徐 暢，宋霽軒，龐 吉吉，王冰冰，張 帥，夏廣軍

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

延邊黃牛ANGPTL4基因組織表達規(guī)律與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)性研究

徐 暢，宋霽軒，龐 吉吉，王冰冰，張 帥，夏廣軍*

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

為分析ANGPTL4基因在延邊黃牛各組織中的表達差異，進一步探討該基因在肌內(nèi)脂肪沉積中的作用，本實驗利用qRT-PCR法比較分析了ANGPTL4基因在延邊黃牛7個組織（心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和后腿?。┲械谋磉_水平及其與肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)性。結(jié)果表明：ANGPTL4基因在7個組織中表達水平從高到低依次為肝、肺、腎、心、脾、背最長肌和后腿肌，肝中表達量極顯著高于心、脾、肺、腎、后腿肌和背最長肌組織（P<0.01），肺中表達量顯著高于心、脾、腎、后腿肌和背最長肌組織（P<0.05）；背最長肌中ANGPTL4基因的表達量與背最長肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.924；ANGPTL4基因在后腿肌的表達量與后腿肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.998。結(jié)果顯示，ANGPTL4基因影響延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積。

延邊黃牛；ANGPTL4基因；組織表達譜；肌內(nèi)脂肪沉積

血管生成素樣蛋白4（Angiopoietin-like Protein 4，ANGPTL4），也稱禁食誘導(dǎo)脂肪因子，屬于類血管生成素家族成員之一[1]。ANGPTL4是與血管生成、脂類代謝、葡萄糖代謝、胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)因子[2]。研究表明，ANGPTL4可以促進脂肪酸氧化，并通過抑制脂蛋白酯酶（Lipoprotein Lipase，LPL）的活性和促進脂肪水解而直接影響脂類代謝，促進脂肪沉積[3]。大量研究表明，ANGPTL4 基因是過氧化物增殖物激活體受體（Peroxisome Prolifer Atoractivated Receptors，PPARs）γ 的下游靶基因，ANGPTL4基因的表達受PPAR 所有配體的激活，PPAR是調(diào)控脂類分化和葡萄糖代謝動態(tài)平衡的核受體，因此認為ANGPTL4 基因可能在脂類代謝和葡萄糖代謝動態(tài)平衡的調(diào)控方面發(fā)揮作用[4-5]。Legry 等研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4 基因的rs4076317 多態(tài)位點與青少年高脂肪率顯著相關(guān)[6]。馬云[7]克隆了牛ANGPTL4基因序列，發(fā)現(xiàn)了該基因的遺傳變異與牛育肥后肌內(nèi)脂肪含量存在顯著相關(guān)。ANGPTL4基因在牛肝臟和脂肪組織中表達量較高[8]。目前，在人和鼠上對 ANGPTL4 基因的研究報道較多，而在家畜上的研究報道較少。本實驗以我國五大地方良種牛之一的延邊黃牛為研究對象，利用qRT-PCR檢測ANGPTL4基因在延邊黃牛7個組織中的相對表達量，同時分析其在肌肉組織中的表達量與肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)系，為揭示延邊黃牛ANGPTL4基因的表達特點，并進一步探討ANGPTL4基因在牛的肉質(zhì)調(diào)控中的作用及其分子機制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及樣品采集 選取吉林省琿春吉興牧業(yè)有限公司6月齡延邊黃牛公牛70頭，在相同飼養(yǎng)條件育肥至36月齡屠宰。從宰前活重相近的個體中隨機選擇3頭，分別采集心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和后腿肌7個組織樣品，每個組織采集3 g，并分割成0.3 cm3的小組織塊裝入凍存管，然后立即放入液氮低溫保存，以備提取總RNA。同時采取第12～13肋間背最長肌和后腿肌，-20℃保存，用于IMF含量測定。

1.1.2 主要分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫 引物設(shè)計軟件：Primer Premier5.0、Oligo6.0；GenBank數(shù)據(jù)庫：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 本實驗以GAPDH作為內(nèi)參基因。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中牛的ANGPTL4基因序列，利用Primer5.0和Oligo6.0設(shè)計引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.2.2 總RNA的提取和質(zhì)量檢測 每個樣品取0.5 g放入無RNAase處理過的研缽中加入液氮充分研磨，按 Trizol試劑盒說明書方法提取總 RNA。利用超微量分光光度計ND-2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和質(zhì)量。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 冰上操作反轉(zhuǎn)錄整個過程，建立反轉(zhuǎn)錄混合液體系：dNTP混合液（10 mmol/L）1 μL，寡dT引物（2.5 μmol/L） 1 μL，RNA 2 μL，無RNA酶雙蒸水 6 μL，總體積 10 μL。在PCR儀上進行變性、退火反應(yīng)，65℃ 5 min；4℃保存。瞬時離心，使混合液聚集于反應(yīng)管的底部。建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：上述反應(yīng)液 10 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑（40 U/μL） 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，無RNA酶雙蒸水5 μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序：42℃ 30 min；95℃ 5 min；4℃保存。

