董筱萍 ， 王 瑞 ， 王楠楠 ， 李 石 ， 佟彥林 ， 孫嘉一 ， 周鐵忠

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬動物醫(yī)院 ， 遼寧 錦州 121001)

遼寧省豬鏈球菌病流行特征及其病原類型鑒定

董筱萍 ， 王 瑞 ， 王楠楠 ， 李 石 ， 佟彥林 ， 孫嘉一 ， 周鐵忠

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬動物醫(yī)院 ， 遼寧 錦州 121001)

通過從遼寧省的遼東、遼南、遼西、遼北四個(gè)區(qū)域采集發(fā)病豬的淋巴結(jié)、脾臟、腦、關(guān)節(jié)液和膿腫液作為細(xì)菌學(xué)檢測病料，進(jìn)行豬鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查，以明確遼寧省豬鏈球菌病發(fā)生情況和特點(diǎn)，為進(jìn)一步建立有效防治技術(shù)措施奠定基礎(chǔ)。同時(shí)對遼寧地區(qū)33株致病性豬鏈球菌，用分子生物學(xué)鑒定方法對特異性基因進(jìn)行血清型鑒定,結(jié)果表明，遼寧省地區(qū)致病性豬鏈球菌主要以1、2、7型為主。

遼寧 ； 豬鏈球菌病 ； 流行特征 ； 病原類型

豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌引起豬多種病理類型的傳染病。包括急性敗血型、化膿性淋巴炎型、腦膜炎型和關(guān)節(jié)炎型、心內(nèi)膜炎等。豬鏈球菌根據(jù)菌體莢膜抗原性不同，分為35個(gè)莢膜血清型，其中豬鏈球菌1/2、1、2、7、9型具有致病性，致病性最強(qiáng)的是豬鏈球菌2型[1]。我國豬鏈球菌病發(fā)病持續(xù)上升，對我國養(yǎng)豬行業(yè)及相關(guān)從業(yè)人員造成了很大的傷害。2015年3月至2016年10月期間，從遼寧省的遼東、遼南、遼西、遼北4個(gè)區(qū)域采集發(fā)病豬的淋巴結(jié)、脾臟、腦、關(guān)節(jié)液和膿腫液作為細(xì)菌學(xué)檢測病料，進(jìn)行了豬鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查，以明確遼寧省豬鏈球菌病發(fā)生情況和特點(diǎn)，為進(jìn)一步建立有效防治技術(shù)措施奠定基礎(chǔ)。同時(shí)遼寧省各地區(qū)該病發(fā)生普遍、病理類型復(fù)雜、防治效果不顯著，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)帶來困擾，主要原因是對各地區(qū)豬鏈球菌的血清型、耐藥性等還缺乏系統(tǒng)研究[2]，沒有制定針對某一地區(qū)的防治方案。所以分區(qū)分時(shí)段采集樣品進(jìn)行細(xì)菌的鑒定，以準(zhǔn)確查明本地菌株的類型刻不容緩。因此，本試驗(yàn)針對遼寧地區(qū)33株致病性豬鏈球菌，應(yīng)用基于特異性基因檢測比對的分子生物學(xué)鑒定方法進(jìn)行血清型鑒定。研究結(jié)果表明，遼寧省地區(qū)致病性豬鏈球菌主要以1、2、7型為主。

1 材料

2015年3月至2016年10期間，對遼寧省4個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域選擇8～10個(gè)規(guī)模豬場進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)、不同生長階段、不同季節(jié)等的發(fā)病率、死亡率、發(fā)病類型。采集樣本共296份。健康SPFBALB/c小鼠，合格證號：SCXK(吉2003～0002) (錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。

2 方法

2.1 流行特征調(diào)查 從豬鏈球菌病發(fā)生的病型、變化趨勢、不同年齡、不同季節(jié)、不同地區(qū)混合感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.2 鏈球菌病的臨床診斷方法和標(biāo)準(zhǔn) 參考農(nóng)業(yè)部豬鏈球菌應(yīng)急防治技術(shù)規(guī)范(農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]20號)，通過臨診發(fā)病特點(diǎn)、典型癥狀和剖檢病變特征做出初步診斷[3]。

2.3 致病性試驗(yàn) 小鼠感染試驗(yàn)： 選取3株代表菌株分3組，對照組1組，共4組，每組20只小鼠，小鼠腹腔注射分離菌株BHI液體培養(yǎng)物0.2 mL (2×107CFU/mL) ，對照組腹腔注射相同劑量無菌BHI液體培養(yǎng)物。

動物回歸試驗(yàn)： 30日齡斷奶健康仔豬8頭，分兩組，一組腹腔注射2 mL分離菌株(1、2、7、9型)( 2×107CFU/m L)BHI液體培養(yǎng)物。另一組腹腔注射2 mL無菌BHI液體培養(yǎng)物作對照[6]。

2.4 遼寧省豬鏈球菌的基因型鑒定 提取細(xì)菌DNA基因組，用特異性引物驗(yàn)證，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，目的片段測序分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 遼寧省豬鏈球菌病發(fā)生的病型和變化趨勢 從病型上來看，遼寧省豬鏈球菌發(fā)病的病理類型多樣并復(fù)雜化，表現(xiàn)為敗血型、腦膜炎型、膿腫型、關(guān)節(jié)炎型及肺炎混合型，其中，以腦膜炎型、混合型所占比例較高，平均為42.2%、30.65%。從變化趨勢看，敗血型逐漸減少，腦膜炎型增多，成為主要發(fā)病類型，其他類型變化不明顯。

