周春宇， 李南南， 王紅霞， 田 翠， 李匯華

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系， 北京 100069)

泛素E3連接酶TRIM10在心肌細胞肥大中的作用*

周春宇， 李南南， 王紅霞， 田 翠， 李匯華△

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系， 北京 100069)

目的探討泛素E3連接酶TRIM10在心肌細胞肥大中的作用及分子機制。方法培養(yǎng)原代的大鼠乳鼠心肌細胞，siRNA-TRIM10與siRNA對照(siRNA-control)或過表達腺病毒Ad-TRIM10與空載對照Ad-GFP轉染細胞24 h，然后用苯腎上腺素(phenylephrine, PE)處理細胞24 h。Western blot檢測TRIM10、AKT和ERK1/2的蛋白水平；免疫熒光染色觀察心肌細胞的大??；實時熒光定量PCR檢測心房鈉尿肽(ANP) 和腦鈉尿肽(BNP)的mRNA 的表達水平。結果與對照組相比，PE處理明顯上調心肌細胞中TRIM10蛋白的表達水平。siRNA-TRIM10敲低內源性TRIM10表達后明顯減小PE誘導的心肌細胞體積，抑制ANP和BNP的mRNA的表達以及降低AKT和ERK1/2的磷酸化水平；而過表達TRIM10則呈現(xiàn)出與siRNA-TRIM10完全相反的結果。結論TRIM10可調節(jié)心肌細胞肥大，其作用可能與AKT和ERK信號相關。

泛素E3連接酶； TRIM10； 心肌細胞肥大

心肌肥厚是高血壓、瓣膜病和心肌梗塞等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥，是心臟應對血液動力學負荷增加、體液激素改變、內分泌激活及能量代謝障礙等發(fā)生的一種病理生理適應過程，最終導致心力衰竭[1]。心肌肥厚的主要病理改變包括心肌細胞體積增大、間質纖維化、肌小節(jié)排列紊亂、蛋白質合成增多和胚胎基因表達增高[2]。目前發(fā)現(xiàn)有多條信號通路參與心肌肥厚的發(fā)生，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路、磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-AKT通路、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC) 通路和鈣調磷酸酶通路等[3-6]。

心肌肥厚發(fā)生時表現(xiàn)為心肌蛋白質的合成增加或降解減少，其中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)是生物體內調控蛋白質降解的主要途徑，其主要由泛素激活酶E1、泛素轉運酶E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體組成。近年，許多研究及我們前期研究均證實E3連接酶如 atrogin-1、MuRF1、Nrdp1 等在心肌肥厚的發(fā)生中具有重要的調節(jié)作用[7-9]。TRIM家族是E3連接酶中的新成員，具有泛素連接酶的結構和功能，參與多種細胞的生物學進程，如細胞凋亡、細胞周期調控和病毒應答等[10]，目前發(fā)現(xiàn)該家族中多個成員與心血管疾病的發(fā)生密切相關。TRIM10是TRIM家族的成員之一，具有E3連接酶的功能，主要參與紅系細胞的終末分化，對造血功能、細胞凋亡均具有重要的調節(jié)作用[11-12]。但是，TRIM10在心肌肥厚中的作用不清楚。

本研究在培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細胞中，轉染siRNA-TRIM10以及過表達腺病毒Ad-TRIM10敲低或過表達TRIM10，觀察其對心肌細胞的大小、肥大標志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP) 和腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)的mRNA水平以及相關信號通路的影響，探討TRIM10在心肌肥厚發(fā)生中的作用及機制。

材 料 和 方 法

1動物

SD大鼠的新生乳鼠(出生后3 d內)購自北京華阜康實驗動物技術有限公司。

2主要試劑及儀器

苯腎上腺素(phenylephrine，PE)和TRIM10兔源抗體購自Sigma；siRNA-TRIM10 和siRNA-control購自GE Healthcare；過表達腺病毒Ad-TRIM10 和Ad-GFP購自漢恒生物公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；兔抗ERK1/2、 p-ERK1/2、AKT、p-AKT、GAPDH抗體及兔源II抗購自Cell Signaling Technology。

