項蘭婷， 顧倩如， 張仕鏘， 董細丹， 應麗麗， 陳三妹， 陳國榮△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科， 浙江 溫州 325000； 2紹興文理學院醫(yī)學院， 浙江 紹興 312000)

姜黃素類似物L6H4對2型糖尿病大鼠膈肌的保護作用*

項蘭婷1， 顧倩如1， 張仕鏘1， 董細丹1， 應麗麗1， 陳三妹2△， 陳國榮1△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科， 浙江 溫州 325000；2紹興文理學院醫(yī)學院， 浙江 紹興 312000)

目的探討姜黃素類似物L6H4對2型糖尿病大鼠膈肌的保護作用及機制。方法40只SPF級雄性SD大鼠，隨機均分成5組：正常對照(NC)組、高脂(HF)組、高脂治療(FT)組、糖尿病(DM)組和糖尿病治療(DT)組。后4組采用高脂飼料喂養(yǎng)，4周后DM組及DT組腹腔注射鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病模型，造模成功后FT組和DT組用L6H4灌胃治療8周。生化法檢測空腹血糖及血脂水平；放射免疫法檢測空腹血清胰島素(FINS)水平并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)；ELISA法檢測血清脂聯(lián)素(APN)水平；光鏡和電鏡觀察大鼠膈肌形態(tài)改變；酶組織化學染色觀察膈肌內(nèi)脂質(zhì)沉積及琥珀酸脫氫酶(SDH)和還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH-TR)活性；硫代巴比妥酸法和羥胺法分別檢測膈肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；免疫組化和Western blot檢測膈肌脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)蛋白的表達。結果HF組和DM組大鼠的血糖、血脂、FINS和HOMA-IR較NC組均有升高(P<0.01)，L6H4治療后均下降(P<0.01)；HF組與DM組大鼠血清APN水平較NC組下降，L6H4治療后升高(P<0.01)。HF組及DM組大鼠膈肌纖維萎縮，肌纖維內(nèi)脂肪顆粒堆積，線粒體輕微腫脹；DM組大鼠膈肌纖維化，L6H4治療后，大鼠膈肌的形態(tài)學損害減輕。HF組和DM組大鼠膈肌MDA含量及SDH和NADH-TR活性較NC組升高，L6H4治療后下降(P<0.05)；HF組和DM組大鼠膈肌SOD活性和AdipoR1蛋白表達較NC組下降，L6H4治療后升高(P<0.05)。結論姜黃素類似物L6H4對2型糖尿病大鼠的膈肌具有保護作用；膈肌AdipoR1蛋白表達增強、血清APN濃度增加及抗脂質(zhì)過氧化可能參與其中。

糖尿?。?膈??； 姜黃素類似物； 脂聯(lián)素； 脂聯(lián)素受體1

膈肌是人體主要的呼吸肌，是糖尿病損害的主要靶部位之一。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病膈肌的線粒體超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性降低，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量升高，導致過氧化脂質(zhì)大量生成，氧化應激明顯增加[1-3]。姜黃素類似物L6H4是一種在姜黃素基礎上合成的單羰基姜黃素類似物，在具備姜黃素藥理優(yōu)點的同時，還克服了其穩(wěn)定性差、不易于吸收等缺點，具有更高的生物利用率和安全性，能更好地發(fā)揮姜黃素的作用。本實驗通過檢測大鼠血脂、血糖、血清脂聯(lián)素(adiponectin，APN)水平、膈肌脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)表達情況、膈肌SOD活性和MDA含量，評估胰島素抵抗水平，觀察膈肌形態(tài)學改變，研究L6H4對糖尿病大鼠膈肌的保護作用及機制，為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1實驗動物與分組

