邢丹 馬銘鴻 吳航伸 孫海瓊 王玨玉 汪春蕾 趙敏

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

CotA漆酶的固定化及其對(duì)溴麝香草酚藍(lán)脫色的效果1)

邢丹 馬銘鴻 吳航伸 孫海瓊 王玨玉 汪春蕾 趙敏

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

將林地土壤中分離的枯草芽孢桿菌中克隆的CotA漆酶基因，在畢赤酵母菌中進(jìn)行表達(dá)；以海藻酸鈣為載體，采用包埋法固定畢赤酵母菌表達(dá)的CotA漆酶，固定化效率為32.2%，正交試驗(yàn)優(yōu)化后的固定化效率比優(yōu)化前提高了30.1%。優(yōu)化了游離CotA漆酶及固定化CotA漆酶對(duì)溴麝香草酚藍(lán)的脫色條件，在30 min內(nèi)，固定化CotA漆酶在70 ℃、pH為8.0時(shí)，游離CotA漆酶在60 ℃、pH為7.6時(shí)，對(duì)溴麝香草酚藍(lán)溶液的脫色率最高，分別達(dá)到76.81%和67.12%，說明固定化CotA漆酶比游離CotA漆酶在較高溫度和堿性條件下活性更高。

CotA漆酶；溴麝香草酚藍(lán)；染料脫色

溴麝香草酚藍(lán)(BTB)是結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定的雜環(huán)類染料[1-2]，應(yīng)用于植物性別鑒定[3]、食品中鉛的檢測[4]、種子生活力的檢測[5]等方面，并作為生物反應(yīng)的指示劑而被大量使用。染料不僅對(duì)水體的溶氧度和可視度造成影響，還會(huì)被降解成聯(lián)苯胺等致癌物質(zhì)，因此印染廢水的處理備受關(guān)注[6-8]。漆酶能夠使多種染料脫色，與介體聯(lián)用或與固定化酶技術(shù)相結(jié)合，使其應(yīng)用范圍更廣[9-10]。真菌漆酶廣泛應(yīng)用于染料脫色，但大多數(shù)真菌漆酶只在酸性條件下具有活性，且熱穩(wěn)定性較差[11]。而一般工業(yè)印染廢水具有高溫、高pH和高鹽等特點(diǎn)[12]，真菌漆酶在處理工業(yè)印染廢水時(shí)容易失活，而不能起到很好的作用。與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶具有熱穩(wěn)定性好及耐堿性等優(yōu)點(diǎn)，在印染廢水處理領(lǐng)域比真菌漆酶具有更好的應(yīng)用優(yōu)勢[13]。

固定化酶技術(shù)是指通過物理或者化學(xué)方法，將酶固定在載體上，使酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)，且適應(yīng)條件更廣，同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了酶的循環(huán)利用，節(jié)約了成本[14]。海藻酸鈉是一種線性的天然生物大分子，具有生物可降解性、生物相容性及生物黏附性，廣泛地應(yīng)用于酶及細(xì)胞的固定化研究中。本研究利用海藻酸鈉和氯化鈣形成的海藻酸鈣固定CotA漆酶，優(yōu)化固定條件，并利用游離的和固定化的CotA漆酶，分別對(duì)溴麝香草酚藍(lán)(BTB)溶液進(jìn)行脫色，探究二者的最佳固定條件，為印染廢水的處理提供參考。

1 材料與方法

菌種及試劑：含有CotA漆酶基因的畢赤酵母(Pichiapastoris)LS02-CotA，其CotA漆酶基因來源于涼水國家自然保護(hù)區(qū)的土壤中分離出的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WD23菌株。2-2-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡稱ABTS)為Sigma公司產(chǎn)品，溴麝香草酚藍(lán)為北京市旭東化工廠產(chǎn)品，CaCl2和海藻酸鈉為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，其他常規(guī)試劑均為分析純。培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[15]。

異源表達(dá)CotA漆酶的制備：參照文獻(xiàn)[16]的方法制備芽孢粗酶液，CotA漆酶由畢赤酵母LS02-CotA分泌表達(dá)到培養(yǎng)基中，通過制備菌株的懸液得到具有漆酶活性的粗酶液。然后，按照參照文獻(xiàn)[17]的方法測定漆酶酶活，1個(gè)漆酶活力(U)定義為，在1 min內(nèi)氧化1 μmol底物所需要的酶量。ABTS的消光系數(shù)為36 000 L·mol-1·cm-1。

