張 婧, 萬慧慧, 張 華

(大連理工大學(xué)化工與環(huán)境生命學(xué)部化學(xué)分析測試中心，遼寧大連 116024)

植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant Growth Regulators,PGRs)是一種人工合成的、具有與天然植物激素同等效能，甚至更為有效、更為優(yōu)越效能的活性物質(zhì)[1]。氯吡脲屬于植物生長促進(jìn)劑。它的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂、分化和擴(kuò)大。然而近些年來，由于植物生長調(diào)節(jié)劑使用不當(dāng)引起的食品安全問題逐漸增多，植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)作物中的殘留可通過食物鏈進(jìn)入人體，輕者造成腹瀉等疾病，重者使人體免疫力下降，骨骼疏松，甚至有致畸、致癌現(xiàn)象[2]。氯吡脲可能會對人體帶來潛在的危害，因此，歐盟、美國、日本等國對其殘留量作出了嚴(yán)格限定[3]。目前，已報道的氯吡脲的檢測方法主要有氣相色譜法[4]、液相色譜法[5]以及液-質(zhì)聯(lián)用法[3,6 - 8]。黃何何等人[6]以QuEChERS法為前樣品處理方法，結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對水果中的植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了定量檢測。張燕等人[8]利用Florisil分散固相萃取-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定了水果中的氯吡脲含量。徐永等人[9]采用固相萃取結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用方法測定了水果中的多效唑、氯吡脲以及咪鮮胺的殘留量。

基質(zhì)分散固相萃取(MSPD)通過混勻并研磨分散劑材料和果蔬樣品，使果蔬細(xì)胞破碎而達(dá)到均質(zhì)的效果，待測樣品通過很好地分散到固相萃取材料表面，從而達(dá)到良好的分散提取效果[14]。而且整個過程中有機(jī)試劑的用量很少，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。MSPD已經(jīng)被用于水果、蔬菜的農(nóng)藥殘留檢測[15]。本實驗通過紅薯樣品與C18HC分散劑材料研磨進(jìn)行分散提取，建立了MSPD-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測定紅薯中的氯吡脲含量的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ QUANTUM ULTRA液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國，Thermo scientific公司)，配有電噴霧電離源(ESI源)以及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；真空抽濾器(河南省予華儀器有限公司)；超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；漩渦混合器(江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國，Millipore公司)。

C18HC、硅膠(北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)；氯吡脲(TCI，98%)；甲醇(德國默克公司)；尼龍注射器濾器(北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)；SPE篩板(北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)；水膜(0.22 μm，13 mm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；甲酸銨(美國西格瑪奧德里奇公司)；甲酸(北京迪馬科技有限公司),溶劑均為色譜純。

1.2 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.0108 g氯吡脲于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻線，配制成濃度108 μg/mL的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)貯備液。避光保存于4 ℃冰箱。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取切碎后的紅薯樣品0.50 g，置于瑪瑙研缽中研碎以達(dá)到均質(zhì)的目的，然后加入10 μL 40 μg/mL的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液后，再加入2.00 g的C18HC吸附材料，研磨均勻后裝入固相萃取小柱，用10 mL的甲醇進(jìn)行洗脫。洗脫液于40 ℃水浴條件下氮氣吹干，然后用1 mL的甲醇進(jìn)行超聲重溶，過0.22 μm水膜，4 000 r/min離心15 min，取上清液，進(jìn)行液/質(zhì)檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18柱(150×2.1 mm,5 μm)，保護(hù)柱：Thermo HYPERSIL GOLD C18柱(10× 2.1 mm,5 μm)。流動相：甲醇(A)/ 0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨(B)。線性梯度洗脫程序：0～5.0 min，10%A;5.01～7 min，10%～90%A;7.01～13.0 min，90%A;13.01～14 min，90%～10%A;14.01～25.0 min，10%A。流速：200 μL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式；離子掃描模式：正離子模式；電噴霧電壓：3 kV；鞘氣(N2)壓力：35；輔助氣(N2)壓力：10；碰撞氣：Ar；碰撞能量：30 eV；離子源溫度：250 ℃；毛細(xì)管溫度：350 ℃；掃描時間：0.15 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 氯吡脲的LC-MS/MS色譜圖Fig.1 The LC-MS/MS chromatogram of forchlorfenuron

