盧志偉++王磊++許小敏++張利英++何進(jìn)鵬++華君瑞++張艷輝++劉永琦

摘要：目的 探討當(dāng)歸及當(dāng)歸多糖對(duì)X射線照射致SD大鼠免疫功能損傷的防護(hù)作用。方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、當(dāng)歸水煎液組、當(dāng)歸多糖組和陽(yáng)性對(duì)照組。常規(guī)飼養(yǎng)14 d后，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。第8日除對(duì)照組外其余各組大鼠進(jìn)行全身X射線照射，連續(xù)2 d，每日1次，每次3 Gy，總吸收劑量為6 Gy。輻射后第3日股動(dòng)脈采血處死大鼠，血常規(guī)檢測(cè)外周血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT），有核細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察骨髓有核細(xì)胞數(shù)量，HE染色觀察脾臟病理形態(tài)，ELISA檢測(cè)血清干擾素-γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素（IL）-4的含量。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)、血WBC、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、血清IL-4和IFN-γ含量明顯降低（P<0.05），RBC和HGB明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組血WBC、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、血清IL-4和IFN-γ含量明顯升高（P<0.05），RBC和HGB明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 當(dāng)歸及當(dāng)歸多糖對(duì)X射線照射致SD大鼠免疫功能損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；當(dāng)歸多糖；輻射；造血；免疫功能；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.011

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）10-0044-05

Effects of Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Sinensis Radix Polysaccharides on Immune Function Injury Induced by X Ray in SD Rats LU Zhi-wei1，2， WANG Lei1， XU Xiao-min1， ZHANG Li-ying1， HE Jin-peng3， HUA Jun-rui3， ZHANG Yan-hui1， LIU Yong-qi1，4 （1. Provincial-Level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and the Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Colleges and Universities， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Jiayuguan City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Jiayuguan 735100， China； 3. Institute of Modern Physics， Chinese Academy of Sciences， Gansu Key Laboratory of Space Radiobiology， Lanzhou 730000， China； 4. Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation at Provincial and Ministerial Level， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To investigate the protective effects of Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Sinensis Radix polysaccharides on immune function injury induced by X rays in SD rats. Methods Forty SD rats were randomly divided into control group， model group， Angelicae Sinensis Radix Decoction group， Angelicae Sinensis Radix polysaccharide group and positive medicine group. After routine feeding for 14 day， each administration group was given relevant medicine for gavage， while control group and model group were given the same amount of distilled water for gavage， once a day for 7 d. From the 8th day， except for the control group， the rats in the rest of groups were subjected to whole-body X ray irradiation， continuous exposure to 2 d； the total absorbed dose was 6 Gy. The rats were killed by femoral artery after irradiate 3 d. The WBC count， RBC， HGB， and PLT in peripheral blood

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81473457）；甘肅省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目（2015A-095）；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（CX2016-16）

通訊作者：劉永琦，E-mail：liuyongqi73@163.comendprint

were observed by blood routine test； the number of nucleated cells in the bone marrow was observed by nucleated cell count method； the pathological changes of spleen were observed by HE staining under microscope； the contents of IFN-γ and IL-4 in serum were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the spleen index WBC， number of bone marrow nucleated cells and serum contents of IL-4 and IFN-γ in model group was significantly lower （P<0.05）， The contents of RBC and HGB increased （P<0.05）. Compared with the model group， WBC， number of bone marrow nucleated cells， and the contents of IL-4 and IFN-γ in serum of each administration group increased significantly （P<0.05）； RBC and HGB decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Sinensis Radix polysaccharides have protective effects on the immune function injure induced by X ray in SD rats.