3.2 遼寧豬鏈球菌病不同年齡和季節(jié)發(fā)病情況統(tǒng)計(jì) 從年齡和季節(jié)上來看，豬鏈球菌病在一年四季均有較高的發(fā)病率，雖然相同年齡不同季節(jié)豬的發(fā)病率差異不顯著(P>0.05)，但秋季和春季發(fā)病率有高于夏季和冬季的趨勢，哺乳仔豬冬季發(fā)病率最高，可能與溫差變化較大有關(guān)。分析結(jié)果顯示，秋季青年豬發(fā)病率顯著高于成年豬、哺乳仔豬(P<0.05)，春季青年豬發(fā)病率顯著高于成年豬(P<0.05)，冬季、夏季青年豬發(fā)病率與成年豬、哺乳仔豬無顯著差異(P>0.05)。

3.3 遼寧不同地區(qū)豬鏈球菌發(fā)病和混合感染情況統(tǒng)計(jì) 從區(qū)域不同的發(fā)病和混合感染來看，豬鏈球菌病在遼寧省各地均有發(fā)生，分布廣泛，其中營口、鞍山和大連發(fā)病率極顯著高于其他地區(qū)(P<0.01)，可能與上述地區(qū)養(yǎng)豬量較大，豬及豬產(chǎn)品運(yùn)輸頻繁有關(guān)，丹東發(fā)病率較低，可能與上述地區(qū)養(yǎng)豬量較少，山區(qū)多形成天然疫情隔離屏障有關(guān)。豬鏈球菌病70%以上為混合感染，其中多病原混合感染率最高，其次混感較高的病原依次為副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

3.4 遼寧省豬鏈球菌的分離鑒定結(jié)果 經(jīng)過革蘭染色觀察到鏡下的細(xì)菌形態(tài)、大小、排列方式非常典型。分離到的鏈球菌呈鏈狀或雙球排列的革蘭陽性球菌(見圖1)，初步判斷為鏈球菌。生化試驗(yàn)結(jié)果均符合其生化特性。動物致病性試驗(yàn)結(jié)果：注射小鼠后15 h全部死亡，病變組織染色革蘭陽性球菌，對照組未見異常。動物回歸試驗(yàn)：試驗(yàn)組動物全部死亡，通過細(xì)菌學(xué)觀察和特異性引物的PCR檢測，確定細(xì)菌為豬鏈球菌。

圖1 豬鏈球菌的革蘭染色結(jié)果

分離菌株經(jīng)過16S rRNA PCR驗(yàn)證，目的片段約1 450 bp左右，見圖2。經(jīng)對比分離菌株序列的結(jié)果與生化鑒定的結(jié)果一致。

3.5 遼寧省豬鏈球菌的基因型鑒定 應(yīng)用1、2、7、9型特異性基因?qū)|寧分離的豬鏈球菌流行菌株進(jìn)行鑒定見圖3，結(jié)果表明,檢測2015年至2016年來遼寧的疑似豬血液、腦脊液、肝、脾、淋巴結(jié)樣品33份，檢出1型13份，2型14份,7型6份，陽性率分別為39.0%、42.0%和18.0%。主要有1、2、7型。

圖2 豬鏈球菌16S rRNA序列電泳結(jié)果

圖3 豬鏈球菌1型、2型、7型電泳結(jié)果

4 討論

結(jié)合調(diào)查明確了遼寧地區(qū)豬鏈球菌病發(fā)病日齡、季節(jié)、地區(qū)等特征，確證了該地區(qū)豬鏈球菌病的病型和變化趨勢，豬鏈球菌病表現(xiàn)為敗血型、腦膜炎型、膿腫型、關(guān)節(jié)炎型及肺炎混合型，敗血型逐漸減少，腦膜炎型和肺炎型增多，成為主要發(fā)病類型。該病在一年四季均有較高的發(fā)病率，但秋季和冬季發(fā)病率顯著高于夏季和冬季，保育豬春秋季節(jié)發(fā)病率較高。

應(yīng)用細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)方法，從遼寧地區(qū)鑒定了33株豬鏈球菌，通過動物致病性試驗(yàn)可以100%致死小鼠和本動物仔豬。說明遼寧豬鏈球菌流行菌株具有很強(qiáng)的致病性。

應(yīng)用特異性基因檢測分析方法確定了遼寧地區(qū)流行菌株主要血清型為1型、2型和7型。為遼寧地區(qū)建立有針對性的防治技術(shù)措施提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

[1] Higgins R,Gottschalk M. Distribution of Streptococcus suis capsular types in 2000[J].2001,42(03):223-224.

[2] 吳德，羅會明,鄭慧貞.人-豬鏈球菌病流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中華流行病學(xué)雜志,2007,28(4):402-404．

[3] 閔文龍.豬鏈球菌病的防治[J].醫(yī)學(xué)動物防制,2007,23(2):154-155.

S855.3

B

0529-6005(2017)08-0081-02

2017-03-29

遼寧省百千萬人才工程資助項(xiàng)目(2014921012)；遼寧省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(2011214001,LYHX2013035)

董筱萍(1984-),女，助教,碩士,從事教學(xué)與動物診療工作, E-mail:dongxiaoping2032@163.com

周鐵忠,E-mail:ztz1818@126.com