胡西洲， 彭西甜， 周有祥， 龔 艷， 夏 虹， 彭立軍， 胡定金

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(武漢)，湖北武漢 430064)

龍井茶作為中國十大名茶之一，有著1200多年歷史，按照傳統(tǒng)工藝在地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)范圍內(nèi)加工而成，它是一種具有“色綠、香郁、味醇、形美”的扁形綠茶。龍井茶地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)范圍僅限于西湖、錢塘和越州產(chǎn)區(qū)，其中尤以西湖產(chǎn)區(qū)的龍井茶最富盛名[1]。近年來，茶葉中摻雜、摻假、以假充真、以次充好的報道時有發(fā)生，因此，如何快速鑒別茶葉的真?zhèn)魏推焚|(zhì)優(yōu)劣顯得十分重要，也成為分析工作者研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2 - 3]。

鑒別西湖龍井主要通過辯“色綠”，聞“香郁”，品“味醇”，觀“形美”。盡管國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23776-2009)也對茶葉感官評審方法作了詳細(xì)規(guī)定，但評審結(jié)果容易受評審人員主觀判斷的影響。國內(nèi)外學(xué)者針對茶葉真實(shí)性鑒別提出了許多新思路和新方法，如液相色譜法[4 - 5]、氣相色譜法[6 - 7]、元素“指紋”分析[8]、近紅外光譜技術(shù)[9]、核磁共振波譜[10 - 11]、電子舌[12]和電子鼻[13]等為茶葉品質(zhì)真實(shí)性鑒定提供了豐富的選擇手段。

固相微萃取(SPME)作為一種新型的樣品前處理技術(shù)，具有簡便、高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的特點(diǎn)，適宜于香氣成分的分析[6 - 7]。保留指數(shù)(RI)是由Kovats于1958年首次提出，該指標(biāo)反映了化合物與固定相間相互作用，作為一種穩(wěn)定的色譜定性參數(shù)，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可用于化合物的有效鑒定[7]。本研究采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)結(jié)合保留指數(shù)法快速分析了不同區(qū)域龍井茶的香氣成分，并篩選得到特征香氣組分并用于不同產(chǎn)地龍井茶的區(qū)分。該方法快速有效、準(zhǔn)確度高，適用于茶葉品質(zhì)鑒定、真假識別、產(chǎn)地溯源等方面的研究，也為其他產(chǎn)品的相關(guān)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890-5975型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)；手持固相微萃取器，配50/30 μm CAR/DVB/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取頭(美國，Supelco公司)；PC-420D恒溫數(shù)顯磁力攪拌器(美國，CORNING公司)。

正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品(C8～C32，美國SUPELCO公司)；癸酸乙酯(≥98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

24份西湖龍井茶樣品采自杭州西湖龍井核心區(qū)，15份疑似龍井樣品分別采自紹興、南通、蘇州等地茶葉批發(fā)市場。樣品經(jīng)粉碎后過20目篩，密封保存，待測。樣品信息見表1。

表1 龍井茶樣品信息

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1GC-MS分析條件GC條件：進(jìn)樣口溫度230 ℃；柱溫程序：首先以50 ℃保持5 min，以3 ℃/min的速率升溫至125 ℃，保持3 min，再以2 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持3 min，再以15 ℃/min的速率升溫至250 ℃，保持8 min。載氣為高純氦氣(純度99.999%)：柱流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。MS條件：電子電離源(EI)；離子化能量為70 eV；離子源溫度為200 ℃；四極桿溫度為150 ℃；接口溫度為280 ℃；質(zhì)譜掃描范圍為35～450 amu。

1.3.2SPME操作方法準(zhǔn)確稱取1.0 g經(jīng)粉碎后茶葉樣品，置于15 mL的頂空瓶中，加入磁子以及20 μL 10 mg/L癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入10 mL沸水，密封，60 ℃水浴下磁力攪拌萃取，再將已經(jīng)老化的CAR/DVB/PDMS萃取頭穿透密封墊插入頂空瓶內(nèi)茶湯上方，固定好SPME手柄，小心推出纖維頭開始萃取，60 min后取出，然后插入氣相色譜進(jìn)樣口，在230 ℃下熱解吸5 min。并設(shè)置空白對照試驗(yàn)(不加入茶葉樣品)，每個樣品重復(fù)測定2次。

