算方法根據(jù)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)兩組樣本率比較，選用以下方法進(jìn)行樣本量估算，計算公式為：

n為每組所需樣本量，π1和π2分別為兩組預(yù)期有效率（%），α為Ⅰ類錯誤的概率（根據(jù)本次研究需要，選0.05），β為Ⅱ類錯誤的概率（根據(jù)本次研究需要，選0.10），查f（αβ）表為10.5。通過前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，治療組有效率約為95%，對照組有效率約為84%，代入上述公式。n=[96(100-96)+85(100-85)]× 10.5/(85-96)2=143.96≈144，即每組需要144例。按10%脫失率計算，每組不少于158例，故本實驗選取160例。

2 結(jié)果

2.1 色譜分析方法結(jié)果

2.1.1 專屬性進(jìn)樣結(jié)果陰性樣品無干擾，證明此色譜條件可行。見圖1。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線以峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，鹽酸小檗堿回歸方程：Y=27362x-3505.9，r= 0.9999；蘆丁回歸方程：Y=13925x+3462.5，r=0.9999；槲皮素回歸方程：Y=26765x-6933.5，r=0.9999。結(jié)果表明鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度測得鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素峰面積值的RSD分別為1.40%、0.73%和0.81%，精密度符合要求。

2.1.4 重復(fù)性測定并計算鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素含量的RSD分別為1.06%、0.53%和0.94%，重復(fù)性良好。

圖1 UPLC色譜圖

2.1.5 穩(wěn)定性以峰面積為指標(biāo)計算鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的RSD分別為1.30%、1.13%和1.29%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.6加樣回收率加樣回收率結(jié)果見表2。表明鹽酸小檗堿、蘆丁和槲皮素的平均回收率分別為100.73%、100.44%和100.73%，RSD均小于1%。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果

2.2 樣品測定樣品測定結(jié)果見表3。表明鹽酸小檗堿的含量分別為0.439、0.441、0.432 mg/g；蘆丁的含量分別為4.070、4.124、4.065 mg/g；槲皮素的含量分別0.400、0.399、0.394 mg/g，RSD均小于2%。

表3 含量測定結(jié)果(mg/g)

2.3 臨床應(yīng)用結(jié)果由結(jié)果可知，兩組比較，治療組手術(shù)后肛緣水腫例數(shù)明顯低于對照組（P＜0.05）。詳見表4。2周后療效比較，治療組總有效率明顯高于對照組（P＜0.05）。詳見表5。

表4 兩組患者手術(shù)后肛緣水腫例數(shù)比較(n,%)

表5 兩組患者2周后療效比較

3 討論

試驗以甲醇為溶劑，對熏洗劑進(jìn)行了全波長掃描，鹽酸小檗堿的最大吸收波長為265 nm，蘆丁和槲皮素的最大吸收波長為257 nm。經(jīng)過考察不同波長時幾種成分的含量變化，最終實驗選擇260 nm作為檢測波長，此時3種成分的含量均較高，且與雜質(zhì)峰分離度較好，基線平直[10]。

此外，我們首先以甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)為流動相，采用等度洗脫，結(jié)果表明，各組成分無法完全分離，保留時間也相對較長?？紤]到復(fù)方制劑成分復(fù)雜，采用梯度洗脫能更好地調(diào)整各組分的出峰時間，優(yōu)化各組分的分離度[11]。

本實驗采用梯度洗脫，分別考察了甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、甲醇-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)、乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)等不同流動相體系對實驗的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)采用甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)作為流動相，鹽酸小檗堿出峰時間較晚，且各色譜峰有不同程度的拖尾現(xiàn)象，其中鹽酸小檗堿拖尾特別嚴(yán)重，加入少量甲酸后可有效改善拖尾現(xiàn)象，使峰型較好。采用乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)比甲醇-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)更為理想，分離度較好，峰對稱性較好，并能達(dá)到基線分離。綜合考慮，最終選用乙腈-0.1%甲酸水溶液為本實驗的流動相。

在實驗過程中，選取了不同濃度的甲醇對樣品進(jìn)行稀釋，分別為去離子水、50%甲醇和100%甲醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用去離子水稀釋樣品后，樣品中的鹽酸小檗堿幾乎沒有峰值，50%甲醇稀釋樣品后，鹽酸小檗堿峰值較小，槲皮素色譜峰分離度也較差，而使用100%甲醇稀釋樣品后，蘆丁、鹽酸小檗堿和槲皮素3種成分的色譜峰均有較好的分離度，峰對稱性也很好，因此，本實驗選取100%甲醇對樣品進(jìn)行稀釋。

