張 灼， 朱杰寧， 肖 珍， 胡志琴， 唐春梅， 符永恒， 林秋雄， 吳書林， 杜 昶， 單志新△

(1華南理工大學醫(yī)學院， 廣東 廣州510632； 2 廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院， 廣東省醫(yī)學科學院, 廣東 廣州 510080)

微小RNA-199a-5p通過靶向SIRT1促進心肌纖維化相關基因表達*

張 灼1,2， 朱杰寧2， 肖 珍2， 胡志琴2， 唐春梅2， 符永恒2， 林秋雄2， 吳書林2， 杜 昶1， 單志新1,2△

(1華南理工大學醫(yī)學院， 廣東 廣州510632；2廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院， 廣東省醫(yī)學科學院, 廣東 廣州 510080)

目的研究微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)對心肌成纖維細胞中纖維化相關基因表達的調(diào)控作用及其可能作用的靶基因。方法原代分離并體外培養(yǎng)成體C57BL/6小鼠心肌成纖維細胞；雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-199a-5p與潛在靶基因沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1) 3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)的結(jié)合作用；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法分別檢測SIRT1以及纖維化標志物膠原蛋白(Col)1a1、Col3a1和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表達。結(jié)果在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的小鼠心肌成纖維細胞中，Col1a1、Col3a1和α-SMA的表達增強，miR-199a-5p表達上調(diào)。在心肌成纖維細胞中過表達miR-199a-5p可以增強Col1a1、Col3a1和α-SMA的表達。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-199a-5p與SIRT1 3’-UTR有結(jié)合作用。RT-qPCR和Western blot結(jié)果證實miR-199a-5p可在轉(zhuǎn)錄水平抑制SIRT1表達。過表達miR-199a-5p和沉默SIRT1均能一致性促進心肌成纖維細胞中Col1a1、Col3a1和α-SMA的表達。抑制AngⅡ誘導的小鼠心肌成纖維細胞中NF-κB激活，可顯著降低miR-199a-5p表達。結(jié)論SIRT1是miR-199a-5p的作用靶基因，并介導miR-199a-5p促進纖維化標志物Col1a1、Col3a1和α-SMA的表達。

心肌纖維化； 成纖維細胞； 微小RNA-199a-5p； 沉默信息調(diào)節(jié)因子1

心肌纖維化是一系列常見急性和慢性心肌疾病的特征之一[1]，其主要的病理特征為過度細胞外基質(zhì)沉積，最終導致心肌僵硬、心臟重構乃至心力衰竭[2]。研究表明，細胞外基質(zhì)不僅充當著細胞的支撐組織結(jié)構，同時扮演著將促進細胞生長、遷移和分化的生長因子及生物活性分子與細胞隔絕的角色[3]。過多的膠原和細胞外基質(zhì)沉積會損害心肌細胞和心肌成纖維細胞的正常功能。心肌成纖維細胞受外界刺激后會向肌成纖維細胞分化，分泌富含膠原的細胞外基質(zhì)和促纖維化細胞因子(如TGF-β1)[4]。總的來說，目前對心肌纖維化的研究還不夠深入，相關的病理機理仍不清楚，尚無有效的針對心肌纖維化的治療方法。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類大約22個堿基組成的RNA。其主要作用機制是與靶基因mRNA 3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region， 3’-UTR)序列相互識別配對，通過調(diào)節(jié)靶基因的脫腺苷化、降解目標基因、抑制目標基因的轉(zhuǎn)錄等途徑，來實現(xiàn)對靶基因表達的調(diào)控[5]。心肌細胞過度分泌細胞外基質(zhì)是導致心肌纖維化的一個重要因素，已有報道多種miRNA參與調(diào)控了心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變的過程。例如，通過過表達miR-24前體方式上調(diào)心肌成纖維細胞中miR-24表達，可抑制纖維化相關基因表達，同時抑制心肌成纖維細胞移動和向肌成纖維細胞分化[6]。而miR-133a/miR-30c、miR-29、miR-214-3p和miR-208a分別通過作用靶基因CTGF、MMP-2、EZH1/2和TGF-β1，發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用[7-11]。

本文將研究miR-199a-5p在血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)處理的小鼠心肌成纖維細胞中的表達及其對纖維化相關基因表達的調(diào)控作用，旨在明確miR-199a-5p的作用靶基因，以及參與Ang II調(diào)控小鼠心肌成纖維細胞miR-199a-5p表達的信號通路。