Key words： Angelicae Sinensis Radix； Angelicae Sinensis Radix polysaccharide； radiation； hematopoiesis； immune function； rats

目前，隨著放射技術(shù)在腫瘤診療中的廣泛應(yīng)用，增加了患者接觸X射線的機(jī)會(huì)。輻射可以直接或間接作用造成機(jī)體的多器官損傷，嚴(yán)重者可誘發(fā)細(xì)胞突變、癌變及死亡。機(jī)體的造血及免疫系統(tǒng)對(duì)電離輻射非常敏感，可導(dǎo)致中樞及外周免疫器官功能異常，因此，輻射損傷的防護(hù)作用對(duì)于保護(hù)機(jī)體的健康具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)歸的有效成分主要包括當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸揮發(fā)油、阿魏酸等?，F(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸多糖具有保肝、減毒、抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤和抗輻射損傷等作用[1-5]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠灌胃當(dāng)歸水煎液及當(dāng)歸的有效成分當(dāng)歸多糖30 min后進(jìn)行全身X射線照射，探討當(dāng)歸發(fā)揮抗輻射、調(diào)節(jié)免疫功能的作用是否通過(guò)當(dāng)歸多糖起主要作用。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

當(dāng)歸用量按臨床用量換算成大鼠用量，當(dāng)歸多糖按當(dāng)歸用量同比換算成相對(duì)劑量。當(dāng)歸購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，稱取當(dāng)歸飲片20.16 g，剪成0.5 cm大小碎粒，用500 mL雙蒸水在不銹鋼煎藥鍋中浸泡30 min。電磁爐煎煮至水開(kāi)后計(jì)時(shí)并武火煎煮10 min，之后換文火煎煮30 min，倒出藥液，再加250 mL水文火煎煮30 min，倒出藥液，合并2次藥液，倒入燒杯，微波小火煎煮濃縮至32 mL，此為8只大鼠2 d用量，冷卻后置于4 ℃冰箱保存；當(dāng)歸多糖由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理與毒理實(shí)驗(yàn)室通過(guò)水提醇沉法而取得，提取得率2.69%，純度為66.7%。貞芪扶正顆粒，甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批號(hào)Z62020416。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠IL-4（批號(hào)ERC002）、IFN-γ（批號(hào)ERC101g） ELISA檢測(cè)試劑盒，深圳欣博盛生物科技有限公司。X射線儀PRECISION X-RAY（美國(guó)Faxitron公司），分光光度計(jì)（VIS-723N，北京瑞利儀器公司），酶標(biāo)儀（IMARK，美國(guó)Bio-Rad），eppendorf移液器（德國(guó)艾本德股份有限公司）。

1.3 動(dòng)物及處理

SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（軍）2012-0007。飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%環(huán)境，每日光照12 h，自由攝食飲水。常規(guī)飼養(yǎng)14 d后，將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、當(dāng)歸水煎液組、當(dāng)歸多糖組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只。當(dāng)歸水煎液組按6.3 g/（kg·d）劑量干預(yù)，當(dāng)歸多糖組按254.2 mg/（kg·d）劑量干預(yù)，陽(yáng)性對(duì)照組按2.625 g/（kg·d）劑量干預(yù)，對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)1周。第8日起除對(duì)照組外其余各組均用X射線儀進(jìn)行背部照射，總吸收劑量為3 Gy，吸收劑量率為92.26 cGy/min，距輻射源70 cm，輻射后第2日以相同方式進(jìn)行腹部照射。末次輻射72 h后股動(dòng)脈取血并處死大鼠檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)，其中末次輻射后第2日模型組大鼠死亡1只，輻射后第3日模型組死亡1只，當(dāng)歸水煎液組和當(dāng)歸多糖組各死亡1只。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 一般情況 每日觀察大鼠飲食、水量，大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)頻率、體毛及二便等變化。

1.4.2 脾臟指數(shù) 處死大鼠，取出脾臟，將其置于生理鹽水沖洗干凈，稱取脾臟質(zhì)量，計(jì)算大鼠脾臟指數(shù)[脾臟質(zhì)量（mg）÷大鼠質(zhì)量（g）]。endprint

1.4.3 血常規(guī)檢測(cè) 用含EDTA抗凝管從股動(dòng)脈取血1 mL，上下晃動(dòng)抗凝管，使其充分混勻。將全血轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，上機(jī)檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）。

