趙李婧　曹新文　李永梅

摘要：分析橡膠草HMGR基因的表達(dá)情況，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21菌株并誘導(dǎo)表達(dá)。構(gòu)建細(xì)胞融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化GV3101菌株并侵染洋蔥表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察基因表達(dá)情況。構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體并侵染煙草，利用紫外分光光度法檢測(cè)三萜含量的變化。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE檢測(cè)，獲得分子量為62659 1 ku的蛋白，與預(yù)期蛋白相符合，且37 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)最明顯；通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，該基因主要在細(xì)胞膜上表達(dá)；紫外可見(jiàn)分光光度法表明轉(zhuǎn)基因煙草中三萜的含量高于空白煙草。橡膠草HMGR基因分別在大腸桿菌、洋蔥鱗片內(nèi)表皮和煙草中成功表達(dá)。

關(guān)鍵詞：橡膠草；HMGR基因；原核表達(dá)；亞細(xì)胞定位；總?cè)铺崛∥?/p>

中圖分類號(hào)： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0042-04

收稿日期：2016-03-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31360060）。

作者簡(jiǎn)介：趙李婧（1989—），女，山西晉城人，碩士研究生，主要從事植物基因工程的研究。E-mail：851409674@qqcom。

通信作者：閆潔，博士，副教授，主要從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)教學(xué)和科研工作。E-mail：1653842328@qqcom。

天然橡膠的生物合成是通過(guò)產(chǎn)膠植物體內(nèi)的異戊二烯代謝途徑完成的，而3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMGR）基因及其啟動(dòng)子是該代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶基因，它控制著碳流的流向和代謝反應(yīng)速率，也是萜類化合物代謝調(diào)控的重要位點(diǎn)。目前，已經(jīng)從橡膠樹(shù)、水稻、甘草、皂苷、陽(yáng)春砂、三七、雷公藤、擬南芥、番茄、杜仲等植物中克隆得到了該酶的基因及其啟動(dòng)子，它們以基因家族的形式存在并控制著代謝途徑中產(chǎn)物的合成[2-11]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGR基因在萜類化合物合成中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，例如轉(zhuǎn)擬南芥[WTBX][STBX]HMGR1[WTBZ][STBZ]基因的番茄中植物淄醇含量增加到24倍[12]。煙草已具備了成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，是研究基因功能的理想模式植物。從橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）中克隆得到的HMGR基因是橡膠產(chǎn)膠代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶基因，為了進(jìn)一步研究橡膠草的HMGR基因功能，本研究構(gòu)建了HMGR基因的原核表達(dá)載體和植物過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DE3大腸菌株、在洋蔥鱗片葉表皮瞬時(shí)表達(dá)，并通過(guò)農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，以便進(jìn)一步研究該基因在異戊二烯代謝途徑中的功能，并為研究產(chǎn)膠代謝調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。采用基因工程的方法，對(duì)橡膠草HMGR基因的原核表達(dá)、亞細(xì)胞定位和真核表達(dá)進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步揭示基因的功能和為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111材料

橡膠草植株，于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖旁邊，后移栽至實(shí)驗(yàn)室栽培室進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)；“NC89”野生型煙草，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；新鮮生長(zhǎng)良好的洋蔥，購(gòu)自石河子蔬菜市場(chǎng)。

112菌株、質(zhì)粒及試劑

大腸桿菌Top10、農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS、細(xì)胞融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。植物總RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；SuperRT cDNA Kit，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Blue Plus Ⅲ Protein Marker，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物均由華大基因合成，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

113儀器

冷凍干燥機(jī)LGJ-10C、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、激光共聚焦顯微鏡IN Cell Analyzer 3000，均購(gòu)自上海分析儀器廠。

12試驗(yàn)方法

121原核表達(dá)載體的構(gòu)建

為了研究該基因的蛋白表達(dá)情況，構(gòu)建了原核表達(dá)載體。將PET-30a質(zhì)粒和pGEMT-T-HMGR 質(zhì)粒分別用BamHⅠ和SalⅡ進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20 μL，7 μL質(zhì)粒、2 μL 10×T buffer、BamHⅠ和SalⅡ各 1 μL，然后加無(wú)菌水至20 μL，將反應(yīng)體系置于37 ℃水浴中酶切4 h，4 h后跑核酸電泳檢測(cè)。切膠回收PET-30a（+）載體片段和TkHMGR基因片段，將回收的片段用T4 DNA連接酶連接，連接體系為10 μL，PET-30a（+）和TkHMGR各 4 μL、1 μL 10×Loading buffer、1 μL T4 DNA連接酶，反應(yīng)體系置于4 ℃水浴過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，在添加了卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上挑取重組質(zhì)粒，通過(guò)PCR反應(yīng)和雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，取pGEMT-T-HMGR質(zhì)粒為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，以加雙蒸水為模板作為陰性對(duì)照。成功構(gòu)建的載體命名為PET-30a-TkHMGR，將測(cè)序正確的質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化BL21（DE3）。