材 料 和 方 法

1主要試劑

限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoR I、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及4×SDS loading buffer(Invitrogen)；2×SYBR Green Mix和無RNA酶水(TaKaRa)；miR-199a-5p mimic和沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator，SIRT1) siRNA(廣州銳博)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天)； GAPDH抗體、膠原蛋白(collagen，Col)1a1抗體和Col3a1抗體(Protein Technology)；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Abcam)；SIRT1、P65和p-P65抗體(Sigma)；蛋白Marker(Fermentas)；PVDF膜(Whatman)；ECL發(fā)光液(Millipore)；DMEM/F12細胞培養(yǎng)基(HyClone)；特級澳洲胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco)。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

2主要方法

2.1小鼠心肌成纖維細胞原代分離培養(yǎng)和處理 將出生3～4周SPF級C57BL/6小鼠心臟以0.25% EDTA-胰蛋白酶消化法分離細胞。離心棄去上清液，沉淀用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸浮，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，再置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，更換1次完全培養(yǎng)基。傳代到第3代分別將100 nmol/L 無序siRNA對照(scramble)、miR-199a-5p mimic或SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染到小鼠心肌成纖維細胞中，24 h后結(jié)束實驗。

2.2RT-qPCR檢測SIRT1以及纖維化標志物Col1a1、Col3a1和α-SMA表達情況 用Trizol法提取心肌成纖維細胞總RNA。取1.5 μg總RNA，加入5×逆轉(zhuǎn)錄試劑4 μL(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，用Oligo(dT)15和random primers逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,用于檢測SIRT1、Col1a1、Col3a1及α-SMA的 mRNA水平(GAPDH為內(nèi)參照)。取1.0 μg總RNA，用miR-199a-5p特異的逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，用于檢測miR-199a-5p水平(U6為內(nèi)參照)。所用引物序列見表1。在ViiA 7 Quantitative PCR System(Applied Biosystems)進行PCR反應和結(jié)果分析。以2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

2.3Western blot法檢測蛋白水平 收集處理后的心肌成纖維細胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清蛋白質(zhì)定量后分裝，加入4×SDS上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別用相應的Ⅰ抗Col1a1(1∶1 000)、Col3a1(1∶5 000)、α-SMA(1∶5 000)和SIRT1(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH(1∶5 000)為內(nèi)參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse; RT: reverse transcription.

2.4雙螢光素酶報告實驗驗證miR-199a-5p與SIRT1 3’-UTR的結(jié)合作用 參照我們已報道方法[11]分別構建包含miR-199a-5p潛在結(jié)合序列的SIRT1 3’-UTR重組螢光素酶報告質(zhì)粒pGL3-SIRT1-451-457及包含結(jié)合序列突變的重組質(zhì)粒pGL3-SIRT1-451-457-MUT。將HEK293細胞(細胞密度約為每孔1×105)轉(zhuǎn)染200 ng重組螢光素酶報告質(zhì)粒、100 nmol miR-199a-5p mimic及10 ng pRL-TK(表達海腎螢光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染后24 h，測定螢火蟲螢光素酶及海腎螢光素酶的發(fā)光強度，兩者比值的變化可反映miR-199a-5p與SIRT1 3’-UTR結(jié)合的能力。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1miR-199a-5p在AngII誘導的小鼠心肌成纖維細胞中的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示，用Ang II處理的小鼠心肌成纖維細胞中，纖維化標志物Col1a1、Col3a1和α-SMA mRNA水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，同時miR-199a-5p的水平也顯著升高(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. miR-199a-5p was up-regulated in AngⅡ-treated car-diac fibroblasts. A： the mRNA expression levels of Col1a1， Col3a1 and α-SMA in Ang Ⅱ-treated cardiac fibroblasts were detected by RT-qPCR； B： the expression of miR-199a-5p was detected in cardiac fibroblasts treated with AngⅡ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1miR-199a-5p在AngII誘導的小鼠心肌成纖維細胞中表達增強

2miR-199a-5p促進小鼠心肌成纖維細胞中纖維化相關蛋白的表達

為了明確過表達miR-199a-5p對纖維化相關蛋白表達的影響，我們將100 nmol miR-199a-5p mimic轉(zhuǎn)染入C57BL/6小鼠來源的心肌成纖維細胞中。RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic的小鼠心肌成纖維細胞中miR-199a-5p水平顯著升高(P<0.01)，見圖2A。Western blot檢測顯示，miR-199a-5p mimic過表達的小鼠心肌成纖維細胞中，纖維化相關蛋白Col1a1、Col3a1和α-SMA表達明顯增強(P<0.05或P<0.01)，見圖2B。

Figure 2. miR-199a-5p enhanced the expression of fibrosis-related proteins in cardiac fibroblasts. A： the expression of miR-199a-5p was determined by RT-qPCR； B： the expression of fibrosis-related proteins was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscramble group.