1.4.4 骨髓有核細(xì)胞 參照文獻(xiàn)[6]方法股動(dòng)脈取血后脫頸處死大鼠，分離大鼠左股骨，用剪刀沿股骨頸將股骨頭剪掉，3%冰醋酸10 mL用注射器將骨髓全部沖出，移液器輕輕吹打，將細(xì)胞吹散，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)量（4個(gè)大格細(xì)胞數(shù)÷4×10 000）。

1.4.5 脾臟病理形態(tài) 脾臟組織切片HE染色，光鏡下觀察病理變化。

1.4.6 血清白細(xì)胞介素-4和γ-干擾素檢測(cè) 大鼠麻醉后股動(dòng)脈采血，靜置1 h，3000 r/min離心10 min，用微量移液器吸取上清液，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般狀況

輻射前各組大鼠飲食、飲水量無(wú)差異，活動(dòng)量正常，體毛光滑。輻射后第1日，各組大鼠飲食明顯減少，飲水量明顯增加，出現(xiàn)狂躁不安、易驚恐等現(xiàn)象；第2日開(kāi)始，動(dòng)物飲食、飲水量均減少，活動(dòng)頻率低，出現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳、蜷臥及弓背聳肩的特殊體態(tài)，尤以模型組表現(xiàn)最為顯著，實(shí)驗(yàn)后期，模型組出現(xiàn)體毛晦黯、光澤度差和脫毛現(xiàn)象，甚至鼻孔出血、腹瀉。當(dāng)歸水煎液組和當(dāng)歸多糖組飲食、飲水量增加，精神狀態(tài)較好，活動(dòng)增多，大便稀，鼻孔出血減少。

2.2 當(dāng)歸和當(dāng)歸多糖對(duì)模型大鼠脾臟指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組脾臟指數(shù)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 當(dāng)歸和當(dāng)歸多糖對(duì)模型大鼠血常規(guī)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠WBC明顯降低、RBC和HGB明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組WBC明顯升高、RBC和HGB明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 當(dāng)歸和當(dāng)歸多糖對(duì)模型大鼠骨髓有核細(xì)胞的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 當(dāng)歸和當(dāng)歸多糖對(duì)模型大鼠血清白細(xì)胞介素-4和干擾素-γ含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-4、IFN-γ含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，當(dāng)歸水煎液、當(dāng)歸多糖和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-4和IFN-γ含量明顯升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 當(dāng)歸和當(dāng)歸多糖對(duì)模型大鼠脾臟病理形態(tài)的影響

肉眼：對(duì)照組大鼠脾臟被膜完整，表面光滑，紅潤(rùn)，質(zhì)地柔軟；模型組大鼠脾臟明顯變小，表面出現(xiàn)小結(jié)節(jié)，顏色黯紅，質(zhì)地較硬；各給藥組脾臟體積增大，表面仍有小結(jié)節(jié)但明顯減少，顏色較紅潤(rùn)，質(zhì)地較柔軟。鏡下：對(duì)照組大鼠脾臟被膜完整，紅髓和白髓分界清楚，生發(fā)中心、邊緣區(qū)清晰，未見(jiàn)異常，無(wú)增生、萎縮及玻璃樣變；模型組脾臟脾小體明顯萎縮，生發(fā)中心不明顯，白髓和紅髓結(jié)構(gòu)紊亂，脾竇擴(kuò)張，間質(zhì)出血嚴(yán)重，存在明顯瘀血，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少；各給藥組脾臟組織病理?yè)p傷形態(tài)有所改變，脾小體可見(jiàn)，生發(fā)中心、紅髓和白髓分界可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯瘀血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3 討論

