吳湘龍，雷 瀟，易世鳴，劉 歡，孟祥池，劉宇波，曾 奧

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

絮凝劑對紫云英根瘤菌發(fā)酵液絮凝效果的研究

吳湘龍，雷 瀟，易世鳴，劉 歡，孟祥池，劉宇波，曾 奧

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

根瘤菌發(fā)酵會產(chǎn)生大量的胞外粘液，使發(fā)酵液變得十分粘稠，從而嚴(yán)重影響發(fā)酵液的固液分離。為降低發(fā)酵液的菌體收集難度，研究在優(yōu)化根瘤菌發(fā)酵水平的基礎(chǔ)上，選用7種絮凝劑對發(fā)酵液進(jìn)行處理，以絮凝率、蛋白去除率、多糖去除率、上清液菌體含量為指標(biāo)進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：聚合氯化鋁（50 mg/L）絮凝速率最快，蛋白多糖去除率高，但粘壁現(xiàn)象嚴(yán)重，上清菌體含量少；而陽離子聚丙烯酰胺（100 mg/L）表現(xiàn)出良好的上清菌體含量以及多糖去除率，且粘壁現(xiàn)象少，最適用于紫云英根瘤菌發(fā)酵液多糖去除和菌體的收集。

絮凝劑；紫云英根瘤菌；多糖；絮凝

紫云英為水稻田常用綠肥，能夠增加土壤肥力，改善土壤理化性質(zhì)，特別是對于近年來稻田土壤出現(xiàn)的一系列問題，紫云英種植都有一定的功效。因此，繼續(xù)擴(kuò)大紫云英推廣面積具有重要意義。與紫云英共生固氮的根瘤菌劑因成本低、不影響環(huán)境和固氮效果好，也受到普遍受關(guān)注。根瘤菌與豆科植物的共生固氮作用雖在19世紀(jì)晚期就已經(jīng)被科學(xué)家所認(rèn)識，但在我國的推廣應(yīng)用還不夠，主要還是受制于化學(xué)肥料高效方便快捷的沖擊[1-3]。

商業(yè)生產(chǎn)根瘤菌劑的質(zhì)量主要受2個因素的影響，一是發(fā)酵水平，另一個是有效活菌數(shù)。已有文獻(xiàn)報道，在發(fā)酵液中加入豆芽汁能顯著提高發(fā)酵水平。這主要是因為豆科植物發(fā)芽初期根部能分泌一種類黃酮物質(zhì)，該物質(zhì)能夠刺激周圍根瘤菌的生長[4-5]。但研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵液中添加20%的豆芽汁，所需豆芽菜用量的成本已經(jīng)超過培養(yǎng)基其他部分的整體成本。因此，提高豆芽汁的獲得量，降低發(fā)酵成本成為當(dāng)前首要解決的問題。該研究擬通過煎煮和榨汁2種方法分別獲取豆芽汁，以期提高豆芽汁的得率，為根瘤菌劑的生產(chǎn)節(jié)本增效。

菌劑的保存直接影響發(fā)酵后的有效活菌數(shù)。如果直接用發(fā)酵液常溫保存，隨著代謝產(chǎn)物的累積，根瘤菌劑仍是一種季節(jié)性產(chǎn)品。該課題組通過去營養(yǎng)化、低氧、滲透壓保護(hù)及抑制劑抑制等方法使液體根瘤菌劑常溫保存期能達(dá)到9個月（其有效活菌數(shù)達(dá)2億CFU/mL以上），目前相關(guān)技術(shù)正在申請專利中。而對于工業(yè)生產(chǎn)，去營養(yǎng)化是最困難的一環(huán)，由于根瘤菌劑發(fā)酵均會產(chǎn)生大量粘液，如果單純用離心或膜分離的方法，其能耗非常大，其成本也不低。根瘤菌不含莢膜，菌劑表面也不存在莢膜多糖，因此根瘤菌本身不具備粘稠性，其發(fā)酵液粘稠性主要來自于胞外多糖[6-7]。絮凝分離技術(shù)是一種新型的分離純化技術(shù)，可用于發(fā)酵液的凈化處理。該研究擬采用8種絮凝劑對根瘤菌發(fā)酵液進(jìn)行處理，以期篩選出一種營養(yǎng)物質(zhì)去除率高、絮凝菌體少，且對菌體無影響的絮凝劑，為紫云英根瘤菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株中慢生華葵根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）13004#菌株，系中慢生根瘤菌屬，由中國農(nóng)科院菌種保藏中心引進(jìn)。

1.1.2 培養(yǎng)基YMA培養(yǎng)基：甘露醇10 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCO30.2 g/L，Rh微量元素液4 mL/L（Rh微量元素液 ：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 值 6.8～7.0，豆芽汁1 000 mL。豆芽汁分兩種形式，第一種為煎煮，200 g鮮豆芽加入1 000 mL水煮沸30 min后，紗布過濾；第二種為榨汁，200 g鮮豆芽用壓榨機(jī)榨汁，棄芽渣，將榨汁液稀釋至1 000 mL即得，每種設(shè)3次平行試驗。種子培養(yǎng)基和計數(shù)培養(yǎng)基均為YMA培養(yǎng)基。

