李萍萍， 程 景， 吳學(xué)進， 萬 瑤

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南海口 571101;2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱 150090)

楊桃屬酢漿草科五斂子屬(AverrhoacarambolaL.)植物的果實，主要種植在熱帶和亞熱帶地區(qū)，是典型的熱帶水果。其成熟果實甜而多汁、略酸，果肉富含類胡蘿卜素、維生素C、多酚等，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[1]。由于熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境高溫高濕、病蟲害較多[2]，為提高產(chǎn)量，目前普遍采用農(nóng)藥進行防治。雖然農(nóng)藥對于防治農(nóng)作物的病蟲害起著積極的作用，但是農(nóng)藥的不合理使用會危害人們的身體健康甚至生命。歐盟規(guī)定了楊桃中406種農(nóng)藥的最大殘留限量值(MRL)。同時國際食品法典(CAC)、美國、日本等國家或組織均對楊桃中的農(nóng)藥殘留設(shè)定了嚴(yán)格的最大殘留限量值。

農(nóng)藥殘留的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3]、氣相色譜法(GC)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[6]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[7 - 8]。其中，GC-MS/MS法不僅能夠同時檢測多種農(nóng)藥，且定性效果好，不易出現(xiàn)假陽性。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留樣品前處理技術(shù)普遍采用有機溶劑提取，再經(jīng)過固相萃取小柱凈化，實驗步驟繁瑣，且使用大量有毒試劑。QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe)技術(shù)具有簡單、快速、便宜、試劑用量少、適應(yīng)范圍廣等特點，已被廣泛用于果蔬中的農(nóng)藥殘留檢測[9 - 10]。本研究采用1%乙酸乙腈提取和QuEChERS凈化，建立了QuEChERS-氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜檢測楊桃中37種農(nóng)藥殘留的方法。該方法涵蓋了有機磷類、有機氯類和擬除蟲菊酯類等農(nóng)藥，并且采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量，降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了分析的靈敏度，可用于楊桃中農(nóng)藥殘留的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

Agilent 7890A型氣相色譜儀-Agilent 7000A 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent 公司)；Trace TR-5毛細管色譜柱(美國，Thermo公司)；高速離心機(美國，Scientific Industries)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本，東京理化器械獨資工廠)；旋渦混合器(德國，IKA公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：敵敵畏、乙酰甲胺磷、氧樂果、滅線磷、治螟磷、α-666、β-666、γ-666、五氯硝基苯、特丁硫磷、地蟲硫磷、百菌清、δ-666、乙烯菌核利、甲基對硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷、三唑酮、腐霉利、硫環(huán)磷、苯線磷、三唑磷、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、三氯殺螨醇、伏殺硫磷、氯氟氰菊酯、噠螨靈、蠅毒磷、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、氰戊菊酯、苯醚甲環(huán)唑、溴氰菊酯(1 000 μg/mL，天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心)。乙腈、正己烷(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；氯化鈉、乙酸、乙酸鈉、無水硫酸鎂(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸鈉(分析純，西隴化工股份有限公司)；檸檬酸氫鈉(分析純，阿拉丁公司)；N-丙基乙二胺粉(PSA)、C18粉均購自美國Agilent公司。實驗用超純水由美國Millipore公司Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)制備。

實驗所用楊桃樣品均來自海口市場，隨機采樣。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：各取1 mL(1 000 μg/mL)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于-18 ℃冰箱中備用。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：各取1.0 mL 上述單個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?；|(zhì)校準(zhǔn)工作溶液：精確稱取5.00 g空白楊桃樣品各5份，按1.3節(jié)方法進行樣品處理(蒸干未定容)后，分別加入0.01、0.02、0.05、0.10和0.50 mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用正己烷定容到2 mL，分別配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1和0.5 mg/L的基質(zhì)校準(zhǔn)系列工作溶液。按照1.4節(jié)所述GC-MS/MS進樣條件，以待測物定量離子的峰面積y對質(zhì)量濃度x(mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到37種農(nóng)藥的線性方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3 樣品前處理

稱取代表性樣品500 g于食品料理機中攪碎、混勻，密封，作為試樣，標(biāo)明標(biāo)記，于-20 ℃冰箱中保存，備用。將楊桃樣品置于室溫解凍后，立刻準(zhǔn)確稱取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，依次加入5 mL 1%乙酸乙腈、4 g無水硫酸鎂、1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉和0.5 g檸檬酸氫鈉，加蓋迅速搖勻，水平震蕩提取2 min后,6 000 r/min離心3 min。取3 mL上清夜轉(zhuǎn)移至含有150 mg PSA、150 mg C18、900 mg無水硫酸鎂的15 mL具塞離心管中，水平震蕩2 min,6 000 r/min離心3 min,取1 mL上清液于50 mL雞心瓶中，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用正己烷定容至2 mL，經(jīng)過0.22 μm尼龍濾膜過濾后，供GC-MS/MS檢測。