122重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

將轉(zhuǎn)化成功的BL21（DE3）-PET-30a-TkHMGR接種到50 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后吸取05 mL到50 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)使其D600 nm值達(dá)到04時(shí)（大約2 h），加異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）使其終濃度為05 mmol/mL，以不加IPTG和轉(zhuǎn)BL21（DE3）-PET-30a質(zhì)粒的菌液為對(duì)照，于37 ℃、220 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h取2 mL菌液于離心管中，4 ℃、6 000 r/min 離心10 min收集沉淀，然后在沉淀中加入 025 mL 冰浴的磷酸鹽緩沖液充分混勻沉淀，再向其中加入0025 mL 5×SDS-PAGE電泳緩沖液，充分混勻后放置 5 min，在 100 ℃ 水浴中煮沸5 min，使蛋白變性后冷卻至室溫，12 000 r/min 離心10 min，取上清液即為誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白。endprint

123植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和綠色熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)載體的構(gòu)建

為了研究該基因的功能和亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體和GFP融合表達(dá)載體。以橡膠草cDNA為模板，qHMGR上（XbaⅠ）和qHMGE下（SalⅡ）、HMGR-GFP上（BamHⅠ）和HMGR-GFP下（XbalⅡ）分別為引物克隆了TkHMGR基因和去終止子的TkHMGR基因，回收目的片段與克隆載體pGEM-T Easy Voctor連接，構(gòu)建pGEM-T-TkHNGR和pGEM-T-TkHNGR（去終止子）。分別用XbaⅠ和SalⅡ雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-TkHMGR和pCAMBIA2300-35S-OCS，用BamHⅠ和XbalⅡ雙酶切pGEM-T-TkHNGR（去終止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，獲得目的基因片段和載體大片段。將大小片段進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，Kan篩選融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS和pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS。用電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定。進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，取pGEMT-T-HMGR質(zhì)粒為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，以加雙蒸水為模板作為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增所用的引物及引物序列如表1所示。

124洋蔥表皮細(xì)胞的侵染、培養(yǎng)和GFP觀察

選取新鮮的生長(zhǎng)良好的洋蔥，將鱗莖在75%乙醇中浸泡10 min，用無(wú)菌水沖洗3～4次，再用無(wú)菌解剖刀取1 cm×1 cm×1 cm的球莖內(nèi)表皮，貼近葉肉的一面朝下平鋪于1/2 MS固體培養(yǎng)基中，28 ℃暗培養(yǎng)4 h，將預(yù)培養(yǎng)的洋蔥方塊用含有pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液侵染25 min，用濾紙吸干表面的菌液，轉(zhuǎn)入1/2 MS固體培養(yǎng)基中25 ℃光照培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)好的洋蔥鱗片用干凈的MS液體洗滌，以除去附著的農(nóng)桿菌，把1 cm×1 cm×1 cm的鱗片做成裝片，用激光共聚焦顯微鏡于488 nm波長(zhǎng)下觀察熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。

125煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

通過(guò)葉盤轉(zhuǎn)化法將含有質(zhì)粒pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化“NC89”的野生型煙草。提取轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS質(zhì)粒煙草的DNA，以上游引物BamHⅠ和下游引物SalⅡ進(jìn)行PCR鑒定，提取煙草的RNA，以HMGR定上和HMGR定下為上游、下游引物進(jìn)行RT-PCR鑒定。所用引物序列如表1所示。

126轉(zhuǎn)基因煙草中三萜類化合物含量的測(cè)定

1261三萜的提取方法

分別取100 mg 60 ℃干燥的野生型和轉(zhuǎn)基因的煙草材料，精確稱量后置于10 mL離心管中，加入3 mL 95%乙醇于50 ℃提取（提取3次），將提取液合并轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，8 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中，50 ℃真空干燥；用3 mL蒸餾水溶解干粉，再用同體積的三氯甲烷抽提，轉(zhuǎn)移三氯甲烷相，在三氯甲烷相中加飽和的NaHCO3溶液，抽提轉(zhuǎn)移上層NaHCO3相于新的離心管中，緩慢加入濃鹽酸使pH值低于30；加同體積的三氯甲烷抽提，取三氯甲烷相轉(zhuǎn)移至新管，真空冷凍干燥，用3 mL甲醇溶解，測(cè)定其D560 nm。

1262制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取12 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，定容后分別吸取01、02、03、04、05、06 mL于試管中，加無(wú)水乙醇補(bǔ)足1 mL，空白對(duì)照加1 mL無(wú)水乙醇，所有試管于沸水中水浴直至溶劑揮發(fā)完；然后在試管中加04 mL 5%香草醛冰乙酸、16 mL高氯酸，迅速混勻；將試管于70 ℃水浴中放置15 min，取出冷卻至室溫，加8 mL乙酸乙酯迅速混勻，測(cè)定其D560 nm，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