1.3.3定性與定量分析方法定性：(1)組分峰與NIST12.L譜庫中標(biāo)準(zhǔn)化合物的匹配度；(2)化合物的保留時間；(3)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道的香氣成分保留指數(shù)。定量：依據(jù)面積歸一法進(jìn)行定量。質(zhì)量控制：加入癸酸乙酯對整個萃取和檢測過程進(jìn)行監(jiān)控，保證每個樣品圖中癸酸乙酯峰的保留時間變化率不超過1.5%，且峰面積變化率不超過10%。

1.3.5主成分分析將各茶葉組分信息進(jìn)行處理，并輸入SIMCA-P軟件，進(jìn)行主成分分析(PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1萃取涂層的優(yōu)化選取上述3種萃取頭對龍井茶揮發(fā)性成分分別進(jìn)行萃取。結(jié)果表明，PDMS涂層萃取效果最差，由于該涂層主要適用于小分子非極性揮發(fā)性化合物；而PDMS/DVB涂層適用于極性揮發(fā)性物質(zhì)的萃取，萃取效果較好。CAR/DVB/PDMS涂層結(jié)合了上述兩種萃取頭的特點(diǎn)，具有更好的萃取效果，因此，選擇CAR/DVB/PDMS涂層作為龍井茶香氣成分的萃取材料。

2.1.2萃取溫度的優(yōu)化選取在溫度40～80 ℃下進(jìn)行萃取。結(jié)果表明，隨著萃取溫度升高，峰數(shù)量和峰面積均逐漸增加，當(dāng)萃取溫度升高至60 ℃時峰數(shù)量和峰面積均達(dá)到最大，但隨著溫度進(jìn)一步升高，解吸速率也增加，總峰面積則開始降低，因此選擇60 ℃作為萃取溫度(圖1)。

圖1 萃取溫度對峰數(shù)量(左)和峰面積(右)的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on peak amount(left) and area(right) of aroma components

2.1.3萃取時間的優(yōu)化選取了萃取時間為20～80 min進(jìn)行萃取。結(jié)果表明，隨著萃取時間延長，峰數(shù)量和峰面積均逐漸變大，當(dāng)萃取時間達(dá)到60 min后峰面積變化不大，因此選擇60 min作為萃取時間。

2.1.4解吸時間的優(yōu)化萃取完成后將萃取頭分別解吸1～9 min。結(jié)果表明，解吸時間為5 min時，揮發(fā)性化合物的的峰面積達(dá)到最大，繼續(xù)增加解吸時間，峰面積變化不大且化合物峰形變差。因此選擇5 min 作為解吸時間。

2.2 茶葉揮發(fā)性成分的測定

圖2 龍井茶香氣成分的總離子流(TIC)色譜圖Fig.2 TIC chromatogram of Longjing tea

利用優(yōu)化的萃取條件分別對樣品進(jìn)行萃取，再經(jīng)GC-MS檢測龍井茶中各種揮發(fā)性成分，龍井茶香氣成分總離子流色譜圖如圖2所示。由分析結(jié)果可知，HS-SPME能有效地萃取茶葉中的揮發(fā)性成分，龍井茶樣品的香氣成分十分復(fù)雜，且相對含量差異較大，主要包括烯烴類、醇類、醛類、酮類、酚類、烷烴類、芳香烴類和雜環(huán)類化合物等。

從24份核心區(qū)的龍井茶中獲得了200余種揮發(fā)性化合物，經(jīng)篩選得到26種共有組分：檸檬烯、α-柏樹烯、α-蒎烯、δ-杜松烯、芳樟醇氧化物-Ⅰ、芳樟醇、芳樟醇氧化物-Ⅱ、α-松油醇、香葉醇、1-辛烯-3-醇、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、十二烷、十四烷、水楊酸甲酯、二甲基丁酸葉醇酯、順-3-己烯醇-丁酸酯、順-3-己烯醇-己酸酯、N-乙基-2-醛基吡咯、萘、樟腦、吲哚、β-紫羅酮、2-氨基-3,5-二氫-4H-咪唑-4-酮、2,6-二叔二丁基對甲酚、甲氧基苯基肟。