本復(fù)方由12味中藥構(gòu)成，成分較為復(fù)雜，使用普通高效液相色譜儀檢測可能分離成分的效果較差，保留時間也比較長。本實驗采用的超高效液相色譜法（UPLC）是在傳統(tǒng)普通高效液相色譜的基礎(chǔ)上建立的一種新的色譜分析方法，使用了粒徑低于2 μm的顆粒作為填料以達(dá)到增加柱效的目的，良好的分離速度和分離度更適合于中藥復(fù)方多指標(biāo)成分的定量檢測[12-13]。

因此，本文采用高效性液相色譜法對中藥復(fù)方熏洗劑進(jìn)行含量測定，選取多種藥效活性成分作為評價指標(biāo)，建立了高效、快速、準(zhǔn)確的UPLC測定方法。該方法可以大大降低復(fù)雜中藥復(fù)方制劑的分析時間，并且經(jīng)方法學(xué)驗證，測定結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性，為中藥復(fù)方熏洗劑的質(zhì)量控制以及該方進(jìn)一步的開發(fā)利用提供有力保障。

肛腸病術(shù)后出現(xiàn)的疼痛、腫脹、出血等癥狀，發(fā)病以風(fēng)、濕、熱、瘀為主，其病因病機(jī)多為濕熱阻滯、氣血凝聚、經(jīng)絡(luò)阻隔或濕熱下注、熱傷腸絡(luò)或濕熱阻滯肛門皮膚[14-15]。熏洗療法是中醫(yī)外治法常用的治療方法，由于熏洗能使藥物直達(dá)病所，奏效迅捷[16]。方中苦參、黃柏祛風(fēng)、除濕、止癢；槐花、五倍子涼血止血，澀腸固脫，用于痔瘡出血，脫崗不收；沒藥、乳香宣通臟腑，流通經(jīng)絡(luò)。諸藥合用，共奏清熱利濕、瀉火解毒、消腫止痛之功。故用于肛腸病，可改善癥狀，加速傷口愈合。經(jīng)多年臨床應(yīng)用，療效顯著。

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Content Determination and Clinical Application of Gangxi Ⅱ Chinese Medicine Fumigation Agent

PANG Xiao-chen，CHENG Rui-zhen，LI Yue，et al.Department of Pharmacology,Chinese Medicine Hospital of Tianjin Binhai New Area,Tianjin(300451),China

ObjectiveTo establish the method for determination of berberine,rutin and quercetin hydro?chloride concentration in a Chinese herbal compound fumigating lotion using ultra performance liquid chromatog? raphy(UPLC)and to elucidate the clinical value of this fumigating lotion by clinical application and con?trolled observation.MethodsThe ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)column wasused and the gradient elution of acetonitrile-0.1%formic acid as mobile phase was carried out with a flow rate of 0.3 mL/min，a detection wavelength of 260 nm and a column temperature of 30℃.The clinical observation was divided into the treatment group and the control group according to the random number table method.The treatment group

lotion hip bath and the control group were given 1:5000 potassium permanganate hip bath.After 2 weeks of treatment,the number of anal margin edema after surgery and the therapeutic effect for 2 weeks were observed.ResultsThe calibration curves for berberine hydrochloride,rutin and quercetin were linear in the ranges of(5.09～101.80)μg/mL,(10.13～202.60)μg/mL and(5.14～102.80)μg/mL,respectively and their linearity was good.The average recoveries were 100.73%，100.44%and 100.73%(n=6),respectively.RSD were 0.59%,0.89%and 0.76%,respectively.There were 160 cases of edema in the treatment group and 160 cas?es in the control group.The total effective rate was 95.65%in the treatment group and 67.5%in the control group(P＜0.05).ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible which provides a theoretical basis for the quality control of traditional Chinese medicine compound fumigants.Clinical application studies suggested that the treatment of hemorrhoids using Chinese herbal medicine fumigation agent was effective and convenient.

Chinese herbal medicine fumigation;mixed hemorrhoids;content determination;ultra perfor?mance liquid chromatography;clinical application

R285.6

A

1007-6948(2017)05-0527-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.05.017

天津市中醫(yī)藥管理局天津市衛(wèi)生和計劃生育委員會中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題（2015144）1.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)科（天津300451）2.天津中醫(yī)藥大學(xué)（天津300193）

趙靜，E-mail:dr_zhaojing@163.com

（收稿：2017-01-26 修回：2017-09-05）

（責(zé)任編輯 劉洪斌）