林麗飛　劉春國(guó)　熊力軍

摘要：以燈盞花組織培養(yǎng)苗為材料，研究He-Ne激光、半導(dǎo)體激光、CO2激光對(duì)燈盞花幾組抗性指標(biāo)的影響。使用3種激光對(duì)燈盞花組培苗進(jìn)行不同時(shí)間的輻照處理。結(jié)果表明，3種激光中，CO2激光輻照60 s時(shí)，過(guò)氧化物酶活性是對(duì)照組的33倍，過(guò)氧化氫酶活性是對(duì)照組的48倍，超氧化物歧化酶活性比對(duì)照組提高3331 U/g；輻照180 s時(shí)，丙二醛含量比對(duì)照組降低244 μmol/g，可溶性糖含量急劇下降，為0045%。He-Ne激光輻照60 s、半導(dǎo)體激光輻照30 s時(shí)，脯氨酸含量分別為9624、9498 μg/g，是對(duì)照組的35倍，CO2激光輻照180 s、半導(dǎo)體激光輻照30 s時(shí)，可溶性蛋白含量最高，比對(duì)照提高745 mg/g。不同激光對(duì)燈盞花組培苗輻照一定時(shí)間可提高其抗氧化活性，有利于提高燈盞花抗逆性。

關(guān)鍵詞：燈盞花；He-Ne激光；半導(dǎo)體激光；CO2激光；生化指標(biāo)

中圖分類號(hào)： S56723+901文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0135-03

收稿日期：2016-11-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：61068003）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2009ZC131M）；第一批紅河學(xué)院中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目（編號(hào)：2010PY0104）。

作者簡(jiǎn)介：林麗飛（1978—），女，云南建水人，碩士，副教授，主要從事植物保護(hù)、植物細(xì)胞工程的研究。E-mail：llf_biology2@126 com。

通信作者：張燦邦，教授，碩士生導(dǎo)師，從事光學(xué)物理學(xué)研究。E-mail：cbzhanguoh@ gmailcom。

燈盞花，學(xué)名短葶飛蓬[Erigeron breviscapus （Vant） Hand-Mazz]，別稱燈盞細(xì)辛，為菊科飛蓬屬多年生野生草本植物，主要分布于西藏、四川、云南等省[1-2]。燈盞花生長(zhǎng)在海拔1 200～3 500 m的中山、亞高山開(kāi)闊山坡草地和林緣地帶，是一種重要的藥用植物，其作用主要有活血化瘀、舒筋、止痛、改善微循環(huán)，對(duì)預(yù)防心血管等疾病具有特殊的療效[3]。目前，藥材市場(chǎng)對(duì)燈盞花的需求不斷擴(kuò)大，而燈盞花自然繁殖率低，發(fā)芽率低，加上過(guò)度的挖掘，使得野生燈盞花資源逐漸枯竭[4]。為滿足廣大市場(chǎng)的需求，研究開(kāi)發(fā)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)能力強(qiáng)、抗逆性好的燈盞花品種已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，激光應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域已取得大量研究成果[5-20]，特別是激光對(duì)生物體產(chǎn)生具有重要意義的生物效應(yīng)更是倍受人們的關(guān)注。本研究運(yùn)用3種激光不同輻照時(shí)間輻照燈盞花組織培養(yǎng)苗，并對(duì)輻照后燈盞花抗性指標(biāo)作了系統(tǒng)的測(cè)定，從而找出最佳激光類型和不同激光的最佳處理劑量，以期最終能把激光技術(shù)應(yīng)用于燈盞花的快速繁殖和大量生產(chǎn)。

1材料與方法

11材料

燈盞花無(wú)菌培養(yǎng)苗、葉片、 愈傷組織及芽來(lái)自于紅河學(xué)院組培室，培養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃，光照時(shí)間16 h/d，光照度1 500～3 000 lx。

12方法

121激光器輻照技術(shù)