Nikon Labophot 2 顯微鏡購自Nikon；電泳儀、電轉儀購自Bio-Rad；Western blot顯影儀購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；實時熒光定量PCR儀購自Life Technologies；酶標儀購自BioTek。

3主要方法

3.1細胞轉染 原代心肌細胞貼壁20 h后，用Lipofectamine 2000轉染siRNA-TRIM10(50 nmol/L，1∶100)敲低TRIMIO表達或用腺病毒Ad-TRIM10(50 nmol/L，1∶100)感染過表達內源性TRIM10；相應的對照組分別轉染siRNA-control和Ad-GFP。同時換無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，然后給予PE(30 μmol/L)處理24 h。收集細胞提取總RNA和蛋白等用于后續(xù)實驗。

3.2細胞α-actinin熒光染色 用4%多聚甲醛固定心肌細胞15 min，然后用PBS清洗3 min、3次，洗完后再用10 g/L的血清白蛋白溶液室溫封閉30 min。PBS 清洗3 min、3次， I 抗4 ℃孵育過夜(α-actinin， 1∶2 000稀釋)后用PBS洗去(5 min、3次)。加入II抗室溫避光孵育1 h，然后用含有DAPI的防熒光淬滅劑封片，避光放置數(shù)分鐘之后即可在熒光顯微鏡下采集圖像。

3.3Western blot實驗 用蛋白RIPA裂解液(80～100 μL)冰上裂解細胞15 min，然后用細胞刮子收集至1.5 mL EP管中。用細胞破碎儀裂解細胞后離心(4 ℃、12 000 r/min)10 min，吸取上清。按照BCA法測蛋白濃度。取40～50 μg總蛋白進行SDS-PAGE，然后將蛋白電轉至PVDF 膜。用5% 脫脂牛奶室溫封閉膜1 h， I 抗4 ℃孵育過夜，次日洗滌10 min、3 次。用 II 抗孵育膜1 h后，ECL顯影。

3.4實時熒光定量PCR實驗 用Trizol 裂解法提取心肌細胞總RNA。取1～2 μg逆轉錄合成cDNA第一鏈，然后取2 μL cDNA模板、上下游引物各1 μL、SYBR 10 μL，添加dd H2O 6 μL至總體積20 μL，進行反應。用實時熒光定量PCR儀測定心肌肥厚標志物ANP和BNP的mRNA水平。引物購自上海生工生物技術有限公司，序列如表1所示。

表1 用于實時熒光定量PCR實驗的引物序列

4統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件進行。每個指標進行3次以上獨立重復實驗，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，均數(shù)組間比較采用單因素方差分析方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1PE處理上調心肌細胞中TRIM10蛋白的表達

PE處理原代心肌細胞24 h后， Western blot檢測顯示TRIM10的蛋白水平比對照組明顯增高，見圖1。

2敲低TRIM10抑制PE誘導的心肌細胞肥大

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-TRIM10組的TRIM10蛋白水平比siRNA-control組明顯降低，DE可明顯增加TRIM10的蛋白水平，siRNA-TRIM10可顯著降低PE誘導的TRIM10表達；免疫熒光染色結果顯示，與siRNA-control組相比，siRNA-TRIM10轉染后可明顯抑制PE誘導的心肌細胞體積增大；RT-qPCR測定顯示，與siRNA-control組相比，siRNA-TRIM10轉染后可明顯抑制PE誘導的肥大標志物ANP和BNP mRNA的表達，見圖2。

3過表達TRIM10促進PE誘導的心肌細胞肥大

Western blot 結果表明Ad-TRIM10感染后的TRIM10蛋白水平比Ad-GFP組明顯升高，PE處理的Ad-TRIM10感染細胞中TRIM10水平較PE處理空載組進一步升高；免疫熒光染色顯示，與Ad-GFP組相比Ad-TRIM10轉染后可明顯增大PE誘導的心肌細胞直徑；RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)與Ad-GFP組相比，Ad-TRIM10感染后可明顯促進PE誘導的肥大標志物ANP和BNP mRNA的表達，見圖3。