1.2.4 qRT-PCR實驗操作方法 按照SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書操作。冰上配制qRT-PCR反應(yīng)液：SYBR預(yù)混液（2×） 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板 2 μL，無RNA酶雙蒸水6.4 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)程序：①預(yù)變性：95℃ 30 s（升溫速率4.4℃/s）。②PCR（分析模式：定量分析）：95℃ 5 s （升溫速率4.4 ℃/s）；60℃ 30 s（升溫速率 2.2℃ /s，Acquisition Mode：Single）循環(huán)40次。③熔解（分析模式：熔解曲線）：95℃ 5 s（升溫速率4.4℃ /s）；60℃ 1 min（升溫速率2.2℃/s）；95℃（升溫速率0.11℃/s，Acquisition Mode：Continuous，Acquisitions：5 per℃）。④降溫：50℃ 30 s（升溫速率2.2℃/s）。

1.2.5 IMF含量測定 稱取背最長肌和后腿肌樣本各10 g左右，利用索氏抽提法進行IMF含量測定。

1.3 統(tǒng)計分析 采用2－ΔΔCT法計算基因的相對表達量，ΔCt目的基因= Ct目的基因－ Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt =ΔCt試驗組－ ΔCt對照組。采用 SPSS 19.0 進行方差分析和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA檢測結(jié)果 經(jīng)超微量分光光度計檢測，A260/A280在1.9～2.1，表明RNA質(zhì)量較好。1%的瓊脂糖凝膠檢測，18S和28S條帶清晰，無條帶彌散現(xiàn)象（圖1）。符合實時熒光定量PCR實驗的要求。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 qRT-PCR的產(chǎn)物特異性 從ANGPTL4基因qRT-PCR 擴增和熔解曲線（圖2）可以看出，ANGPTL4 基因的PCR 產(chǎn)物只有1 個特異峰，無引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物，可用于進一步的熒光定量檢測分析。

2.3 ANGPTL4基因組織表達譜分析 根據(jù)表2可知，ANGPTL4基因在延邊黃牛7個組織中均有表達，其中，肝中表達量極顯著高于心、脾、肺、腎、后腿肌和背最長肌組織（P<0.01），肺中表達量顯著高于心、脾、腎、后腿肌和背最長肌組織（P<0.05）。ANGPTL4基因表達水平在7個組織中從高到低依次為肝、肺、腎、心、脾、背最長肌、后腿肌。

表1 qRT-PCR引物

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.4 ANGPTL4基因在肌肉組織中的表達與IMF含量的相關(guān)性分析 根據(jù)表3可知，背最長肌中ANGPTL4基因的表達量與背最長肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.924；ANGPTL4基因在后腿肌的表達量與后腿肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.998。

表3 ANGPTL4 mRNA表達量與IMF含量的相關(guān)性分析

3 討 論

哺乳動物的脂類代謝、糖代謝、血管生成都受ANGPTL4基因調(diào)控[9]，ANGPTL4基因是一種具有廣泛生理功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[10-11]，與代謝、脂類代謝以及血管生成都密切相關(guān)[1]，ANGPTL4基因的適量表達或過量表達都可能不同程度引起血漿不飽和脂肪酸濃度的升高[12]。本實驗通過選取延邊黃牛的不同組織，利用qRT-PCR檢測ANGPTL4基因在延邊黃牛7個組織中的相對表達量，分析延邊黃牛ANGPTL4基因不同組織的表達情況及其與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性。

基因在組織中表達受多因素的影響，不同組織的基因表達量存在差異。Mandard等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4基因在牛的肝臟和脂肪組織中高表達，同時在心臟、腎臟、胰臟、骨骼肌中也有表達。豐勝求等[14]對豬ANGPTL4基因表達研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織、肝臟、腎臟中高表達，心臟、脾臟、肌肉等其他組織少量表達。Dutton等[15]對小鼠的ANGPTL4基因表達進行研究，結(jié)果表明，ANGPTL4基因在其研究的5個組織中都有表達，其中在肝臟表達量最高。以上3個研究與本實驗研究結(jié)果一致。本實驗通過對牛7個組織研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4基因在肝臟的表達量最多，在后腿肌部分表達量最少。