激光器光源與反光鏡相距50 cm，反光鏡反射點(diǎn)與材料放置點(diǎn)相距50 cm，He-Ne激光器電流調(diào)節(jié)為06 mA，CO2激光器電流調(diào)節(jié)為01 mA。He-Ne激光光束到達(dá)材料放置點(diǎn)時(shí)的功率約為16 mW，半導(dǎo)體激光器光束到達(dá)材料放置點(diǎn)的功率約236 mW，CO2激光器功率相對(duì)要高，為18～23 mW。3種激光輻照時(shí)間為30、60、120、180 s。具體操作見(jiàn)圖1。

122方法燈盞花組培苗的培養(yǎng)配方參照文獻(xiàn)[19-20]。選取經(jīng)過(guò)He-Ne激光、半導(dǎo)體激光、CO2激光輻照30、60、120、180 s后的幼嫩燈盞花葉片，以備測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

123相關(guān)抗性指標(biāo)的測(cè)量[21-23]超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用H2O2反應(yīng)比色法，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法。脯氨酸含量的測(cè)定采用磺基水楊酸方法進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

21激光輻照對(duì)燈盞花過(guò)氧化物酶活性的影響

通過(guò)3種激光不同時(shí)間輻照后，過(guò)氧化物酶活性都有不同程度的變化。在He-Ne激光處理中，過(guò)氧化物酶的活性在120 s時(shí)達(dá)到最大值，為025 U/g，當(dāng)超過(guò)120 s后明顯降低；在半導(dǎo)體激光處理中，120 s也達(dá)到最大值，為016 U/g；在CO2激光處理中，60 s時(shí)達(dá)最大值，為0345 U/g。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種不同類型激光輻照后，經(jīng)過(guò)不同輻照時(shí)間，以CO2激光效果最好，在較短輻照時(shí)間內(nèi)活性達(dá)到最大值（圖2）。

22不同激光對(duì)燈盞花過(guò)氧化氫酶活性的影響

通過(guò)3種激光不同時(shí)間輻照后，過(guò)氧化氫酶活性有不同程度的變化。在He-Ne激光處理中，輻照180 s過(guò)氧化氫酶活性最高，為0017 mg/（g·min），其次是60 s處理，不同處理均高于對(duì)照；半導(dǎo)體激光處理中，輻照60 s的過(guò)氧化氫酶活性較高，為0008 mg/（g·min）；在CO2激光處理中，輻照60 s過(guò)氧化氫酶活性最高，為0024 mg/（g·min），其余各組酶活性相對(duì)要低（圖3）。

[FK（W11][TPLLF3tif][FK）]

23激光輻照對(duì)燈盞花丙二醛含量的影響

用3種激光不同時(shí)間輻照燈盞花幼嫩葉片后，測(cè)定其丙二醛含量。在He-Ne激光處理中，輻照60 s丙二醛含量最低，為4955 μmol/g；半導(dǎo)體激光處理中，120 s的處理丙二醛含量最低，為524 μmol/g，輻照180 s處理組含量最高，為8738 μmol/g；CO2激光處理中，輻照180 s的處理丙二醛含量最低，為4422 μmol/g，輻照120 s丙二醛含量最高，為10133 μmol/g（圖4）。

24激光輻照對(duì)燈盞花超氧化物歧化酶活性的影響

經(jīng)過(guò)3種激光不同時(shí)間輻照后，在He-Ne激光處理中，輻照180 s處理超氧化物歧化酶活性高于對(duì)照，為 176465 U/g，其他各組則低于對(duì)照；在半導(dǎo)體激光處理中，輻照120 s處理SOD活性最高，為196692 U/g；CO2激光處理中，輻照60 s處理SOD活性最高，為20788 U/g，其他各組SOD活性都高于對(duì)照。這3種激光中，以CO2激光處理效果最好（圖5）。