SPF級健康雄性SD大鼠40只(購于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，批準文號WYDW2014-0052)，體重180～220 g，適應性飼養(yǎng)1周，隨機均分成5組(n=8)：正常對照(normal control，NC)組、高脂(high fat，HF)組、高脂治療(high fat with treatment，F(xiàn)T)組、糖尿病(diabetes mellitus，DM)組和糖尿病治療(diabetes mellitus with treatment，DT)組。后4組予高脂飲食[4](飼料配方為10.0% 豬油、20.0% 蔗糖、2.5% 膽固醇、1.0%膽酸鹽和66.5%常規(guī)飼料)。喂養(yǎng)4周后，DM組和DT組用35 mg/kg鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射誘導2型糖尿病，72 h后尾靜脈檢測血糖濃度，以血糖>16.7 mmol/L為造模成功[5]，其余3組(NC組、HF組和FT組)腹腔注射等容積枸櫞酸緩沖液。造模成功后，F(xiàn)T組和DT組用0.2 mg· kg-1·d-1的L6H4(溶于1%羧甲基纖維素鈉)灌胃治療，每日1次，其余3組用同等劑量的1%羧甲基纖維素鈉灌胃，共8周，期間每日稱體重，后4組持續(xù)高脂飼養(yǎng)。

2藥品與主要試劑

姜黃素類似物L6H4為溫州醫(yī)科大學梁廣教授惠贈；羧甲基纖維素鈉購自Sigma；STZ和血清脂聯(lián)素ELISA試劑盒購自上海潤朗生物科技有限公司；胰島素放射免疫測定試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司；SOD試劑盒和MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠AdiopR1單克隆抗體購自Abcam；山羊抗兔單克隆抗體(II 抗)PV6001購自北京中杉金橋生物技術有限公司；還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH-tetrazolium reductase，NADH-TR)染液和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)染液由溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科提供。

3主要方法

3.1生化指標的檢測 第12周末，大鼠禁食12 h后股動脈放血處死，收集血清，生化法檢測大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)；放射免疫法測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平并計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)；雙抗體夾心ABC-ELISA法測血清APN水平。

3.2大鼠膈肌標本處理及光鏡標本制備 (1)HE染色：大鼠處死后取膈肌，用生理鹽水洗凈后濾紙吸干水分，取部分于10%中性福爾馬林固定，經(jīng)過乙醇梯度脫水、石蠟包埋后制成切片，行HE染色，光鏡下觀察膈肌纖維排列等變化情況；(2)Masson染色：制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟，蘇木素染色3～5 min，1%鹽酸乙醇分化1～3 s，流水沖洗15 min，于紅色Masson液(變色酸2R 0.5 g+磷鎢酸1.0 g+冰醋酸1 mL+蒸餾水100 mL)3 min，流水沖洗5 s，于0.1%亮綠Masson液15 s(亮綠0.1 g+20%乙醇100 mL)，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察膈肌膠原纖維沉積情況；(3)酶組織化學染色：取部分膈肌，經(jīng)液氮固定后置于-80 ℃冰箱中凍存。冰凍切片機切片，用于后續(xù)染色。將冰凍切片浸入油紅O染液(油紅O 0.5 g+丙二醇1 L)，于37 ℃恒溫箱中孵育60 min，蒸餾水清洗，浸泡蘇木素1～2 s，甘油明膠封固，光鏡下觀察膈肌內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；將NADH-TR染液和SDH染液分別滴加于冰凍切片，37 ℃恒溫箱孵育30 min，蒸餾水清洗，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察膈肌組織內(nèi)酶反應情況。

3.3電鏡觀察 標本制備和超微結構觀察的具體步驟參考文獻[3]。

3.4免疫組化實驗檢測AdipoR1的表達情況 將AdipoR1抗體按1∶100濃度稀釋，采用EnVision二步法[6]，并隨機選擇10個高倍鏡視野(×400)。PBS代替I 抗作陰性對照。通過圖像分析系統(tǒng)計算蛋白的積分吸光度(integral absorbance，IA)。

3.5Western blot實驗 提取膈肌組織總蛋白，用BCA法檢測蛋白含量。取 50 μg 蛋白，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入I抗AdipoR1(1∶2 000)4 °C 過夜。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。以 GAPDH 作為內(nèi)參照，用Bio-Rad Quantity One 4.6凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對各條帶進行相對定量分析。