Feng等[16]研究了ANGPTL4基因在瘦肉型豬和脂肪型豬組織中的表達差異， ANGPTL4基因?qū)ν晃锓N不同類型或不同部位的脂肪沉積都發(fā)揮著不同的作用，ANGPTL4基因在肥胖型豬的表達量較高，瘦肉型豬的表達量略低，脂肪型豬對脂肪沉積有增加作用，說明ANGPTL4可能與脂肪沉積有關(guān)。這與本實驗中牛ANGPTL4基因的研究結(jié)果相一致。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4基因在延邊黃牛背最長肌和后腿肌表達差異顯著，背最長肌組織中ANGPTL4 mRNA表達量與IMF含量呈顯著正相關(guān)，后腿肌ANGPTL4 mRNA表達量與IMF含量呈顯著正相關(guān)，證明ANGPTL4基因可以作為延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。本實驗只是對延邊黃牛ANGPTL4基因表達的初步研究，應(yīng)進一步擴大樣本數(shù)量進行深入研究，為進一步了解ANGPTL4基因?qū)εＶ拘罘e以及利用該基因改良牛肉質(zhì)性狀提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

ANGPTL4基因的表達不存在明顯的組織特異性，在本實驗所檢測的7個組織中均有表達，其中肝臟表達量最高，后腿肌表達量最低，表達水平從高到低依次為肝、肺、腎、心、脾、背最長肌、后腿肌。ANGPTL4基因在肌肉組織中的表達量與IMF含量呈顯著正相關(guān)，說明ANGPTL4基因影響肌內(nèi)脂肪沉積，為進一步研究ANGPTL4基因?qū)ρ舆咟S牛肉質(zhì)的調(diào)控作用提供了一定的參考。

[1] 馬云, 侯飛, 李榮榮, 等. 牛血管生成素樣蛋白4基因(ANGPTL4)編碼區(qū)SNPs檢測及其與南陽牛生長性狀的相關(guān)性[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2011, 19(5):887-892.

[2] Adachi H, Fujiwara Y T, Nishikawa T, et al. Angptl 4 deficiency improves lipid metabolism, suppresses foam cell formation and protects against atherosclerosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 379(4):806-811.

[3] Mandard S, Zandbergen F, Van Straten E, et al. The fastinginduced adipose factor/ angiopoietin -like protein 4 is physically associated with lipoproteins and governs plasma lipid levels and adiposity[J]. J Biol Chem, 2006, 281: 934-944.

[4] Gbaguidi F G, Chinetti G, Milosavljevic D, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists decrease lipoprotein lipase secretion and glycated LDL uptake by human macrophages[J]. FEBS Lett, 2002, 512(1-3):85-90.

[5] Koster A, Chao Y B, Mosior M, et al. Transgenic angiopoietin-like (Angptl) 4 overexpression and targeted disruption of Angptl4 and Angptl3: Regulation oftriglyceride metabolism[J]. Endocrinology, 2005, 146(11): 4943-4950.

[6] Legry V, Bokor S, Cottel D, et al. Associations between common genetic polymorphisms in angiopoietin-like proteins 3 and 4 and lipid metabolism and adiposity in European adolescents and adults[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2009, 94(12):5070-5077.

[7] 馬云. 牛三個基因的分離、定位及其與牛經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2006.

[8] Mamedova L K, Robbins K, Johnson B J, et al. Tissue expression of angiopoietin-like protein 4 in cattle[J]. J Anim Sci, 2010, 88(1):124-130.

[9] 馬云, 李榮榮, 侯飛, 等. ANGPTL4基因的表達調(diào)控及功能研究進展[J]. 中國牛業(yè)科學(xué), 2009, 35(6):36-40.

[10] 徐龍鑫, 劉鏡, 張麟, 等. 關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016,44(9):51-53.

[11] 李文浩. 羔羊肉生產(chǎn)雜交組合篩選及藏綿羊ANGPTL4基因多態(tài)性分析[D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[12] Hato T, Tabata M, Oike Y. The role of angiopoietinlike proteins in angiogenesis and metabolism[J]. Trends Cardiovasc Med, 2008, 18(1):6-14.

[13] 馬云, 駱瑩瑩, 李芬, 等. 牛ANGPTL4基因結(jié)構(gòu)和功能的生物信息學(xué)分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010,32(1):135-140.

[14] 豐勝求. 豬Angptl家庭基因的克隆、表達及調(diào)控研究[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[15] Dutton S, Trayhurn P. Regulation of angiopoietin-like protein 4/fasting-induced adipose factor (Angptl4/FIAF)expression in mouse white adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes[J]. Br J Nutr, 2008, 100(1):18.

[16] Feng S Q, Chen X D, Xia T, et al. Cloning, chromosome mapping and expression characteristics of porcine ANGPTL3 and -4[J]. Cytogenet Genome Res, 2006,114(1):44-49.

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-043

2017-04-26；收回日期：2017-07-09

吉林省科技發(fā)展計劃重點科技攻關(guān)項目（201602 04017NY）；吉林省現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)研究課題（201635）；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)項目

徐暢（1991-），女，吉林長春人，碩士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：591667504@qq.com

*通訊作者：夏廣軍，E-mail：ybuac@ybu.edu.cn