將配好的質(zhì)量濃度為108 μg/mL的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，在電噴霧離子源下分別進(jìn)行正離子模式全掃描，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)使其母離子的響應(yīng)最大化。然后通過優(yōu)化碰撞能量(CE)使得子離子的響應(yīng)最大化，最終選擇兩對離子對及相應(yīng)的優(yōu)化參數(shù)作為最終的質(zhì)譜采集參數(shù)。定量離子對為248.0/129.0，相應(yīng)的碰撞能量為14 eV，定性離子對為248.0/93.2，相應(yīng)的碰撞能量為30 eV。

采用串聯(lián)質(zhì)譜在正離子掃描方式下通過選擇反應(yīng)模式定量分析，以質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)為采集參數(shù)，采用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(150×2.1 mm,5 μm)對氯吡脲進(jìn)行分離，以甲醇(A)/ 0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨(B)作為流動相，色譜圖見圖1。從圖中可以看出C18柱對氯吡脲的保留較好，且峰形對稱。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

2.3 穩(wěn)定性實驗

用水和甲醇稀釋108 μg/mL的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，配制成溶劑分別為5%、50%和100%甲醇氯吡脲貯備溶液，連續(xù)測定5 d，結(jié)果表明室溫條件下，5%、50%和100%甲醇不同溶劑條件下氯吡脲貯備液隨著放置時間的增長，其含量都在不斷減少，總體趨勢氯吡脲都不穩(wěn)定。氯吡脲置于溶劑為100%甲醇中的穩(wěn)定性較好，5%甲醇作為溶劑次之，50%甲醇中穩(wěn)定性最差。同時將溶劑為100%甲醇的氯吡脲貯備液置于4 ℃冰箱的穩(wěn)定性好。為了實驗的準(zhǔn)確性，實驗過程中所用的貯備溶液均置于4 ℃冰箱中保存，標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)制。

2.4 吸附劑材料與分散比例優(yōu)化

分別考察了C18HC和硅膠兩種分散劑材料，按照1.3樣品前處理方法進(jìn)行操作， 與硅膠分散劑材料相比C18HC作為分散劑材料洗脫得到的氯吡脲含量更高，結(jié)果如圖2所示。所以本實驗最終選擇C18HC為分散吸附材料。

比較測試了樣品與分散劑質(zhì)量的比例對實驗的影響，按照1.3樣品前處理方法進(jìn)行操作。檢測后以樣品與分散劑的不同比例為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制成條形統(tǒng)計圖，如圖3所示，當(dāng)比例為1∶4時，洗脫得到的氯吡脲的量最多，選擇分散劑比例為1∶4。

圖2 同吸附劑材料的選擇Fig.2 The choice of different dispersant materials

圖3 紅薯與分散劑比例優(yōu)化Fig.3 The optimization of the ratio between batatas and dispersant material

圖4 洗脫體積優(yōu)化Fig.4 The optimization of elution volume

2.5 最佳洗脫體積的選擇

準(zhǔn)確稱取切碎后的紅薯樣品約0.50 g，置于瑪瑙研缽中搗碎，加入10 μL的混標(biāo)，再加入2.00 g的吸附材料研磨均勻后，裝入固相萃取小柱，依次用3、2、2、2、2、2 mL甲醇進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，于40 ℃水浴條件下氮氣吹干，依次用500 μL的甲醇進(jìn)行超聲重溶，過0.22 μm水膜，膜濾后4 000 r/min離心15 min，取20 μL上清液進(jìn)液/質(zhì)檢測。結(jié)果如圖4。實驗選擇13 mL甲醇進(jìn)行洗脫。

2.6 線性關(guān)系與檢測限

采用紅薯空白基質(zhì)配制2.63～675.00 ng/mL范圍內(nèi)7個濃度的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明在2.63～675.00 ng/mL內(nèi)氯吡脲線性關(guān)系良好，線性方程為：y=10 844.9+375.14x，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9995。以信噪比(S/N)≥10確定定量限，定量檢測限為0.66 ng/mL。

2.7 回收率

按照1.3樣品前處理操作，在氯吡脲的線性范圍內(nèi)進(jìn)行10、25、50 ng/g三個濃度添加水平回收實驗，每個水平重復(fù)3次。結(jié)果表明，氯吡脲的回收率在74.2%～131.8%之間，RSD小于13%。

3 結(jié)論

本文將MSPD前處理技術(shù)與HPLC-MS/MS技術(shù)結(jié)合，建立了檢測紅薯中的氯吡脲的分析方法。實驗證明MSPD技術(shù)可以很好地提取紅薯中氯吡脲，同時HPLC-MS/MS對痕量植物生長調(diào)節(jié)劑表現(xiàn)出較高的靈敏度和重復(fù)性。該方法簡便、可操作性強(qiáng)、回收率高，適用于紅薯中痕量氯吡脲的檢測。