固定化CotA漆酶的制備：將15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的海藻酸鈉溶液與酶活性濃度為1 800 U/L的CotA漆酶液充分混合均勻后，用注射器緩慢地將混合液體均勻的滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CaCl2溶液中，同時(shí)利用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，立即有凝膠狀小球生成；攪拌30 min，然后將小球?yàn)V出，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的氯化鈉溶液洗滌3次，再用蒸餾水沖洗2次，用吸水紙吸干表面水分，稱質(zhì)量[17-18]。固定化CotA漆酶的酶活力測定方法參照文獻(xiàn)[19]，利用漆酶固定化前后的酶活力變化計(jì)算固定化效率。

CotA漆酶固定化的單因素試驗(yàn)：選用海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～3.0%、CaCl2溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～5%、CotA漆酶的酶活性濃度為100～400 U/L、固定化時(shí)間15～90 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)CotA漆酶固定化后相對(duì)酶活力的影響。以上操作均重復(fù)3次，取平均值。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交表，以海藻酸鈉(A)、CaCl2(B)、CotA漆酶(C)、固定化時(shí)間(D)作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)(見表1)。

表1 CotA漆酶固定化正交試驗(yàn)的因素和水平

脫色體系的pH對(duì)溴麝香草酚藍(lán)溶液脫色試驗(yàn)：配制pH=6.4～8.8的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，游離的CotA漆酶和固定化CotA漆酶的酶活性濃度均為200 U/L，BTB(用乙醇溶解)溶液的終質(zhì)量濃度為50 mg/L，脫色體系為10 mL，設(shè)不加CotA漆酶的空白對(duì)照。脫色反應(yīng)體系置于50 ℃的電熱恒溫水浴鍋箱中脫色30 min，在618 nm處測定吸光值，計(jì)算染料脫色率；脫色率=(A0-A)/A0，A0為染料的初始吸光度，A為染料被漆酶脫色后的吸光度。重復(fù)3次取平均值。

CotA漆酶酶活性濃度對(duì)溴麝香草酚藍(lán)溶液脫色試驗(yàn)：CotA漆酶酶活性濃度為50～350 U/L，游離CotA漆酶的脫色pH為7.6，固定化CotA漆酶的脫色pH為8.0，BTB(用乙醇溶解)溶液的終質(zhì)量濃度為50 mg/L，脫色體系為10 mL，設(shè)不加CotA漆酶的空白對(duì)照。脫色反應(yīng)體系置于50 ℃的電熱恒溫水浴鍋箱中脫色30 min，在618 nm處測定吸光值，計(jì)算染料脫色率。重復(fù)3次取平均值。

溫度對(duì)溴麝香草酚藍(lán)溶液脫色試驗(yàn)：反應(yīng)體系分別放在40～90 ℃的電熱恒溫水浴鍋中進(jìn)行脫色，游離的CotA漆酶和固定化CotA漆酶的酶活性濃度均為300 U/L。游離CotA漆酶的脫色pH為7.6，固定化CotA漆酶的脫色pH為8.0，BTB(用乙醇溶解)溶液的終質(zhì)量濃度為50 mg/L，脫色體系為10 mL，設(shè)不加CotA漆酶的空白對(duì)照。脫色30 min，在618 nm處測定吸光值，計(jì)算染料脫色率。重復(fù)3次取平均值。

時(shí)間對(duì)溴麝香草酚藍(lán)溶液脫色試驗(yàn)：游離CotA漆酶的脫色溫度為60 ℃，固定化CotA漆酶的脫色溫度為70 ℃，游離CotA漆酶的脫色pH為7.6，固定化CotA漆酶的脫色pH為8.0，游離的CotA漆酶和固定化CotA漆酶的酶活性濃度均為300 U/L，BTB(用乙醇溶解)溶液的終質(zhì)量濃度為50 mg/L，脫色體系為10 mL，設(shè)不加CotA漆酶的空白對(duì)照。脫色4 h，每0.5 h取樣在618 nm處測定吸光值，計(jì)算染料脫色率。重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 CotA漆酶固定化效率

用于固定化的CotA漆酶的酶活性濃度為1 800 U/L，固定化后CotA漆酶的酶活性濃度為580.2 U/L，因此，用常規(guī)的固定化方法計(jì)算，CotA漆酶固定化的效率為32.2%。