25激光輻照對(duì)燈盞花脯氨酸含量的影響

測(cè)定經(jīng)He-Ne激光、半導(dǎo)體激光、CO2激光輻照后的燈盞花幼嫩葉片脯氨酸含量，結(jié)果表明，He-Ne激光輻照60 s脯氨酸含量最高，為9624 μg/g；半導(dǎo)體激光處理中，輻照 30 s 處理脯氨酸含量最高，為9498 μg/g，其次是120 s處理；CO2激光處理中，輻照60 s處理脯氨酸含量最高，為7878 μg/g，其次是輻照180 s的處理。3種激光不同處理時(shí)間脯氨酸含量均有所提高，其中He-Ne激光、半導(dǎo)體激光更有利脯氨酸含量的提高（圖6）。

26激光輻照對(duì)燈盞花可溶性糖含量的影響

測(cè)定3種激光不同處理時(shí)間后的燈盞花葉片可溶性糖含量，結(jié)果表明，在He-Ne激光輻照中，可溶性糖含量表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，輻照120 s可溶性糖含量最低，為0091%；在半導(dǎo)體激光中，可溶性糖含量也表現(xiàn)出隨輻照時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)，輻照180 s處理最低，為0108%；CO2激光處理中，短時(shí)間內(nèi)可溶性糖含量急劇下降，輻照180 s時(shí)最低，為 0045%。這3種激光輻照后的燈盞花葉片可溶性糖含量總體表現(xiàn)出隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì)（圖7）。

27激光輻照對(duì)燈盞花可溶性蛋白含量的影響

測(cè)定3種激光輻照不同時(shí)間的燈盞花葉片可溶性蛋白含量結(jié)果（圖8）表明，He-Ne激光處理中，輻照120 s處理可溶性蛋白含量最高，為2182 mg/g，輻照180 s處理低于對(duì)照組；在半導(dǎo)體激光中，30 s處理可溶性蛋白含量最高，為 2467 mg/g，輻照60 s時(shí)最低，隨后有升高趨勢(shì)；在CO2激光中，可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為隨著輻照時(shí)間延長(zhǎng)而升高的趨勢(shì)，輻照120 s時(shí)最高，為22 mg/g。3種激光不同時(shí)間處理后，可溶性蛋白含量總體均有提高，其中半導(dǎo)體激光作用效果較明顯。

3討論

本試驗(yàn)將燈盞花組織培養(yǎng)技術(shù)與激光輻照相結(jié)合，對(duì)激光輻照對(duì)燈盞花組織培養(yǎng)的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從而找出不同類型激光處理燈盞花種子的最佳劑量，研究結(jié)果表明，He-Ne激光、半導(dǎo)體激光、CO2激光的輻照均促進(jìn)燈盞花種子萌發(fā)，其中CO2激光、半導(dǎo)體激光以30 s為最佳輻照時(shí)間，He-Ne激光則以60 s輻照時(shí)間為最佳，3種激光中，CO2激光的作用效果最為明顯。

激光照射后組織內(nèi)的各種酶活性均有提高現(xiàn)象，特別是He-Ne激光、CO2激光，葉片組織中與抗逆性相關(guān)的有機(jī)物成分也相對(duì)提高，同時(shí)，在測(cè)定各種指標(biāo)的過(guò)程中，出現(xiàn)有相矛盾的結(jié)果，如CO2激光處理60 s的酶活性相對(duì)較高，但測(cè)定丙二醛含量卻高于對(duì)照等，原因可能是取材與試驗(yàn)誤差所致，在測(cè)定可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量時(shí)，可溶性糖含量總體表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，He-Ne激光處理180 s的可溶性蛋白含量低于對(duì)照，這可能是植物種類、取材部位不同，從而導(dǎo)致與相關(guān)研究結(jié)果相反。總之，適當(dāng)劑量的激光輻照對(duì)燈盞花各種生理指標(biāo)有促進(jìn)作用，提高各種抗氧化酶活性，促進(jìn)各種滲透調(diào)節(jié)有機(jī)物質(zhì)的合成，從而增強(qiáng)燈盞花的抗逆性。而超過(guò)一定劑量的處理，對(duì)燈盞花生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，反而會(huì)起到抑制作用。