龍井茶共有香氣成分分析結(jié)果見表2，從表2可以得出，龍井茶主要香氣成分為醇類、酯類、雜環(huán)類化合物。芳樟醇在所有組分中含量最高，為5.12%～16.87%。順-3-己烯醇-己酸酯、順-3-己烯醇-丁酸酯、順-3-己烯醇-乙酸酯為酯類化合物中主要呈香物質(zhì)，含量相對較高。另外，含量較高的有帶有紫羅蘭香氣的β-紫羅酮、1-辛烯-3-醇和甲氧基苯基肟。此外，如檸檬烯(0.08%～0.56%)、α-雪松烯(0.40%～3.20%)、α-蒎烯(0.06%～0.14%)含量相對較少，但含量少的物質(zhì)未必對其香氣的貢獻(xiàn)一定小，任何香氣都是由不同組成和含量的化合物及其相互間作用共同體現(xiàn)[6,14]。

表2 龍井茶香氣組分分析結(jié)果

(續(xù)表2)

No.CompoundID methodaRIexpRIrefRelative content(%)8EpoxylinalolMS,RI1 1811 183[18]0.50-1.609NaphthaleneMS,RI1 1871 187[7]0.15-0.8710Butanoic acid,3-hexenyl ester,(Z)MS,RI1 1901 188[17]2.02-5.56116-CamphanoneMS,RI1 1901 093[7]0.67-2.7512α-TerpineolMS,RI1 1931 192[15-16]0.20-0.8313DodecaneMS1 2001 2000.36-3.8414Methyl salicylateMS,RI1 2001 194[17]0.54-2.0915DecanalMS,RI1 2081 207[14,16]0.11-0.3516β-CyclocitralMS,RI1 2251 223[16]1.45-4.9417(Z)-3-Hexenyl-2-methylbutyrateMS1 240-1.15-3.8718(E)-GeraniolMS,RI1 2721 276[14]1.56-4.12194H-Imidazol-4-one,2-amino-1,5-dihydro-MS1 279-0.67-1.9720IndoleMS,RI1 2981 295[17]0.56-1.5621Hexanoic acid,3-hexenyl ester,(Z)MS,RI1 3821 381[17]3.83-12.5622TetradecaneMS1 4001 4000.27-0.9723α-CedreneMS,RI1 4091 411[16-17]0.40-3.2024β-IoneneMS,RI1 4831 482[17]0.96-3.8925Butylated HydroxytolueneMS1 508-0.76-2.6526δ-CadineneMS,RI1 5131 513[17]0.80-4.56

* ID method,Identification method.MS,identification by comparison with spectra library in NIST 12.RI,retention indices as determined through HP-5MS column using the homologous series ofn-alkanes.RIexp,Experimental retention indices.RIref,Referential retention indices through those reported in the literatures.

2.3 揮發(fā)性成分主成分分析

以篩選得到26種共有組分為指標(biāo)，將西湖核心區(qū)的24份龍井樣品與蘇州、南通、紹興采集的15份疑似龍井樣品分析結(jié)果進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3所示，39份茶葉樣品在第一維主成分中可以分為兩類，其中以西湖核心區(qū)的24份龍井樣品為一類，而以南通、紹興、蘇州采集的樣品為另一類，結(jié)果表明能夠?qū)⑵溥M(jìn)行區(qū)分，說明兩個地區(qū)的樣品來源存在差異。并且南通、紹興、蘇州采集的樣品揮發(fā)性組分比較相似，可能因?yàn)闃悠穪碓匆恢?。后續(xù)研究將繼續(xù)增加樣品數(shù)量進(jìn)一步區(qū)分。

圖3 不同區(qū)域樣品的主成分得分散點(diǎn)圖Fig.3 Principal component scatter diagram form different samples

3 結(jié)論

本研究采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜分析了龍井茶葉中的揮發(fā)性成分，由分析結(jié)果可知龍井樣品的香氣成分十分復(fù)雜，且相對含量差異較大，主要包括烯烴類、醇類、醛類、酮類、酚類、烷烴類、芳香烴類和雜環(huán)類化合物等，經(jīng)篩選得到26種共有組分。并采用主成分分析法對西湖核心區(qū)龍井茶和疑似龍井茶樣品進(jìn)行了有效區(qū)分。下一步將圍繞不同產(chǎn)地區(qū)域、不同保存條件和摻偽茶葉開展香氣成分的指紋研究，結(jié)合各種化學(xué)計量學(xué)方法，根據(jù)主成分分析結(jié)果構(gòu)建香氣品質(zhì)的預(yù)測模型，為茶葉品質(zhì)鑒定、真假識別、產(chǎn)地溯源等相關(guān)研究提供支撐。

致謝：樣品采集得到了中國農(nóng)科院茶葉所石元值博士的大力支持，在此表示衷心感謝！