圖2miR-199a-5p促進小鼠心肌成纖維細胞中纖維化相關蛋白的表達

3SIRT1介導miR-199a-5p促進小鼠心肌成纖維細胞中纖維化相關蛋白的表達

基于miRDB(www.mirdb.org)及TargetScan(www.targetscan.org)的序列分析提示，SIRT1 3’-UTR的451～457堿基可能是miR-199a-5p的結(jié)合位點。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-199a-5p可特異地結(jié)合到SIRT1 3’-UTR的451～457位點，而突變結(jié)合區(qū)域的序列后，miR-199a-5p就不能與SIRT1 3’-UTR結(jié)合，見圖3A。RT-qPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在miR-199a-5p mimic過表達的小鼠心肌成纖維細胞中，SIRT1的mRNA和蛋白表達均顯著降低，提示miR-199a-5p可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控SIRT1的表達，見圖3B。Western blot檢測證實，SIRT1 siRNA和miR-199a-5p mimic可顯著降低小鼠心肌成纖維細胞中SIRT1表達，同時能一致性地升高纖維化相關蛋白Col1a1、Col3a1和α-SMA表達，見圖3C。

4NF-κB信號分子介導AngII上調(diào)心肌成纖維細胞中miR-199a-5p表達

Western blot檢測顯示，Ang II處理小鼠心肌成纖維細胞10 min和20 min后，細胞中磷酸化NF-κB p65水平顯著升高，見圖4A。RT-qPCR結(jié)果顯示，利用NF-κB抑制劑JSH23和QNZ可有效抑制Ang II上調(diào)的小鼠心肌成纖維細胞miR-199a-5p表達，見圖4B。同樣，采用RNA干擾技術沉默NF-κB p65的表達，也可有效抑制Ang II上調(diào)的小鼠心肌成纖維細胞miR-199a-5p表達，見圖4C。

討 論

近期研究表明，miR-199a-5p在發(fā)生房顫、心肌梗死和心肌肥厚的小鼠心肌中表達上調(diào)[12-15]。機制研究表明，過氧化物酶體增殖物活化受體協(xié)同刺激因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是miR-199a-5p的作用靶點，PGC-1α在miR-199a-5p修飾的H9c2細胞中表達降低，導致ATP能量代謝受損[16]。在糖尿病腎病中的研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖可促進miR-199a-5p表達，進而激活NF-κB信號分子，促進腎小球膜細胞的炎癥和纖維化[17]。但miR-199a-5p在心肌纖維中的作用機制尚未完全闡明。

在本文中，我們證實miR-199a-5p在Ang II誘導的小鼠心肌成纖維細胞中表達升高。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炋崾緈iR-199a-5p能與SIRT1 3’-UTR特異性結(jié)合，并證實miR-199a-5p可在mRNA和蛋白水平抑制心肌成纖維細胞中SIRT1表達，說明miR-199a-5p在轉(zhuǎn)錄水平抑制SIRT1表達。進一步研究表明，miR-199a-5p和SIRT1 siRNA可一致性地促進心肌成纖維細胞纖維化相關基因表達。因此，上述結(jié)果證實SIRT1是miR-199a-5p的靶基因，并介導了miR-199a-5p促進心肌成纖維細胞中纖維化相關基因表達的作用。本文與以往在神經(jīng)元[18]和內(nèi)皮細胞[19]中的研究發(fā)現(xiàn)SIRT1介導miR-199a-5p發(fā)揮生物學作用的報道一致。

Figure 3. miR-199a-5p andSIRT1 siRNA increased the expression of fibrosis-related proteins in cardiac fibroblasts. A： dual-luciferase assay； B： SIRT1 mRNA and protein expression in cardiac fibroblasts transfected with miR-199a-5p mimic； C： the protein expression of Col1a1, Col3a1, α-SMA and SIRT1 in cardiac fibroblasts transfected with miR-199a-5p mimic orSIRT1 siRNA. Mean±SEM.n=3.#P<0.05vsPGL3-promoter group；*P<0.05,**P<0.01vsscramble group.