3.6MDA含量和SOD活性的檢測 取出-80 ℃保存的膈肌，稱取1 g組織，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加生理鹽水，冰上研磨，制備成10%組織勻漿，2 500 r/min，低溫離心10 min，取上清備用，并用BCA法測定蛋白濃度。MDA含量用硫代巴比妥酸法檢測；SOD活性采用羥胺法檢測。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，結果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較方差齊者采用Bonferroni校正的t檢驗法，方差不齊者采用Kruskal-Wallis 檢驗，兩變量相關性分析用直線相關分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1一般情況

NC組、HF組及FT組大鼠飲食規(guī)律，毛發(fā)光澤順滑，精神狀態(tài)及活動正常；DM組大鼠精神萎靡、行動遲緩，毛發(fā)失去光澤、干燥、色黃；經(jīng)L6H4治療后，DT組大鼠較DM組癥狀明顯減輕。分組前各組體重差異無統(tǒng)計學顯著性，實驗結束時，與NC組相比，HF組體重明顯增加(P<0.01)，DM組體重明顯下降(P<0.01)；經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組體重較HF組下降(P<0.01)，DT組體重較DM組增加(P<0.01)，見表1。

2各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR及LDL/HDL值的檢測結果

與NC組相比，HF組和DM組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和LDL-C/HDL-C均不同程度增高(P<0.01)；經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組和DT組上述指標分別較HF組和DM均有不同程度下降，見表1。

表1各組大鼠體重、血糖、血胰島素、胰島素抵抗指數(shù)及LDL-C/HDL-C的比較

Table 1. Comparison of the body weight, FBG, FINS, HOMA-IR and LDL-C/HDL-C in the rats with different treatments (Mean±SD.n=8)

GroupBodyweight(g)FBG(mmol/L)FINS(mIU/L)HOMA?IRLDL?C/HDL?CNC362．26±18．626．73±0．5117．54±3．165．26±1．130．36±0．12HF418．88±24．90??10．61±1．04??23．07±4．23??10．86±2．17??1．87±0．49??FT351．75±19．68##7．66±0．66##19．98±3．286．81±1．31##0．77±016##DM245．13±9．00??30．47±1．82??31．14±1．89??42．07±1．85??60．27±19．43??DT309．25±13．95△△13．73±1．15△△25．00±1．94△△15．20±1．06△△2．05±0．16△△

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

3各組大鼠血清APN水平的比較

與NC組相比，HF組和DM組大鼠血清APN水平明顯下降(P<0.01)；經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組血清APN水平較HF組有所上升，但差異無統(tǒng)計學顯著性，DT組血清APN水平較DM組明顯上升(P<0.01)，見圖1。

4各組大鼠膈肌組織MDA含量及SOD活性的變化

與NC組相比，HF組膈肌的MDA含量增加，差異無統(tǒng)計學顯著性，DM組膈肌的MDA含量顯著增加(P<0.01)，HF組膈肌的SOD活性降低(P<0.05)，DM組膈肌的SOD活性顯著降低(P<0.01)；經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組膈肌MDA含量較HF組有所降低，差異無統(tǒng)計學顯著性，DT組膈肌MDA含量較DM組降低(P<0.05)，F(xiàn)T組和DT組膈肌SOD活性分別較HF組和DM組增加(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The comparison of serum APN in the rats with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC group;△△P<0.01vsDM group.

圖1各組大鼠血清APN含量的比較

5各組大鼠膈肌形態(tài)學的改變

5.1HE染色和Masson染色 NC組大鼠膈肌纖維排列整齊，胞漿著色均勻，胞核藍染，卵圓形，位于肌膜下；血管壁周圍及肌細胞間僅見少量墨綠色膠原纖維分布，其余部位未見明顯膠原纖維沉積。與NC組相比，HF組大鼠膈肌結構較清晰，個別肌纖維萎縮，間質(zhì)細胞增多，肌纖維排列尚整齊，血管壁周圍及間質(zhì)見稍多量墨綠色膠原纖維沉積。FT組大鼠膈肌結構及形態(tài)與正常組相似。DM組大鼠膈肌肌纖維排列較NC組稍紊亂，細胞核明顯增多，部分細胞核內(nèi)移，小灶區(qū)肌纖維萎縮，膈肌間質(zhì)見墨綠色膠原纖維沉著較NC組增多(P<0.05)，經(jīng)L6H4治療后，上述改變略有減輕，差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

Figure 2. The changes of MDA content and SOD activity of the diaphragm in the rats with different treatments. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsHF group;△P<0.05vsDM group.