1.1.3 供試絮凝劑Al2(SO4)3·18H2O、CaCl2（分析純，西隴化工股份有線公司）；陽離子聚丙烯酰胺（分子量800萬～1 500萬）、聚合氯化鋁（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；Fe2(SO4)3，Na2HPO4·12H2O（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；殼聚糖（分析純，上海博奧生物科技有限公司）。

1.1.4 主要儀器TV-1810型紫外-分光光度計（北京普析通用儀器有線公司）；TGL20M-II型高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；5424R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化、接種、培養(yǎng)和菌數(shù)測定將活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃，180 r/min培養(yǎng)18 h。后按1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，同種培養(yǎng)條件，48 h后稀釋平板計數(shù)。

1.2.2 絮凝試驗根據(jù)發(fā)酵試驗結(jié)果，取菌數(shù)最多的發(fā)酵液進(jìn)行絮凝試驗?？紤]到pH值對細(xì)菌的影響，故將pH值維持與發(fā)酵液一致。根據(jù)文獻(xiàn)報道[8-10]，選取各絮凝劑用量：殼聚糖0.03 g/mL；陽離子聚丙烯酰胺0.1 g/mL；聚合氯化鋁0.05 g/mL；Al2(SO4)3·18H2O 2.5 g/mL ；Fe2(SO4)33 g/mL ；Na2HPO4·12H2O 2 g/mL ；CaCl23 g/mL。

1.2.3 絮凝操作取發(fā)酵液50 mL于100 mL燒杯中，快速攪拌同時緩慢加入絮凝劑，使其完全混合均勻，然后慢速攪拌10 min，攪拌結(jié)束后靜置30 min。絮凝結(jié)束后，觀察絮凝效果，同時將絮凝液低速（1 000 r/min）離心2 min，取上清液。

1.2.4 指標(biāo)測定及方法（1）濾速測定：取上清液用中性濾紙過濾，并測定前2 min的濾液體積，計算濾速。（2）透光率測定：取上清液稀釋10倍，以水為空白對照，在610 nm處測定透光率。（3）多糖含量的測定：取發(fā)酵液和絮凝離心分離的上清液采用DNS[11]法分別測定多糖含量，計算多糖去除率：多糖去除率（%）=（1-上清液多糖含量/發(fā)酵液多糖含量）×100。（4）蛋白質(zhì)測定：取發(fā)酵液和絮凝離心分離上清液采用考馬斯亮藍(lán)法[12]分別測定蛋白質(zhì)含量，計算蛋白去除率：蛋白去除率（%）=（1-上清液蛋白含量/發(fā)酵液蛋白含量）×100。（5）菌體含量測定：取發(fā)酵液和絮凝離心分離上清液采用稀釋平板法計數(shù)，計算菌體收集率：菌體細(xì)胞含量（%）=（上清液菌體數(shù)/發(fā)酵液菌體數(shù)）×100。

1.2.5 抑菌試驗將篩選出的絮凝劑用無菌水配制成絮凝劑使用濃度，經(jīng)無菌過濾器（0.22 μm）過濾除菌，采用杯碟法進(jìn)行抑菌活性測定，測定其是否對紫云英根瘤菌有抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方式獲取的豆芽汁對紫云英根瘤菌發(fā)酵水平的影響

從表1可以看出，添加豆芽汁后，根瘤菌的發(fā)酵水平得到極顯著提升，其中榨汁組的菌數(shù)達(dá)百億數(shù)量級，如此可觀的發(fā)酵水平保證了工業(yè)發(fā)酵的質(zhì)量，同時也證實了豆科植物發(fā)芽初期能分泌促進(jìn)周圍根瘤菌大量繁殖的物質(zhì)。榨汁組與煎煮組的菌數(shù)差異也達(dá)極顯著水平（P＜0.01），說明榨汁提取優(yōu)于煎煮提取，更利于根瘤菌發(fā)酵，對于節(jié)省生產(chǎn)成本具有重要意義。

圖1 不同方式獲取的豆芽汁進(jìn)行根瘤菌發(fā)酵獲得的菌數(shù)