21原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

pGEMT-T-TkHMGR和PET-30a質(zhì)粒用BamHⅠ和SalⅡ進(jìn)行雙酶切，成功構(gòu)建了載體PET-30a-TkHMGR，電擊轉(zhuǎn)化BL21（DE3）細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定。由圖1可知，TkHMGR基因成功地連接到了PET-30a表達(dá)載體上，說(shuō)明成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體。

22SDS-PAGE分析

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后提取大腸桿菌菌體總蛋白，將提取的蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，分子量約為62659 1 ku的蛋白表達(dá)量隨之增加，在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值。由圖2可知，TkHMGR基因在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)。

23細(xì)胞融合表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

將重組質(zhì)粒pGEMT-T-TkHMGR（去終止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS質(zhì)粒用BamHⅠ和XbalⅡ進(jìn)行雙酶切，成功構(gòu)建了植物融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞，挑[CM（25]取陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，由圖

可知，TkHMGR基因成功地連接到pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS表達(dá)載體上，圖3-b說(shuō)明成功構(gòu)建了細(xì)胞融合表達(dá)載體。

24TkHMGR蛋白亞細(xì)胞定位分析

為了研究TkHMGR蛋白的亞細(xì)胞定位情況，取轉(zhuǎn)基因的洋蔥鱗片內(nèi)表皮制作壓片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。由圖4可知，TkHMGR融合蛋白主要在膜上表達(dá)，而35S-GFP對(duì)照在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)均有綠色熒光。由此推測(cè)，TkHMGR蛋白可能主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜上表達(dá)，這與王啟超等通過(guò)Psort程序（http：//psortnibbacjp）分析預(yù)測(cè)的結(jié)果相符合。endprint

25標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以齊墩果酸反應(yīng)體系的吸光度為橫坐標(biāo)、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的含量為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），得回歸方程y=20688x+0181，r2=0999 1。

26轉(zhuǎn)基因煙草中總?cè)坪康臏y(cè)定

由圖6可知，煙草中轉(zhuǎn)Hb-HMGR基因的三萜類化合物含量略高于轉(zhuǎn)35S-基因，而兩者的三萜類化合物含量都明顯高于空白煙草。

3討論與結(jié)論

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A基因是一類龐大的基因家族，在植物體異戊二烯代謝途徑中扮演著重要的角色，是代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶。研究該基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位能為蛋白質(zhì)功能的研究提供重要的信息，關(guān)于該基因的亞細(xì)胞定位目前還未見(jiàn)報(bào)道，只有王啟超等預(yù)測(cè)了該基因主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜。試驗(yàn)結(jié)果表明，該基因主要在膜上表達(dá)，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。對(duì)HMGR基因進(jìn)行原核表達(dá)分析，結(jié)果表明該基因可以成功地在大腸桿菌中表達(dá)，并得到了相應(yīng)的蛋白。

目前為止，關(guān)于HMGR基因調(diào)控萜類物質(zhì)代謝的研究已有很多，關(guān)于橡膠草HMGR基因在萜類物質(zhì)代謝中作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究使大量HMGR蛋白在煙草中積累，對(duì)煙草中三萜含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)煙草葉中的三萜含量顯著提高。大量研究表明，在煙草中過(guò)量表達(dá)陽(yáng)春砂的HMGR基因可以有效地促進(jìn)甾醇的生物合成[14]。Chappell等在研究中發(fā)現(xiàn)，HMGR的活性提高可以誘導(dǎo)倍半萜環(huán)化酶的活性，進(jìn)而提高了倍半萜的產(chǎn)量[15]。武瑩利用殼聚糖誘導(dǎo)雷公藤葉懸浮細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3種萜類代謝物含量提高，HMGR基因表達(dá)水平也相應(yīng)提高，表明HMGR基因?qū)祁愇镔|(zhì)的合成具有正調(diào)控作用[16]。目前研究表明，HMGR基因的表達(dá)可能控制著甲羥戊酸代謝、碳流的流向和萜類物質(zhì)的合成[17]，為進(jìn)一步研究橡膠草HMGR基因調(diào)控產(chǎn)膠代謝機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究采用基因工程的方法，分別從原核表達(dá)、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)基因煙草3個(gè)方面對(duì)橡膠草HMGR基因進(jìn)行了分析。原核表達(dá)分析結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為62659 1 ku；通過(guò)構(gòu)建該基因的瞬時(shí)表達(dá)載體，運(yùn)用葉盤轉(zhuǎn)化法侵染洋蔥表皮細(xì)胞對(duì)該基因編碼的蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，表明該基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞膜和核膜上，與生物信息學(xué)分析結(jié)果相一致；轉(zhuǎn)基因煙草的試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)基因工程的方法可以控制煙草中萜類化合物的合成，從而提高煙草中總?cè)频暮浚瑸檠芯恐参锂愇於┐x途徑次生代謝產(chǎn)物的合成打下了基礎(chǔ)。

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