圖2各組大鼠膈肌組織MDA含量和SOD活性的比較

5.2電鏡觀察 NC組大鼠膈肌線粒體呈圓形或卵圓形，成行排列，結構清晰，線粒體膜完整，線粒體嵴排列規(guī)則、密集清晰；肌原纖維密集，排列整齊，肌節(jié)完整。HF組膈肌少數(shù)線粒體腫脹，線粒體嵴稍紊亂；肌纖維排列尚整齊，肌絲間隙略增寬，見少量脂滴沉積。DM組膈肌超微結構與NC組相比損傷明顯，膈肌線粒體腫脹，嵴紊亂，部分消失甚至形成大量空泡；肌原纖維排列紊亂，肌膜下甚至肌內(nèi)見大量脂滴沉積，脂滴大小不一，常位于線粒體附近，肌原纖維受壓或結構斷裂。經(jīng)L6H4治療后，兩組的上述改變均有減輕。FT組膈肌超微結構得到改善，與NC組結構相似。DT組大鼠膈肌肌原纖維結構、脂滴沉積及線粒體形態(tài)均較DM組明顯減輕，見圖4。

6膈肌酶組織化學染色

6.1油紅O染色 NC組膈肌內(nèi)未見明顯脂質(zhì)沉積，與NC組相比，HF組膈肌纖維細胞內(nèi)可見較多紅色脂質(zhì)顆粒沉積(P<0.01)，顆粒較小，DM組膈肌纖維細胞內(nèi)見大量紅色脂質(zhì)顆粒沉積(P<0.01)，顆粒稍大；經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組及DT組脂質(zhì)沉積情況分別較FH組和DM組均有明顯改善(P<0.01)，見圖5。

6.2SDH染色和NADH-TR染色 NC組肌纖維染色顆粒較多，清晰，著色，呈陽性；HF組肌纖維染色顆粒略增多增粗，灶區(qū)肌纖維膜下肌周圍見少量片狀藍染；DM組肌纖維染色顆粒明顯增多增粗，肌纖維膜下肌周圍見片狀藍染，呈強陽性酶反應。經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組及DT組肌纖維深藍色顆粒沉積較對應模型組減少，見圖6。

7膈肌AdipoR1的表達

免疫組化結果顯示，NC組的AdipoR1呈彌漫強陽性表達，與NC組相比，HF組和DM組的AdipoR1陽性表達明顯減弱(P<0.01)；經(jīng)L6H4處理后FT組的AdipoR1陽性表達較FH組明顯增強(P<0.01)，DT組的AdipoR1陽性表達較DM組增強(P<0.05)。Western blot檢測結果顯示，與NC組相比，HF組膈肌AdipoR1蛋白表達下降(P<0.05)，DM組膈肌的AdipoR1蛋白表達較FH組明顯下降(P<0.01)；經(jīng)L6H4治療后FT組膈肌的AdipoR1蛋白表達較FH組有所上升，但差異無統(tǒng)計學顯著性，DT組膈肌的AdipoR1蛋白表達較DM組明顯上升(P<0.05)，見圖7、8。

Figure 3. The morphological changes of the diaphragm in the rats with different treatments (×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group.

圖3各組大鼠膈肌組織經(jīng)HE染色和Masson染色的形態(tài)學改變

Figure 4. Ultrastructure of the diaphragm in the rats with different treatments observed under transmission electron microscope.

圖4各組大鼠膈肌組織的透射電鏡觀察

8MDA、SOD與APN的相關性分析

經(jīng)相關性分析，膈肌組織中AdipoR1蛋白的表達與血清APN和膈肌SOD活性均呈正相關，相關系數(shù)分別為0.616(P<0.01)和0.740(P<0.01)，與膈肌MDA含量呈負相關，相關系數(shù)為-0.607(P<0.05)。

Figure 5. The morphological changes of the diaphragm in the rats with different treatments (Oil red O staining, ×400). Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

圖5各組大鼠膈肌組織的油紅O染色觀察

Figure 6. SDH and NADH-TR staining of the diaphragm in the rats with different treatments (×400).