參考文獻(xiàn)：[HJ165mm]

中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì) 中國(guó)植物志[M]北京：科學(xué)出版社，1985：308

黎光南 云南中藥志[M]昆明：云南科技出版社，1990：275-276

[3]李菁，于德泉 燈盞花化學(xué)成分研究[J] 中國(guó)中藥雜志，2011，36（11）：1458-1462

[4]李鸝，黨承林 燈盞花種子的萌發(fā)特性[J] 中藥材，2005，28（11）：975-976

[5]許素蓮，樸鐵夫 激光在生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用研究進(jìn)展[J] 激光雜志，2007，28（3）：213-214

[6]Tevini M，Iwanzik W，Thoma U Some effects of enhanced UV-B irradiation on the growth and composition of plants[J] Planta，1981，153（4）：388-394

[7]郝金花，馬曉麗，王小花，等 He-Ne激光對(duì)UV-B輻射小麥幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響[J] 武漢植物學(xué)研究，2007，25（4）：350-355

[8]梁宏，陸仲康，張雪琴，等 氦分子激光對(duì)雄性小家鼠生殖細(xì)胞染色體畸變率的影響[J] 遺傳，1980，2（2）：27-28

[9]朱新軍，岳明 激光對(duì)植物的作用及其機(jī)理[J] 科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2006，16（4）：182-183

[10]陳環(huán)軍，吳俊林 激光處理生物種子產(chǎn)生的效應(yīng)概述[J] 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（3）：587-589

[11]張建東，陳怡平，王勛陵 CO2激光處理對(duì)大豆種子萌發(fā)及生理的影響[J] 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（2）：221-225

[12]韓榕，王勛陵，岳明 He-Ne激光對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射損傷小麥DNA非按期合成的影響[J] 作物學(xué)報(bào)，2003，29（4）：633-636

[13]薛慧君，岳明，王亞洲 CO2激光對(duì)大葉龍膽種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響[J] 中草藥，2004，35（3）：324-327

[14]馮璐，那日 植物育種的物理學(xué)方法[J] 草業(yè)科學(xué)，2005，12（22）：63-66

[15]林麗飛，唐寶林，羅冰，等 He-Ne激光輻照對(duì)燈盞花組培體系的影響[J] 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，43（7）：207-212

[16]張舉成，張黎黎，李河，等 He-Ne和CO2激光對(duì)燈盞花種子影響的研究[J] 光電子·激光，2012，5（23）：1011-1015

[17]張美萍，陜永杰，王小花，等 He-Ne激光對(duì)增強(qiáng)紫外線-B輻射小麥葉片胞質(zhì)ATP酶活性的影響[J] 中國(guó)激光，2009，36（9）：2455-2459

[18]姜曉燕，高麗美，李永峰，等 He-Ne 激光對(duì)增強(qiáng) UV-B 輻射擬南芥抗氧化系統(tǒng)的損傷修復(fù)[J] 光子學(xué)報(bào)，2011，40（5）：712-717

[19]林麗飛，夏瑞娥，劉春國(guó)，等 不同因素對(duì)短葶飛蓬愈傷組織的影響[J] 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：52-54

[20]林麗飛，李紹梅，劉春國(guó)，等 重金屬鉻、銀對(duì)短葶飛蓬愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J] 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：48-50

[21]高俊鳳 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]北京：高等教育出版社，2006：143-156

[22]李合生 現(xiàn)代植物生理學(xué)[M]北京：高等教育出版社，2002：333-359

[23]陳婧，李建平，李榮 人工老化處理對(duì)糯玉米種子生理生化特性的影響[J] 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（6）：857-862