1.4 氣相色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Trace TR-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度240 ℃；進樣方式：不分流進樣；恒流模式：流速1.0 mL/min；載氣：He(≥99.999%)；柱溫采用程序升溫，初始溫度：70 ℃，保持2 min，以25 ℃/min的速度上升到150 ℃，以3 ℃/min的速度上升到200 ℃，再以8 ℃/min的速度上升到280 ℃，保持10 min，共運行41.8 min,進樣體積為1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；碰撞氣流速：氮氣1.5 mL/min,氦氣2.25 mL/min；質(zhì)譜分析模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；37種農(nóng)藥的監(jiān)測離子對、碰撞能量(CE)、保留時間參數(shù)、檢出限、線性相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 37種農(nóng)藥殘留量的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定參數(shù)

(續(xù)表1)

No.CompoundtR(min)CE(eV)Mass transition(m/z)LOD(mg/kg)Correlationcoefficien8γ-66617.0210;20219/183*;219/1450.0010.99839Quintozene16.6415;10295/237*;295/2650.0010.992410Terbufos16.9010;15231/175*;231/1570.0020.998611Fonofos17.2420;5246/109*;246/1370.0010.999312Chlorothalonil18.1035;20;266/133*;266/231;0.0030.996913δ-66618.8910;15219/183*;181/1450.0010.992914Vinclozolin20.1210;10285/212*;285/1780.0010.998815Parathion-methyl20.3910;10263/109*;125/790.0020.994516Chlorpyrifos22.4615;10314/258*;314/2860.0010.993217Fenthion22.8215;15278/109*;278/1690.0010.991718Parathion22.9711;13109/81*;291/109;0.0020.993919Triazolone23.065;15208/181*;208/1270.0020.993220Procymidone24.9710;10283/96*;283/2550.0010.994721Phosfolan24.8822;6255/140*;255/227;0.0020.996522Fenamiphos26.208;18303.1/195.1*;303.1/154.10.0030.998323Triazophos28.6610;25257/162*;257/1190.0020.994524Bifenthrin30.3925;15181/165*;181/1660.0010.991725Fenpropathrin30.7610;25265/210*;265/890.0010.993426Dicofol31.0215;10250/139*;250/215;0.0030.992827Phosalone31.5915;5182/111*;182/138;0.0030.993628Cyhalothrin31.5531.7913;10197/141*;208/1810.0020.994929Pyridaben33.4225;15147/117*;147/1320.0010.993530Coumaphos33.4920;10362/109*;362/2260.0030.996231Cyfluthrin34.0334.2234.3334.4125;25206/151*;206/177;0.0020.995932Cypermethrin34.6034.8034.9035.0725;10181/152*;163/1270.0020.993633Flucythrinate35.0035.4125;5199/107*;199/1570.0010.992134Fluvalinate36.8737.0625;15181/152*;208/1810.0020.996535Fenvalerate36.8037.3612;26419.1/167.1*;419.1/125.10.0020.991136Difenoconazole38.2338.4115;30323/265*;323/2020.0030.993537Deltamethrin38.4139.0313;13253/93*;253/1740.0010.9965

*quantitative transition;CE:collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將2 mg/L農(nóng)藥單標(biāo)溶液在m/z50～550范圍內(nèi)進行全掃描，通過NIST譜庫檢索確定每種農(nóng)藥的保留時間，然后根據(jù)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖選擇響應(yīng)值高、特征性強的離子作為母離子，然后對其進行產(chǎn)物離子掃描以獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子。通過優(yōu)化碰撞能量，選擇豐度值大、特征性強、靈敏度高的離子作為子離子。最后將兩對選定的母離子和子離子在MRM模式下進行檢測。優(yōu)化后各農(nóng)藥的母離子、子離子以及碰撞能量等質(zhì)譜條件見表1。

2.2 提取溶劑的選擇

乙腈、丙酮和乙酸乙酯是農(nóng)藥殘留分析最常用的提取溶劑。在空白楊桃樣品中添加0.5 mg/kg 37種農(nóng)藥混標(biāo)，考察三種溶劑的提取效率。結(jié)果表明，丙酮極性較強，當(dāng)其作為提取溶劑時，37農(nóng)藥的回收率較高，但丙酮在提取農(nóng)藥的同時許多雜質(zhì)如葉綠素等也提取出來，增加了基質(zhì)干擾效應(yīng)及儀器的維護成本。乙酸乙酯作為提取溶劑時37種農(nóng)藥的回收率在60%～120%之間。與乙酸乙酯和丙酮相比，乙腈提取的色素、脂肪等非極性成分少，而且更容易通過鹽析作用去除樣品中的水分，減小了后續(xù)凈化的困難及儀器的維護成本。乙腈作為提取溶劑時農(nóng)藥的回收率優(yōu)于乙酸乙酯，在75%～120%之間。同時在溶劑中加入1%乙酸，提高了對堿性敏感農(nóng)藥如乙酰甲胺磷、百菌清等的回收率。故本實驗選用1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.3 提取鹽緩沖體系的優(yōu)化