圖6各組大鼠膈肌組織的SDH染色和NADH-TR染色觀察

討 論

膈肌屬于骨骼肌，是主要的呼吸肌，具有終生持續(xù)性收縮以及維持呼吸的特性，在調(diào)節(jié)呼吸運動及維持機體肺功能方面有著十分重要的作用，糖尿病可使膈肌出現(xiàn)收縮功能減弱和結構破壞，對肺功能產(chǎn)生不同程度的損害[7-8]。越來越多的臨床研究和動物實驗顯示糖尿病機體存在明顯的氧化應激[9-12]。沈興平等[13]通過大鼠膈肌線粒體代謝指標研究發(fā)現(xiàn)早期糖尿病膈肌即出現(xiàn)呼吸鏈電子傳遞障礙、糖酵解能力下降等代謝功能異常。SDH作為三羧酸循環(huán)和線粒體的重要標志酶之一，其活性和含量與線粒體的數(shù)目相平行，能反映線粒體的有氧氧化代謝能力。NADH-TR是NADPH脫氫酶、NAD(P)脫氫酶及NADH脫氫酶這3種酶的合稱。NADH-TR染色中，各型肌原纖維組織因NADH含量的不同而染成深淺不一的藍紫色，線粒體聚集、酶活性增強及酶含量增高部位深染。李旭升等[2, 14]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠膈肌SDH、NADPH和NOS 活性增高，LDH及CCO活性降低，提示糖尿病大鼠膈肌組織存在氧化應激和代謝功能異常；沈興平等[13]在另一研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠膈肌脂肪酸合成增加。本實驗通過膈肌SOD活性及MDA含量檢測、SDH染色和NADH-TR染色發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠膈肌組織內(nèi)線粒體聚集，酶活性增強，酶含量增高，存在明顯的氧化應激；油紅O染色顯示HF組和DM組大鼠膈肌纖維內(nèi)脂肪顆粒堆積。糖尿病通過氧化應激損傷膈肌線粒體的功能，導致膈肌組織脂質(zhì)沉積、糖脂代謝紊亂，L6H4可通過降低機體氧化應激水平而緩解糖尿病誘導的膈肌損傷。

Figure 7. The expression of AdipoR1 in the diaphragm of the rats with different treatments detected by immunohistochemistry (×400). Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHF group;△P<0.05vsDM group.

圖7免疫組織化學檢測大鼠膈肌組織AdipoR1蛋白的表達

Figure 8. The expression of AdipoR1 in the diaphragm of the rats with different treatments detected by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsNC group;△P<0.05vsDM group.

圖8Westernblot檢測各組大鼠膈肌組織AdipoR1蛋白的表達

APN是一種新近發(fā)現(xiàn)的具有較高生物學活性的細胞因子，是一種胰島素增敏劑，主要由成熟的脂肪細胞合成分泌[15]，其受體AdipoR1主要分布于心肌、骨骼肌等部位，兩者結合具有改善糖尿病癥狀等作用。研究發(fā)現(xiàn)APN與2型糖尿病、胰島素抵抗、肥胖等疾病具有一定程度的相關。隨著對APN的不斷深入研究了解，發(fā)現(xiàn)APN不僅能促進骨骼肌的脂肪酸氧化，降低血脂水平；同時還能促進骨骼肌組織對葡萄糖的吸收利用，從而降低血糖。APN與氧化應激也有相關性，Nakanishi 等[16]通過實驗表明APN與氧化應激存在負相關關聯(lián)，或許可以通過對氧化應激的調(diào)節(jié)，從而達到改善糖尿病及動脈粥樣硬化的效果。有文獻報道，APN可以抑制由氧化低密度脂蛋白導致的細胞增殖、自由基產(chǎn)生以及一氧化氮合酶的活性，其機制可能與NAD(P)H氧化酶相關。但APN要發(fā)揮相應的功能必須與其特異型受體之一AdipoR1結合，APN與其受體結合后具有抗動脈粥樣硬化、抗炎等作用，可改善骨骼肌對胰島素敏感性、減輕氧化應激損傷、調(diào)節(jié)機體的糖脂代謝等。本實驗FT組和DT組大鼠在L6H4治療后，血清 APN水平及膈肌AdipoR1蛋白的表達升高；經(jīng)相關性分析，膈肌AdipoR1的表達水平與血清APN水平及膈肌SOD活性呈顯著正相關，與膈肌MDA含量呈負相關，提示血清APN水平及膈肌AdipoR1的表達在糖尿病大鼠膈肌氧化應激的發(fā)生發(fā)展起重要作用。