2.2 固定化參數(shù)對(duì)CotA漆酶活力的影響

2.2.1 單因素試驗(yàn)分析

在CaCl2溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、固定化時(shí)間30 min、CotA漆酶的酶活性濃度300 U/L的條件下，不同海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)CotA漆酶固定化后相對(duì)酶活力的影響見圖1A。海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5%～2.5%范圍內(nèi)，固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力較高；海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%時(shí)，CotA漆酶的相對(duì)酶活力達(dá)到最大值。海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，制備的固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度差，固定效果不佳，在洗滌固定化酶時(shí)的損失比較大；海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，溶液黏度變大，影響酶與底物的充分結(jié)合[20]。

在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、固定化時(shí)間30 min、CotA漆酶的酶活性濃度300 U/L的條件下，不同CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)CotA漆酶固定化后相對(duì)酶活力的影響見圖1B。CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%～4%范圍內(nèi)，固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力較高；CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%時(shí)，固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力達(dá)最大值。CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，致使固定化酶的強(qiáng)度減弱，形成的凝膠網(wǎng)狀孔徑比較大，截留住的酶比較少，使得載體內(nèi)部包埋的酶外流；CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，海藻酸鈉與Ca2+形成的凝膠表面會(huì)布滿Ca2+，使網(wǎng)狀孔徑過小，在酶促反應(yīng)時(shí)，底物擴(kuò)散阻力增加，降低了固定化酶的活性[21]。

圖1 不同條件時(shí)固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力

在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、CaCl2溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、固定化時(shí)間30 min的條件下，不同游離CotA漆酶酶活性濃度對(duì)CotA漆酶固定化后相對(duì)酶活力的影響見圖1C。游離CotA漆酶酶活性濃度在250～350 U/L范圍內(nèi)，固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力較高；游離CotA漆酶酶活性濃度在300 U/L時(shí)，固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力達(dá)最大值。當(dāng)游離CotA漆酶酶活性濃度較低時(shí)，大部分酶能夠吸附到海藻酸鈣凝膠上，但是由于達(dá)不到飽和而使固定化CotA漆酶活力不高；當(dāng)游離CotA漆酶酶活性濃度超過300 U/L之后，固定化CotA漆酶活力開始降低，這是由于過量的酶在達(dá)到飽和后與載體發(fā)生反應(yīng)或是改變了酶的活性中心，從而降低了固定化酶的活性[22]。

在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、CaCl2溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、CotA漆酶的酶活性濃度300 U/L的條件下，不同固定化時(shí)間對(duì)CotA漆酶固定化后相對(duì)酶活力的影響見圖1D。固定化時(shí)間在30～60 min內(nèi)，固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力較高；固定時(shí)間在45 min時(shí)，固定化CotA漆酶的相對(duì)酶活力達(dá)最大值。固定化時(shí)間過短，CotA漆酶沒有被牢固地固定在小球內(nèi)，用蒸餾水清洗時(shí)會(huì)泄露；固定化時(shí)間過長，海藻酸鈣交聯(lián)程度高，結(jié)構(gòu)較致密，底物擴(kuò)散阻力增加，導(dǎo)致CotA漆酶活性降低[23]。

2.2.2 正交試驗(yàn)分析

正交試驗(yàn)1～9組試驗(yàn)中，固定化CotA漆酶酶活性濃度分別為52.9、125.8、63.7、111.0、61.3、79.6、100.8、63.7、72.1 U/L。由表2可見：各因素對(duì)CotA漆酶固定化后，對(duì)固定化CotA漆酶酶活性濃度影響程度從大到小的因素，依次為：固定化時(shí)間、CotA漆酶酶活性濃度、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最適固定化條件為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、CotA漆酶酶活性濃度300 U/L、固定化時(shí)間45 min，在此條件下固定化CotA漆酶的酶活性濃度達(dá)125.8 U/L、固定化效率為41.9%，比優(yōu)化前的固定化效率提高了30.1%。