圖3SIRT1介導miR-199a-5p促進小鼠心肌成纖維細胞中纖維化相關蛋白的表達

SIRT1被稱為長壽蛋白，其所在的sirtuin家族被證實具有延緩細胞衰老的功能[20]。這一家族包括SIRT1～7，具有明顯的細胞內(nèi)分布特異性，其中SIRT1主要分布在細胞核中，在細胞質(zhì)和細胞膜上只有少量分布[21]。研究顯示，SIRT1能夠調(diào)節(jié)老鼠心肌細胞生長、存活，在SIRT1表達上調(diào)時，能夠延緩老鼠的衰老[22]；白藜蘆醇可激活SIRT1減輕外界刺激，延長細胞壽命，降低心肌成纖維細胞中纖維化相關基因的表達[23-24]。本文結(jié)果表明，SIRT1在Ang II誘導的小鼠心肌成纖維細胞中特異性地表達下調(diào)，而抑制心肌成纖維細胞中SIRT1表達可增強纖維化相關基因的表達。本文結(jié)果與以往關于SIRT1具有抑制心肌纖維化作用的報道一致[24]。

Figure 4. NF-κB signaling pathway mediated the up-regulation of miR-199a-5p in Ang II-induced cardiac fibroblasts. A： activation of NF-κB signaling in AngⅡ-treated cardiac fibroblasts detected by Western bolt； B： the expression of miR-199a-5p in AngⅡ-induced cardiac fibroblasts pre-treated with NF-κB inhibitor JSH23 or QNZ； C： the expression of miR-199a-5p in cardiac fibroblasts transfected with NF-κB p65 siRNA (si-NF-κB p65). Mean±SEM.n=3.**P<0.01vs0 min；△△P<0.01vscontrol；#P<0.05vsAng II；▲▲P<0.01vsscramble.

圖4NF-κB信號分子介導AngII上調(diào)miR-199a-5p表達

我們發(fā)現(xiàn)在Ang II處理的心肌成纖維細胞中miR-199a-5p表達上調(diào)，并伴隨NF-κB信號分子激活。利用NF-κB抑制劑(JSH23和QNZ)或沉默NF-κB p65能夠顯著降低miR-199a-5p的表達。因此，NF-κB信號分子在Ang II誘導的心肌成纖維細胞中激活，并介導了Ang II誘導的miR-199a-5p表達上調(diào)。

綜上所述，本文證實Ang II通過激活NF-κB信號分子，增加心肌成纖維細胞中miR-199a-5p表達；SIRT1是miR-199a-5p的作用靶基因，介導miR-199a-5p發(fā)揮促進心肌成纖維細胞中纖維化相關基因表達的作用。在后續(xù)研究中，我們將在整體動物水平，進一步明確miR-199a-5p對SIRT1表達和對心肌纖維化的調(diào)控作用。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

miR-199a-5penhancesexpressionofmyocardialfibrosis-relatedgenesbytargetingSIRT1

ZHANG Zhuo1,2, ZHU Jie-ning2, XIAO Zhen2, HU Zhi-qin2, TANG Chun-mei2, FU Yong-heng2, LIN Qiu-xiong2, WU Shu-lin2, DU Chang1, SHAN Zhi-xin1,2

(1SchoolofMedicine,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510632,China;2GuangdongCardiovascularinstitute,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:zhixinshan@aliyun.com)

AIM: To investigate the role of microRNA (miR)-199a-5p in myocardial fibrosis and the potential target of miR-199a-5p.METHODSC57BL/6 mouse cardiac fibroblasts were isolated and cultured for cellular experimental study. Dual-luciferase reporter assay was performed to confirm the interaction between miR-199a-5p and the 3’-untranslated region (3’-UTR) of silent information regulator 1 (SIRT1). The expression of SIRT1 and fibrosis markers collagen (Col) 1a1, Col3a1 and α-smooth muscle actin (α-SMA) at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively.RESULTSThe expression levels of miR-199a-5p， Col1a1, Col3a1 and α-SMA were markedly increased in cardiac fibroblasts after treatment with angiotensin Ⅱ (AngⅡ). The over-expression of miR-199a-5p significantly increased the expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA in cardiac fibroblasts. Moreover, the results of dual-luciferase reporter assay revealed that miR-199a-5p interacted with the 3’-UTR ofSIRT1. miR-199a-5p inhibited SIRT1 expression at post-transcriptional level. Meanwhile, miR-199a-5p mimic, in parallel toSIRT1 siRNA, inhibited SIRT1 expression, increased the expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA in cardiac fibroblasts. Inactivation of NF-κB signaling contributed to the decrease in miR-199a-5p in Ang II-treated cardiac fibroblasts.CONCLUSIONSIRT1 is a target gene of miR-199a-5p, which mediates the pro-fibrotic effect of miR-199a-5p on cardiac fibroblasts.

Myocardial fibrosis; Fibroblasts; MicroRNA-199a-5p; Silent information regulator 1

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.008

1000- 4718(2017)10- 1781- 07

2017- 03- 07

2017- 05- 24

國家自然科學基金資助項目(No. 81470439； No. 91649109; No. 81770264)；廣東省醫(yī)學科學研究項目(No. 2014A030313635； No. 2013B022000083； No. A2015187)

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