姜黃素是從姜科植物根莖提取的一種植物多酚，具有抗氧化、抗炎等廣泛的藥理作用。L6H4為姜黃素類似物，保留其原有藥理作用，并具有更高的生物利用率和穩(wěn)定性。L6H4通過上調(diào)血清APN水平、增加膈肌AdipoR1蛋白的表達，而改善糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂、降低膈肌的氧化應激水平，緩解糖尿病誘導的膈肌損傷，為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的理論依據(jù)。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

ProtectiveeffectofcurcuminanalogueL6H4ondiaphragmoftype2diabeticrats

XIANG Lan-ting1, GU Qian-ru1, ZHANG Shi-qiang1, DONG Xi-dan1, YING Li-li1, CHEN San-mei2, CHEN Guo-rong1

(1DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China;2SchoolofMedicalSciences,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:csm498@163.com;chengr1978@aliyun.com)

AIM: To investigate the protective effect of curcumin analogue L6H4 on diaphragm of type 2 diabetic rats.METHODSSPF male Sprague-Dawley rats (n=40) were randomly divided into 5 groups: normal control (NC) group, high fat (HF) group, high fat+L6H4 treatment (FT) group, diabetes mellitus (DM) group and DM+L6H4 treatment (DT) group. The rats in the later 4 groups were fed with high-fat diet. After 4 weeks of high-fat diet fee-ding, the rats in DM and DT groups were intraperitoneally injected with streptozotocin to induce type 2 diabetes melliutus. The rats in FT and DT groups were given L6H4 by gavage for 8 weeks. Blood glucose and blood lipid levels were detected biochemically. Fasting serum insulin (FINS) level was measured by radioimmunoassay and insulin resistance index (HOMA-IR) was calculated. Serum adiponectin (APN) level was measured by ELISA. The morphological changes of the diaphragm were observed under light and transmission electron microscopes. Lipid deposition and the activity of succinate dehydrogenase (SDH) and NADH-tetrazolium reductase (NADH-TR) were observed by enzyme histochemical staining. The content of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in the diaphragm were measured by thiobarbituric acid method and hydroxylamine method， respectively. The protein expression of adiponectin receptor 1 (AdipoR1) in the diaphragm was determined by immunohistochemistry and Western blot.RESULTSThe levels of blood lipids, blood glucose, FINS and HOMA-IR in HF and DM groups were higher than those in NC group, but decreased after L6H4 treatment. The serum APN level in HF and DM groups was lower than that in NC group, but increased after treatment with L6H4. The muscle fibers of the diaphragm were shrunk, fat particles accumulated in the muscle fibers, and the mitochondria were slightly swollen in HF and DM groups. The diaphragmatic fibrosis was obvious in DM group. These lesions were relieved after L6H4 treatment. Compared with NC group, the level of MDA and the activity of SDH and NADH-TR in the diaphragm were increased in HF and DM groups, but decreased after treatment with L6H4. The activity of SOD and the expression of AdipoR1 in the diaphragm were lower than those in NC group, but increased after L6H4 treatment.CONCLUSIONThe curcumin analogue L6H4 exerts a protective effect on diaphragm in type 2 diabetic rats. The strengthened protein expression of AdipoR1, the increased serum level of APN, and anti-lipid peroxidation may be involved in the process.

Diabetes mellitus; Diaphragm; Curcumin analogues; Adiponectin; Adiponectin receptor 1

R587.1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.012

1000- 4718(2017)10- 1806- 08

2017- 06- 28

2017- 09- 08

浙江省公益性技術應用研究計劃(No. 2011C23123)

△通訊作者 陳三妹 Tel： 0575-88345685； E-mail： csm498@163.com; 陳國榮 Tel: 0577-55579792； E-mail: chengr1978@aliyun.com

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