隨著輻射劑量的加大，輻射對(duì)機(jī)體的傷害也愈顯著，且體內(nèi)各系統(tǒng)均會(huì)受到不同的損傷，其中尤以造血、免疫、胃腸道及生殖系統(tǒng)的敏感性高。骨髓是機(jī)體血細(xì)胞與免疫細(xì)胞發(fā)生和分化的場(chǎng)所，是機(jī)體的中樞免疫器官之一。骨髓具有輻射高敏感性，由于骨髓中的WBC、RBC及幼稚細(xì)胞均是造血的主要器官，骨髓DNA含量和有核細(xì)胞數(shù)目在一定程度上能夠反映機(jī)體造血功能狀態(tài)，骨髓經(jīng)輻射后直接表現(xiàn)為骨髓有核細(xì)胞數(shù)目的減少。

脾臟是體內(nèi)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分化、發(fā)育及成熟的主要場(chǎng)所，也是維持機(jī)體免疫功能重要的免疫器官之一，因而脾臟指數(shù)在某種程度上反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)。由于脾臟對(duì)輻射高敏感性，脾臟經(jīng)輻射后脾小體變小或消失，細(xì)胞核裂解及相關(guān)核質(zhì)空泡形成、細(xì)胞壞死。在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中，T淋巴細(xì)胞輻射敏感性最高。另外，淋巴細(xì)胞及其免疫器官（如骨髓、脾臟、胸腺）均具有輻射高敏感性。輻射損傷免疫系統(tǒng)主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞數(shù)量的減少和免疫器官功能的低下，最終影響機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答和非特異性免疫應(yīng)答。免疫細(xì)胞因子主要分為T(mén)hl與Th2型細(xì)胞因子，其中，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ和腫瘤壞死因子-β等Ⅰ類細(xì)胞因子，參與機(jī)體細(xì)胞免疫，而Th2主要分泌IL-4，參與機(jī)體體液免疫。因此，Th1和Th2一旦失衡，必然會(huì)引起機(jī)體免疫功能的紊亂。相關(guān)研究表明，IFN-γ和IL-4在調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫與體液免疫中發(fā)揮重要作用，二者協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能狀態(tài)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輻射后大鼠脾臟指數(shù)明顯降低，機(jī)體脾細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷；同時(shí)，輻射后外周免疫器官與中央免疫器官損傷，外周血WBC明顯降低，RBC和HGB升高，大鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯降低。主要機(jī)制可能是輻射后，大鼠飲食、水量明顯降低，并出現(xiàn)腹瀉造成液體大量丟失，從而導(dǎo)致RBC和HGB的升高。輻射對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均造成損傷，致使大鼠血清中IL-4和IFN-γ的表達(dá)降低。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，輻射屬于火熱毒邪[8]。輻射致機(jī)體損傷的機(jī)制是熱毒過(guò)盛、耗氣傷津，引起精氣血津液的虧虛。當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血的功效，臨床上主要應(yīng)用于血液及心血管疾病的治療。楊鐵虹等[9]研究表明，當(dāng)歸多糖能抑制小鼠脾臟萎縮，并能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖。張曉君等[10]研究表明，當(dāng)歸多糖能促進(jìn)小鼠體液免疫，而大劑量使用時(shí)能增強(qiáng)細(xì)胞免疫，此外，當(dāng)歸多糖能明顯增加血虛模型小鼠的外周HGB，同時(shí)促進(jìn)輻射小鼠脾結(jié)節(jié)與骨髓細(xì)胞DNA的合成。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)提前給予SD大鼠當(dāng)歸水煎液及當(dāng)歸多糖后，能夠預(yù)防輻射造成外周免疫損傷，使其外周血WBC升高，RBC和HGB降低，減輕輻射引起的脾臟病理?yè)p傷，同時(shí)對(duì)中樞免疫也有預(yù)防作用，升高輻射引起的大鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)降低，同時(shí)還能升高輻射大鼠血清IL-4和IFN-γ的含量。endprint

綜上所述，當(dāng)歸能夠預(yù)防輻射引起的SD大鼠免疫功能的損傷，其作用可能是通過(guò)有效成分當(dāng)歸多糖實(shí)現(xiàn)的。

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（收稿日期：2017-03-07）

（修回日期：2017-03-23；編輯：華強(qiáng)）endprint