Figure 1. PE treatment up-regulated TRIM10 protein expression in the cardiomyocytes. The protein level of TRIM10 was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1PE處理上調心肌細胞中TRIM10的蛋白表達

Figure 2. siRNA-TRIM10 inhibited the cardiomyocyte size, the ANP and BNP mRNA expression induced by PE-treatment. The cardiomyocytes were transfected with siRNA-TRIM10 or siRNA-control for 24 h, and then treated with PE for 24 h. A: the protein level of TRIM10 was determined by Western blot; B: the cardiomyocyte size was measured by α-actinin staining (×200); C: the mRNA levels of cardiac hypertrophy markers ANP and BNP were detected by RT-qPCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vssiRNA-control (vehicle);#P<0.05vssiRNA-control (PE).

圖2敲低TRIM10抑制PE誘導的心肌細胞體積增大和肥大標志物ANP和BNP的mRNA的表達

Figure 3. Ad-TRIM10 increased cardiomyocyte size, ANP and BNP mRNA expression induced by PE-treatment. The cardiomyocytes were infected with Ad-TRIM10 or Ad-GFP for 24 h, and then treated with PE for 24 h. A: the protein level of TRIM10 was determined by Western blot; B: the cardiomyocyte size was measured by α-actinin staining (×200); C: the mRNA levels of cardiac hypertrophy markers ANP and BNP were detected by RT-qPCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsAd-GFP (vehicle);#P<0.05vsAd-GFP (PE).

圖3過表達TRIM10促進PE誘導的心肌細胞體積增大和肥大標志物ANP和BNPmRNA的表達

4TRIM10參與調控AKT和ERK1/2信號通路

Western blot 結果顯示，PE可顯著升高心肌細胞中AKT和ERK1/2的磷酸化水平(P<0.05)，敲低TRIM10后，可明顯抑制PE誘導的AKT和ERK1/2的磷酸化水平。相反，過表達TRIM10后則進一步升高PE誘導的AKT和ERK1/2的磷酸化水平，見圖4。

討 論

TRIM家族在調節(jié)細胞增殖、分化、個體發(fā)育、腫瘤及細胞凋亡等多種生物學過程發(fā)揮重要的作用。比如TRIM45可與膜轉運家族蛋白SLC25A3以及熱休克家族蛋白DNAJB6發(fā)生相互作用，共同阻斷鈣調磷酸酶介導的心肌肥厚[13]；TRIM7可通過調節(jié)c-Jun/AP-1 復合物，激活Ras系統(tǒng)進而調節(jié)細胞增殖和凋亡，促進肺癌的發(fā)生[14]。TRIM10具有TRIM家族所共有的結構域，包括鋅指結構域(RING finger)、1個B-box以及1個coiled-coil結構域。研究表明TRIM10可調節(jié)胚胎發(fā)育、紅系細胞生成以及成年小鼠的紅細胞分化與增殖[12]。

Figure 4. The effect of siRNA-TRIM10 and Ad-TRIM10 on the expression of p-ERK1/2 and p-AKT. A: the levels of p-ERK1/2 and p-AKT were determined by Western blot after transfected with siRNA-TRIM10 or siRNA-control; B: the levels of p-ERK1/2 and p-AKT were determined by Western blot after transfected with Ad-TRIM10 or Ad-GFP. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vssiRNA-control (vehicle);#P<0.05vssiRNA-control (PE)；△P<0.05vsAd-GFP (vehicle);$P<0.05vsAd-GFP (PE).