2.2 不同絮凝劑對發(fā)酵液的絮凝效果

添加絮凝劑后，經(jīng)表觀觀察，發(fā)現(xiàn)陽離子聚丙烯酰胺和聚合氯化鋁2種絮凝劑反應(yīng)快速，均產(chǎn)生了大量絮凝團(tuán)；硫酸鐵絮凝劑也產(chǎn)生了少量絮凝團(tuán)，而其他絮凝劑均未見明顯絮凝反應(yīng)。聚合氯化鋁產(chǎn)生的絮凝團(tuán)量最多，但粘壁現(xiàn)象十分嚴(yán)重，低轉(zhuǎn)速離心未能使絮凝團(tuán)沉積，不利于絮凝團(tuán)的清洗；而陽離子聚丙烯酰胺粘壁現(xiàn)象少，1 000 r/min離心能使粘壁絮凝團(tuán)沉積到下層。從表1可以看出，除殼聚糖外，高分子絮凝劑的絮凝效果明顯優(yōu)于低分子絮凝劑，這可能是因為殼聚糖經(jīng)攪拌后仍難溶解，致使絮凝速率較慢，從而未表現(xiàn)出絮凝效果；而聚合氯化鋁和陽離子聚丙烯酰胺2種絮凝劑絮凝效果非常明顯，在蛋白去除率、多糖去除率、濾速和透光率方面也均明顯優(yōu)于其他絮凝劑，尤其是聚合氯化鋁，蛋白去除率和多糖去除率分別達(dá)67.4%和84.7%，但其菌體回收率較低，僅37.9%，絮凝的同時也去除了大部分菌體，結(jié)合粘壁嚴(yán)重這一表觀現(xiàn)象，表明聚合氯化鋁并不適用通過絮凝分離營養(yǎng)物質(zhì)和菌體。而陽離子聚丙烯酰胺，不但表現(xiàn)出了良好的蛋白去除率（60.7%）和多糖去除率（83.8%），而且具有不錯的菌體回收率（60.3%）。綜上可知，陽離子聚丙烯酰胺最適用于紫云英根瘤菌發(fā)酵液的菌體絮凝收集。

表1 不同絮凝劑絮凝效果的比較

2.3 絮凝劑的抑菌試驗

研究的目的是利用絮凝劑絮凝特性來收集微生物，那么保證微生物的存活勢必要對其抑菌性進(jìn)行驗證。從抑菌試驗結(jié)果來看，該濃度的陽離子聚丙烯酰胺對紫云英根瘤菌未表現(xiàn)出明顯的抑制效果。

3 討 論

在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中，絮凝劑主要用于去除菌體、培養(yǎng)基、蛋白多糖等膠狀物或是色素等，從而獲得小分子代謝產(chǎn)物[13]。而該研究試圖通過絮凝劑收集菌體，從試驗結(jié)果來看，雖然絮凝分離對菌體造成一定的損失（陽離子聚丙烯酰胺損失率約40%），但因絮凝劑操作簡單，能耗低，所用藥劑和設(shè)備的價格低廉，相對于高速離心分離和高強(qiáng)度的膜分離仍具有成本優(yōu)勢。

目前關(guān)于絮凝劑的絮凝機(jī)理還沒有完全弄清楚，現(xiàn)階段被大多數(shù)人認(rèn)可的絮凝機(jī)理為靜電吸附理論、架橋絮凝理論或“表面覆蓋”模式。絮凝是一個非常復(fù)雜的過程，單一的理論并不能解釋所有現(xiàn)象[14]。陽離子聚丙烯酰胺是一種利用有機(jī)單體經(jīng)化學(xué)聚合而成的有機(jī)高分子化合物，本身能溶于水，具有電解質(zhì)行為。其絮凝機(jī)理是通過電中和使高分子鏈與多個膠體物質(zhì)以化學(xué)鍵相結(jié)合，使用時加上高分子的吸附作用使大膠體顆粒沉降。當(dāng)pH值為中性時，蛋白質(zhì)一般帶負(fù)電，而多糖也含有大量的陰離子基團(tuán)，故陽離子聚丙烯酰胺在根瘤菌發(fā)酵液中能去除大量的胞外多糖和蛋白質(zhì)。同時，根瘤菌本身不含莢膜，菌體表面電荷并不強(qiáng)（主要是細(xì)胞膜表面的糖蛋白），這可能是陽離子聚丙烯酰胺并未對菌體表現(xiàn)出很強(qiáng)絮凝活性的原因。

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Flocculating Efficiency of Rhizobium astragalus with Flocculants

WU Xiang-long，LEI Xiao，YI Shi-ming，LIU Huan，MENG Xiang-chi，LIU Yu-bo，ZENG Ao
（Hunan Institute of Microbiology, Changsha 410009, PRC）

Rhizobium fermentation produces a large amount of extracellular mucus, so the solid-liquid separation of mucus becomes very difficult. In order to reduce the difficulty in bacteria collection, 7 flocculants were used to treat fermentation broth at an optimized fermentation level and evaluate the flocculation effect through flocculation rate, protein removal rate, polysaccharide removal rate and supernatant microorganisms content in this study. The results showed that aluminium polychlorid had the highest flocculation rate, high protein removal rate and polysaccharide removal rate, but a low supernatant microorganisms content with the serious phenomenon of adhering to wall; and cationic polyacrylamide performed a good effect of supernatant microorganisms content and polysaccharide removal rate, with a little wall-adhering phenomenon. In summary, the cationic polyacrylamide was the most suitable flocculant to Rhizobium astragalus for the solid-liquid separation of mucus.

Rhizobium astragalus; flocculant; polysaccharide; flocculation

Q939.114

A

1006-060X（2017）09-0010-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.003

2017-07-18

國家自然科學(xué)基金（31501698）

吳湘龍（1976-），男，廣東揭陽市人，初級農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

曾 奧

（責(zé)任編輯：成 平）