表2 CotA漆酶固定化正交試驗(yàn)酶活性濃度的極差分析

U·L-1

2.3 不同CotA漆酶對(duì)溴麝香草酚藍(lán)脫色率的影響

游離CotA漆酶在pH為7.6時(shí)，對(duì)BTB脫色率最高，為67.12%；固定化CotA漆酶在pH為8.0時(shí)，脫色率最高，為76.81%(見圖2A)。在堿性較高的條件下，固定化CotA漆酶比游離CotA漆酶對(duì)染料脫色的效果好，是游離CotA漆酶直接與堿性溶液接觸，破壞了酶的結(jié)構(gòu)致，使酶活力降低；而固定化漆酶，由于包埋在海藻酸鈣中，在一定程度上受到了保護(hù)。游離與固定化CotA漆酶對(duì)BTB的脫色率，均在CotA漆酶酶活性濃度為300U/L時(shí)，達(dá)到最大值(見圖2B)。游離和固定化CotA漆酶的最適脫色溫度分別為60、70 ℃；在70～90 ℃條件下，固定化CotA漆酶對(duì)BTB的脫色率較高(見圖2C)，表明固定化漆酶的熱穩(wěn)定性更好。脫色3 h內(nèi)，游離CotA漆酶對(duì)BTB的脫色效果稍好；3 h后，固定化CotA漆酶脫色率較高(見圖2D)。

3 結(jié)論與討論

本研究畢赤酵母菌表達(dá)的固定化CotA漆酶，在pH為8.0時(shí)，對(duì)溴麝香草酚藍(lán)脫色率最高；高千千等[24]報(bào)道，固定化白毒鵝膏真菌漆酶對(duì)分散藍(lán)-2BLN的脫色，在pH為4.12～5.16之間脫色效果最好；李凡姝等[25]研究了芽孢桿菌菌株CLb的芽孢漆酶對(duì)活性黑和靛紅的脫色，pH為7.0時(shí)脫色效果最好；可見，畢赤酵母表達(dá)的CotA漆酶更具耐堿性。本研究的CotA漆酶，在60～70 ℃下仍能保持較高脫色活性；韓啟燦等[26]報(bào)道了落葉松附毛孔真菌漆酶，對(duì)孔雀石綠在40 ℃時(shí)的脫色效果最好；鄭文爽[22]研究了固定化疣孢漆斑菌胞外漆酶對(duì)偶氮類染料的脫色，在35～55 ℃時(shí)對(duì)染料的脫色效果好；可見，畢赤酵母表達(dá)的CotA漆酶在高溫下仍具有高活性。

本研究確定了CotA漆酶固定化過程中，各影響因素對(duì)漆酶活力的影響強(qiáng)度，并優(yōu)化了CotA漆酶的固定化條件，固定化效率比優(yōu)化前提高了23%。固定化CotA漆酶，在70 ℃、pH為8.0時(shí)，對(duì)溴麝香草酚藍(lán)溶液的脫色率最高；而游離的CotA漆酶，在60 ℃、pH為7.6時(shí)，對(duì)溴麝香草酚藍(lán)溶液的脫色率最高；表明，固定化CotA漆酶比游離CotA漆酶更耐高溫和高pH。試驗(yàn)結(jié)果可為高溫和高堿的印染廢水處理提供參考。

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ImmobilizationofCotALaccaseandDecoloringBromothymolBlue

//Xing Dan, Ma Minghong, Wu Hangshen, Sun Haiqiong, Wang Jueyu, Wang Chunlei, Zhao Min

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

CotA laccase gene from Bacillus subtilis isolated from forest soil was expressed in Pichia pastoris. The immobilization efficiency of CotA laccase expressed fromPichiapastoriswas 32.2% with calcium alginate as carrier. The immobilization efficiency was increased by 30.1% through optimizing immobilization condition under orthogonal experiment. The highest decolorization rate of bromothymol blue by immobilized CotA laccase was 76.81% under 30 min, 70 ℃ and pH of 8.0. The highest decolorization rate of bromothymol blue by free laccase was 67.12% under 30 min, 60 ℃ and pH of 7.6. The results indicated that immobilized CotA laccase had higher enzyme activity than free CotA laccase under heat and alkali condition.

CotA laccase; Bromothymol blue; Dyes decolorizing

Q554；TQ61

1)國家林業(yè)局“948”項(xiàng)目(2012-4-03)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51678120)；黑龍江省博士后資助經(jīng)費(fèi)(LBH-Z11254)。

邢丹，女，1990年1月生，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，碩士研究生。E-mail：1803866001@qq.com。

汪春蕾，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，副教授。E-mail：wcls-1972@163.com。趙敏，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail：82191513@163.com。

2017年4月21日。

責(zé)任編輯：張 玉。

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(10)：40-43,48.