圖4siRNA-TRIM10和Ad-TRIM10對PE誘導的ERK1/2和AKT的磷酸化水平的影響

本研究結果顯示敲低TRIM10后可抑制PE誘導的細胞體積增大、降低肥大標志物的表達，而過表達TRIM10則具有相反的效應，說明TRIM10具有促進心肌肥大的作用。AKT和ERK信號激活是導致心肌細胞蛋白質合成增加、細胞肥大的一個重要機制[15]，因此本研究進一步探討了TRIM10對以上信號的影響。結果發(fā)現(xiàn)敲低TRIM10 后可明顯降低AKT和ERK1/2 的磷酸化水平，過表達TRIM10則相反，提示TRIM10可能是通過激活AKT和ERK1/2信號轉導通路來誘導心肌細胞肥大的。

本研究為深入了解TRIM10的生物學功能提供了新的依據(jù)，但是仍需要在基因敲除和過表達小鼠模型中進一步驗證TRIM10的作用及其分子機制。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

DUSP9調控雌性小鼠多能干細胞的DNA低甲基化

囊胚來源的胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)和性腺來源的胚胎生殖細胞(embryonic germ cells, EGCs)代表了多能干細胞系的兩個經典類型，但它們的分子等價性仍未被完全了解。Choi等對遺傳背景相同的ESCs和EGCs細胞系之間的全基因組甲基化模式進行比較，從而確定它們表觀遺傳的相似性和差異性。令人驚訝的是，他們發(fā)現(xiàn)真正驅動ESCs和EGCs甲基化模式的是性別而非細胞類型。細胞融合實驗進一步表明，X染色體與常染色體的比值決定了甲基化水平，雌性雜交細胞表現(xiàn)為低甲基化，而雄性雜交細胞表現(xiàn)為高甲基化。他們還發(fā)現(xiàn)，與雄性ESCs 相比，雌性ESCs中X連鎖的MAPK磷酸酶DUSP9上調，同時雌性ESCs中DUSP9的雜合性缺失導致了雄性樣甲基化水平。然而，雄性和雌性囊胚均有相似的低甲基化水平，表明在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了性別特異性甲基化差異。總的來說，該研究表明，相同性別的ESCs和EGCs具有表觀遺傳相似性，同時確認了DUSP9是雌性特異性低甲基化的一個調控因子。

Cell Stem Cell, 2017, 20(5):706-719.e7(范沖竹)

RoleofubiquitinE3ligaseTRIM10inregulatingcardiomyocytehypertrophy

ZHOU Chun-yu, LI Nan-nan, WANG Hong-xia, TIAN Cui, LI Hui-hua

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China.E-mail:hhli1935@aliyun.com)

AIM: To explore the role of ubiquitin E3 ligase tripartite motif 10 (TRIM10) in the development of cardiomyocyte hypertrophy.METHODSPrimary cultured neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs) were infected with siRNA-TRIM10， siRNA-control， Ad-TRIM10 or Ad-GFP for 24 h respectively, and then stimulated with phenylephrine (PE) for additional 24 h. The protein levels of TRIM10, AKT and ERK1/2 were determined by Western blot. The size of the NRCMs was measured by immunofluorescence staining. The mRNA expression of atrial natriuretic peptide (ANP) and brain natriuretic peptide (BNP) was detected by RT-qPCR.RESULTSCompared with the control, PE treatment significantly increased the protein expression of TRIM10. Moreover, transfection of NRCMs with siRNA-TRIM10 markedly inhibited cardiomyocyte size, the mRNA expression of ANP and BNP, and the phosphorylation levels of AKT and ERK as compared with siRNA-control after PE treatment. In contrast, overexpression of TRIM10 significantly enhanced PE-induced hypertrophic effect on NRCMs above.CONCLUSIONTRIM10 regulates cardiomyocyte hypertrophy partially through AKT and ERK signaling pathways.

Ubiquitin E3 ligase; TRIM10; Cardiomyocyte hypertrophy

R54； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.009

1000- 4718(2017)10- 1788- 06

2017- 01- 20

2017- 05- 19

國家自然科學基金重點項目(No. 81330003)

△通訊作者 Tel: 010-83950092； E-mail: hhli1935@aliyun.com

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