本實驗考察了檸檬酸鹽緩沖體系(4 g無水硫酸鎂、1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉和0.5 g檸檬酸氫鈉)和乙酸鹽緩沖體系(6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉)對37種目標(biāo)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明檸檬酸鹽緩沖體系有較高的回收率和較好的重現(xiàn)性，故后續(xù)實驗選擇檸檬酸鹽緩沖體系萃取目標(biāo)農(nóng)藥。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

考察了不同添加量PSA和C18的凈化效果，以空白楊桃樣品為實驗樣品，37種農(nóng)藥的添加濃度均為0.5 mg/kg，PSA和C18的添加量分別為：(1)200 mg PSA；(2)150 mg PSA、150 mg C18；(3)200 mg C18；(4)400 mg PSA、400 mg C18；對目標(biāo)農(nóng)藥進行加標(biāo)回收率測定。實驗發(fā)現(xiàn)采用150 mg PSA、150 mg C18處理后溶液雖含有微量色素，但37種農(nóng)藥的平均回收率均在75%以上，表明采用該方法處理后凈化效果較為理想。這種現(xiàn)象是由于方法(4)凈化材料中含有較多的C18，吸附了樣品中更多的色素的同時也吸附了部分農(nóng)藥，因此為了提高實驗的準(zhǔn)確度以及降低實驗成本，故本實驗采用150 mg PSA、150 mg C18對樣品進行凈化。

2.5 萃取溶劑體積的優(yōu)化

實驗比較了不同體積(5.0、10.0、25.0 mL)的1%乙酸乙腈為萃取體系進行萃取，分別按照1.3樣品前處理方法、1.4節(jié)儀器條件上機檢測發(fā)現(xiàn)，隨著萃取溶劑體積的增加，各農(nóng)藥的萃取效果基本一致。因此本實驗選擇5 mL乙腈作為萃取溶劑。

2.6 樣品基質(zhì)效應(yīng)

利用不含農(nóng)藥的空白楊桃樣品提取液配制37種農(nóng)藥的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行測定，與同濃度的混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜響應(yīng)值進行比較，考察楊桃基質(zhì)對37種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的目標(biāo)農(nóng)藥定量離子質(zhì)譜峰面積與溶劑標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜峰面積相比增加或者減少的百分比來表示，以峰面積偏差15%來判定，偏差超過15%認(rèn)為存在顯著的基質(zhì)效應(yīng)[10]。對37種農(nóng)藥在楊桃樣品中的基質(zhì)效應(yīng)進行考察，結(jié)果表明37種農(nóng)藥存在顯著的基質(zhì)增強效應(yīng)。因此，為了降低基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，需要配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對定量結(jié)果進行校正，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.7 方法的線性范圍及檢出限

按1.2節(jié)方法配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1和0.5 mg/L的基質(zhì)校準(zhǔn)工作溶液，按1.4節(jié)方法規(guī)定的色譜條件進樣檢測，以目標(biāo)農(nóng)藥定量離子的峰面積y對質(zhì)量濃度x(mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時用最小二乘法進行線性回歸，得到37種農(nóng)藥的線性方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：在0.01～0.5 mg/L范圍內(nèi)，37種農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99(表1)，滿足殘留測定要求。

在空白樣品中添加質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.01 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3節(jié)方法前處理后上機測定做添加回收實驗，選擇目標(biāo)農(nóng)藥的響應(yīng)值達到3倍信噪比(S/N=3)的添加濃度為方法的檢出限。添加回收率在70%～120%之間，且響應(yīng)值達到10倍信噪比(S/N=10)的添加濃度為方法的定量限。實驗結(jié)果表明：該方法37種農(nóng)藥的檢出限均低于0.003 mg/kg(表1)，定量限均低于0.01 mg/kg，滿足國內(nèi)外殘留限量要求，結(jié)果見表1。

2.8 方法的回收率及精密度

在空白楊桃樣品中按0.01，0.05,0.5 mg/kg 3個水平進行添加回收實驗，每個水平重復(fù)5次，結(jié)果顯示，在0.01～0.5 mg/kg添加水平下，37種農(nóng)藥的平均回收率在72.9%～117%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤9.6%，說明本方法得到的數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠,滿足農(nóng)藥殘留測定要求。

3 結(jié)論

本研究運用分散固相萃取凈化-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析(QuEChERS-GC-MS/MS)，建立了同時測定楊桃中37種藥殘留量的方法。該方法在0.01～0.5 mg/kg添加水平下，37種農(nóng)藥的平均回收率在72.9%～117%之間，RSD≤9.6%，定量限低于0.01 mg/kg，可實現(xiàn)楊桃中敵敵畏等37種農(nóng)藥殘留的定性與定量檢測。